JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE 1 Przykład walidacji procedury analitycznej Piotr KONIECZKA Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. G. Narutowicza 11/1 80-33 GDAŃSK e-mail: kaczor@chem.pg.gda.pl piotr.konieczka@pg.gda.pl System jakości wyniku analitycznego MIARODAJNY WYNIK ANALITYCZNY NIEPEWNOŚĆ SPÓJNOŚĆ WYMAGANIA WALIDACJA PROCEDURY ANALITYCZNEJ MATERIAŁY ODNIESIENIA BADANIA MIĘDZYLABO- RATORYJNE NARZĘDZIA 1
3 DEFINICJA walidacja psych. proces ustalania stopnia odpowiedniości, trafności, celowości testu albo ważności, dokładności narzędzia pomiarowego. Etym. - śrdw. łac. validatus p.p. od validare 'zatwierdzać' z validus 'skuteczny, ważny' łac. 'silny' od valēre Władysław Kopaliński Słownik wyrazów obcych 4 Walidacja metody (ang. method validation) proces oceny metody (lub procedury) analitycznej prowadzony w celu zapewnienia zgodności ze stawianymi tej metodzie wymogami, definiujący tęę metodę oraz pozwalający określić jej przydatność. Można więc mówić o: Ocenie metody Zgodności metody ze stawianymi jej wymogami Definicji metody Przydatności metody
Proces walidacji powinien być przeprowadzony gdy: 5 opracowywana jest nowa procedura analityczna, prowadzone są próby rozszerzenia zakresu stosowalności znanej procedury analitycznej np. do oznaczania danego analitu ale w innej matrycy, przeprowadzona kontrola jakości daje podstawę do wniosku, że występuje zmienność parametrów walidacyjnych w czasie, Proces walidacji powinien być przeprowadzony gdy: 6 dana procedura analityczna ma być wykorzystywana w innym laboratorium, zostanie wykorzystana inna aparatura kontrolnopomiarowa, badania będą przeprowadzone przez innego analityka, przeprowadza się porównanie nowej procedury analitycznej ze znaną procedurą standardową, 3
Oprócz wyznaczenia parametrów walidacyjnych, przed przystąpieniem do samego procesu walidacji należy określić takie podstawowe cechy procedury analitycznej jak: 7 rodzaj oznaczanego składnika, poziomstężeń, zakresstężeń analitu, rodzaj matrycy, obecność substancji przeszkadzających (interferentów) wraz z określeniem konieczności ich oznaczenia, cd: 8 istnienie odgórnych regulacji i wymogów, którym powinna sprostać procedura analityczna, rodzaj oczekiwanej informacji ilościowa czy jakościowa, wymagana wartość granicy wykrywalności i oznaczalności, oczekiwana i wymagana dokładność (precyzja i poprawność) procedury, 4
cd: 9 wymagana wrażliwość (odporność) procedury, wymagana aparatura czy oznaczenia z wykorzystaniem danej procedury mają być przeprowadzone w oparciu a ściśle zdefiniowany instrument, czy też może być przeprowadzana w oparciu o aparaturę tego samego typu, możliwość zastosowania walidowanej procedury w innym laboratorium, Zestawienie parametrów procedury analitycznej podlegających procesowi walidacji zalecanych przez ICH i USP 10 Parametr ICH USP - powtarzalność + + Precyzja - precyzja pośrednia + - odtwarzalność + Dokładność/Poprawność + + Granica wykrywalności + + Granica oznaczalności + + Specyficzność/selektywność + + Liniowość + + Zakres pomiarowy + + Odporność (ang.robustness) + Elastyczność/tolerancyjność + (ang.ruggedness) ICH The International Conference on Harmonization USP The United States Pharmacopoeia 5
11 Im większa jest liczba parametrów walidacyjnych, tym więcej czasu potrzeba na przeprowadzenie procesu walidacji. Im bardziej restrykcyjny charakter mają przyjęte wartości graniczne (oczekiwane), tym częściej należy sprawdzać, kalibrować, czy wręcz rewalidować daną procedurę analityczną. Nie zawsze itij istnieje konieczność przeprowadzania całegoł procesu walidacji procedury analitycznej. Należy wówczas określić, który z parametrów powinien być włączony do procesu walidacji. 1 Proces walidacji procedury analitycznej może być przeprowadzony właściwie w dowolnej kolejności (biorąc pod uwagę kolejność określania badanych parametrów), jednak najbardziej logicznym wydaje się jej przeprowadzenie zgodnie ze schematem: 6
13 Proces walidacji procedury analitycznej powinien być uwieńczony poprzez sporządzenie raportu końcowego zawierającego: przedmiot i przeznaczenie procedury analitycznej (zakres jej stosowalności, rodzaj), podstawy metrologiczne, rodzaj analitu(ów) i skład matrycy, spis wszystkich wykorzystywanych odczynników, wzorców, materiałów odniesienia wraz z ich dokładną specyfikacją (czystość, jakość, producent, w przypadku syntezy w laboratorium dokładny opis tej syntezy), cd: 14 opis procedur służących do sprawdzania czystości stosowanych substancji i jakości wykorzystywanych wzorców, konieczne środki ostrożności, plan opisujący sposób przeniesienia procedury z warunków laboratoryjnych do pomiarów rutynowych, parametry procedury analitycznej, spis parametrów krytycznych tzn. tych, których niewielkie wahania mogą w sposób znaczący wpływać na wynik końcowy oznaczenia parametry wynikające z określenia odporności procedury analitycznej, 7
cd: 15 wykaz wszelkiego rodzaju sprzętu laboratoryjnego wraz z ich cechami charakterystycznymi (wymiary, klasa dokładności itp.), schematy blokowe w przypadku skomplikowanych zestawów aparaturowych, szczegółowy opis warunków przeprowadzenia pomiarów z wykorzystaniem danej procedury analitycznej, opis procedury statystycznej (na etapie obróbki zbiorów wyników) wraz z wykazem równań ń i przeprowadzonych obliczeń, opis procedury kontroli jakości wyników (w przypadku analiz rutynowych), cd: 16 odpowiednie rysunki i wykresy np. chromatogramy, krzywe kalibracyjne, zgodność wyznaczonych y parametrów procedury z założonymi wartościami granicznymi, wartość niepewności pomiaru analitycznego, kryteria, które należy spełnić w procesie rewalidacji, dane osoby, przeprowadzającej proces walidacji, spis wykorzystywanej literatury, podsumowanie i wnioski, potwierdzenie i podpis osoby odpowiedzialnej za sprawdzenie i zatwierdzenie procesu walidacji. 8
Opracowano metodę oznaczania zawartości kadmu w próbkach kapusty. Próbki kapusty przygotowywano w następujący sposób: 1.Liofilizacja.Mineralizacja wspomagana promieniowaniem mikrofalowym z wykorzystaniem stężonego kwasu azotowego V 3.Otrzymany mineralizat rozcieńczano do objętości końcowej 5 cm 3 17 18 Oznaczenie końcowe przeprowadzono z wykorzystaniem techniki GF-AAS, stosując aparat SavantAA Z firmy GBC. 9
PARAMETRY WALIDACYJNE 19 - Precyzja -powtarzalność - precyzja pośredniaś -odtwarzalność -Dokładność ipoprawność - Granica wykrywalności i oznaczalności - Selektywność - Liniowość izakrespomiarowy - Tolerancyjność i odporność -Niepewność 0 Selektywny pomiar absorbancji przy charakterystycznej długości fali 8,8 nm i z zastosowaniem korekcji tła -wzdłużny efektu Zeemana 10
1 Cd, ppb absorbancja 0,4 0,13 0,4 0,17 0,4 0,141 0,8 0,68 0,8 0,71 0,8 0,58 1, 0,403 1, 0,411 1, 0,408 1,6 0,51 16 1,6 0,54 1,6 0,538,0 0,678,0 0,689,0 0,69 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,00 0,100 y = 0,3435x - 0,0069 r = 0,999 0,000 0,0 0,5 1,0 1,5,0,5 11
3 Cd, ppb absorbancja s = 0,0071 (sygnał!!!) 0,4 0,13 0,4 0,17 0,4 0,141 s 0,8 0,68 LOD 3, 3 y = 0,3435x - 0,0069 08 0,8 0,71 b 0,8 0,58 1, 0,403 1, 0,411 LOD = 0,068 ppb 1, 0,408 1,6 0,51 LOQ 3 LOD 1,6 0,54 1,6 0,538,0 0,678,0 0,689,0 0,69 LOQ = 0,0 ppb zakres pomiarowy: 0,0,0 ppb 4 Cd, ppb absorbancja 0,4 0,13 0,4 0,17 0,4 0,141 0,8 0,68 08 0,8 0,71 0,8 0,58 1, 0,403 1, 0,411 1, 0,408 1,6 0,51 1,6 0,54 1,6 0,538,0 0,678,0 0,689,0 0,69 s=0,0071, CV= 1,8% s=0,0068, 0068 CV= 0,85% s=0,0040, CV= 0,34% s=0,011, CV= 0,70% s=0,0074, CV= 0,37% k 1 CV CV i CV = 0,96% k i 1 1
5 Cd, mg/kg 1,84 1,81 1,75 1,60 1,66 średnia: 1,73 mg/kg s: 0,10 mg/kg u: 0,045 mg/kg u s n 6,0 1,8 1,6 1,4 1, 1,0 0,8 0,6 0,4 0, 0,0 cert ozn cert: 1,66 ± 0,07 mg/kg ozn: 1,73 ± 0,090 mg/kg 13
7 R = 104,% R x x ozn CRM 100% U = 6,7% U k u ( x x ozn ozn ) u x ( x CRM CRM ) Poprawność = Poprawność: = 104, ± 6,7% R U 8 Oznaczenia dla próbki rzeczywistej Cd, mg/kg 3,176 3,74 3,076 średnia = 3,175 mg/kg; s=0,099 mg/kg, CV= 3,1% masa próbki 050g 0,50 objętość mineralizatu 5 cm 3 rozcieńczenie: 1 5 (odpowiednie ph) autorozcieńczenie przyrząd 0,067 wynik odczytany z krzywej 0,846 ppb 14
Niepewność U k u kal u powt u popr u kal =,0 % u powt = 1,8 % u popr = 3, % k = U = 8,4 % u s u powt n popr U popr R / k WYNIK = 3,18 ± 0,7 [mg/kg] Poprawność: = 104, ± 6,7% 30 15