RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2075007 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 03.05.2004 08170222.7 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 22.05.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/21 EP 2075007 B1 (54) Tytuł wynalazku: Leczenie choroby Alzheimera (30) Pierwszeństwo: 08.05.2003 ES 200301054 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 01.07.2009 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/27 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.09.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/09 (73) Uprawniony z patentu: Araclón Biotech, S. L., Zaragoza, ES PL/EP 2075007 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: MANUEL SARASA BARRIO, Zaragoza, ES (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Malewska EWA MALEWSKA & PARTNERS skr. poczt. 613 00-950 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Opis [0001] Obecny wynalazek zapewnia środki do leczenia i/lub do zapobiegania chorobom związanym z obecnością złogów amyloidu, do których zalicza się chorobę Alzheimera. Stan techniki [0002] Znane są pewne fakty dotyczące zjawisk biochemicznych i metabolicznych związanych z obecnością choroby Alzheimera (AD). Dwoma strukturalnymi i histopatologicznymi zmianami, które obserwuje się w mózgach chorych na AD, są splątki neurofibrylarne (NFT) oraz złogi amyloidu. Wewnątrz-neuronalne splątki neurofibrylarne występują także w innych chorobach neurodegeneracyjnych, lecz obecność złogów amyloidu zarówno w przestrzeniach wewnątrz-neuronalnych (blaszki neurytyczne), jak i blisko małych (mikro) naczyń krwionośnych (blaszki naczyniowe) zdaje się być charakterystyczna dla AD. Spośród nich blaszki neurytyczne wydają się najbardziej powszechne (Price, D.L., i wsp., Drug Development Research (1985) 5:59-68). [0003] Głównym składnikiem tych blaszek amyloidowych jest peptyd o 40-42 aminokwasach, określany terminem peptyd amyloidowy Aβ4. [0004] Ten peptyd amyloidowy Aβ4 jest polipeptydem, którego źródłem jest proteoliza membranowych glikoprotein określanych terminem białka prekursorowe peptydu amyloidowego Aβ4 (βapp). Te białka, będące prekursorami peptydu amyloidowego, zbudowane są z 695 do 770 aminokwasów, z których wszystkie są kodowane przez ten sam gen. [0005] Zidentyfikowano dwa główne warianty peptydu amyloidowego Aβ4, peptyd Aβ40 oraz Aβ42, obejmujące odpowiednio 40 i 42 aminokwasy, które są tkankach odmiennie rozproszone zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Wskazany wariant o 42 aminokwasach jest formą dominującą w blaszkach amyloidowych zlokalizowanych w mózgach pacjentów z AD. [0006] Do chwili obecnej, proponowane były różnorodne możliwe rozwiązania dotyczące możliwej szczepionki przeciw AD. [0007] W EP526511 proponuje się podawanie homeopatycznych dawek Aβ pacjentom z nie w pełni rozwiniętą chorobą Alzheimera. Jednakże, na skutek wielkości stosowanych dawek, poziomy cyrkulującego endogennego Aβ w osoczu nie zmieniają się, a zatem nie należy spodziewać się jakiejkolwiek korzyści terapeutycznej. 2
[0008] Schenk et al., (Nature, 1999; 400: 173-177) opisali szczepienie transgenicznych myszy PDAPP z nadekspresją ludzkiego zmutowanego APP, przy użyciu Aβ42, zapobiegając w ten sposób tworzeniu blaszek amyloidowych, dystrofii neurytów oraz astroglejozie. [0009] W WO9927944 (Schenk D.), opisano leczenie AD polegające na podawaniu pacjentom Aβ42. [0010] Badania kliniczne III Fazy na 360 pacjentach ze zdiagnozowaną średnią do umiarkowanej AD w 4 europejskich krajach i w Stanach Zjednoczonych Am., w których peptyd amyloidowy Aβ42 stosowano jako antygen, zostały przerwane po doniesieniach o zapaleniu mózgu u niektórych pacjentów (Scrip Daily Online, 25 Feb 2002, S007455320, The Scientist 16 [7]: 22, 1. 04. 2002 r.). [0011] Kwestia stosowania endogennego białka w charakterze szczepionki (lub białka naturalnie występującego u zwierzęcia poddawanego szczepieniu), tak jak to jest w przypadku peptydu Aβ42, gdzie odpowiedź organizmu polega na wytwarzaniu przeciwciał przeciw Aβ42 oraz przeciw mniejszym frakcjom, które mogą także mieć dotychczas niepoznane funkcje fizjologiczne, wiąże się z możliwymi problemami, spośród których można wymienić możliwość rozwinięcia chorób autoimmunologicznych w wyniku generowania przeciwciał przeciw endogennej proteinie, trudności w generowaniu odpowiedzi immunologicznej spowodowane niemożnością rozpoznania endogennych antygenów przez układ opornościowy, a także możliwość rozwinięcia ostrej odpowiedzi zapalnej. [0012] Celem obecnego wynalazku jest terapia choroby Alzheimera i innych chorób amyloidowych w wyniku podawania peptydu, C-końcowej części Aβ, skoniugowanego z białkiem, którym w korzystnym wykonaniu obecnego wynalazku jest hemocyjanina morskich ślimaków gatunku Diodora apertura (KLH = keyhole limpet hemocyanin). Objaśnienie obecnego wynalazku [0013] Obecny wynalazek zdefiniowany jest w zastrzeżeniach. [0014] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania peptydu skoniugowanego z białkiem, który działa jako immunogen, do wytwarzania przeciwciał zdolnych rozpoznać dowolny spośród dominujących wariantów peptydu beta amyloidowego Aβ40 oraz Aβ42, a także spowodować redukcję akumulacji blaszek amyloidowych, do otrzymywania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby wybranej z grupy 3
obejmującej cukrzycę typu II, chorobę kłusową (ang. scrapie), gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), chorobę Creutzfeldta-Jakoba, chorobę Alzheimera oraz rodzinną angiopatię amyloidową (CAA), znamiennego tym, że wskazanym peptydem jest peptyd o sekwencji SEQ ID NO 3. Obecny wynalazek jest także nakierowany na zastosowanie przeciwciała lub aktywnego fragmentu bądź pochodnej przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje dowolny spośród dominujących wariantów peptydu beta amyloidowego Aβ40 oraz Aβ42, a także powoduje redukcję akumulacji blaszek amyloidowych, do wytwarzania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby wybranej z grupy obejmującej cukrzycę typu II, chorobę kłusową, gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), chorobę Creutzfeldta-Jakoba, chorobę Alzheimera oraz rodzinną angiopatię amyloidową (CAA), gdzie to przeciwciało lub aktywny fragment, bądź pochodna wskazanego przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje dowolny spośród dominujących wariantów peptydu Aβ, otrzymywane jest z peptydu o sekwencji SEQ ID NO 3. [0015] Obecny wynalazek dotyczy szczepionki do zapobiegania i/lub leczenia choroby Alzheimera oraz innych pokrewnych chorób amyloidowych. [0016] Zgodnie z korzystnym wykonaniem obecnego wynalazku, zapewniona jest szczepionka do zapobiegania i/lub leczenia choroby Alzheimera oraz innych pokrewnych chorób, która nie posiada wad związanych z wykorzystaniem peptydów, białek lub endogennych immunogenów. [0017] Przykładami innych chorób, cechujących się złogami amyloidu są islandzki dziedziczny syndrom, szpiczak mnogi oraz gąbczaste zapalenie mózgu, w tym choroba Creutzfeldta-Jakoba. [0018] Wywołanie odpowiedzi immunologicznej może być aktywne jak wówczas, kiedy immunogen jest podawany w celu indukcji przeciwciał, które reagują z Aβ w organizmie pacjenta lub bierne jak wówczas, kiedy podawane jest przeciwciało, które samo reaguje z Aβ w organizmie pacjenta. [0019] Na potrzeby obecnego wynalazku, następujące terminy zdefiniowane są jak następuje: [0020] Termin "pokrewne choroby amyloidowe" obejmuje choroby związane z akumulacją amyloidu, która może być ograniczona do jednego organu, z amyloidozą zlokalizowaną lub rozprzestrzeniona na kilka organów z amyloidozą układową. 4
Zlokalizowane formy amyloidozy obejmują lecz nie wyłącznie: cukrzycę typu II, chorobę kłusową, gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), chorobę Creutzfeldta-Jakoba, chorobę Alzheimera, rodzinną angiopatię amyloidową. [0021] Termin "bierna immunizacja" używany jest w odniesieniu do podawania indywidualnemu pacjentowi przeciwciał lub ich fragmentów, z zamiarem nadania odporności temu indywidualnemu pacjentowi. [0022] Poniżej opisano zastosowanie albo peptydu, który działa jako immunogen, albo przeciwciała, do wytwarzania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby cechującej się akumulacją złogów amyloidu. Wskazane metody polegają na indukowaniu odpowiedzi immunologicznej na peptydowy komponent wskazanych złogów amyloidu w organizmie tego pacjenta. Wspomniana indukcja może mieć charakter aktywny w wyniku podawania immunogenu lub bierny w wyniku podawania przeciwciała, aktywnego fragmentu lub pochodnej przeciwciała. [0023] W korzystnym przykładzie realizacji obecnego wynalazku, chorobą tą jest choroba Alzheimera. [0024] Obecnie wytwarzany środek leczniczy może być stosowany zarówno u pacjentów bezobjawowych jak i u tych, którzy wykazują symptomy choroby. [0025] Obecne kompozycje zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw pewnym komponentom blaszek amyloidowych są skuteczne w leczeniu lub zapobieganiu chorobom związanym ze złogami amyloidu. W szczególności, zgodnie z opisanym tu aspektem, możliwe jest zapobieganie postępowi [choroby], złagodzenie (redukcja) symptomów i/lub redukcja procesu tworzenia złogów amyloidu u indywidualnego pacjenta, kiedy temu pacjentowi podawana jest immunostymulacyjna dawka peptydu lub otrzymywanego z niego przeciwciała. [0026] Zgodnie z pewnym aspektem obecnego wynalazku, wskazane przeciwciała otrzymywane są na drodze immunizacji ssaków lub ptaków przy zastosowaniu jako immunogenu peptydu skoniugowanego z białkiem. [0027] Zgodnie z korzystnym wykonaniem obecnego wynalazku, ssakami wykorzystywanymi do immunizacji mogą być przeżuwacze, koniowate, zajęczaki, drapieżne, naczelne lub dowolne inne zwierzęta, które pozwalają na pobranie od nich odpowiedniej ilości surowicy z przeciwciałem. Spośród ptaków wykorzystywanych do immunizacji, można 5
wymienić, nie ograniczając się w żadnym wypadku wyłącznie do tych, między innymi grzebiące (kuraki), blaszkodziobe oraz gołębiowe. [0028] Opisano również zastosowanie peptydu skoniugowanego z białkiem, który działa jako immunogen, do wytwarzania przeciwciał zdolnych specyficznie rozpoznać dowolny spośród dominujących wariantów beta peptydu amyloidowego Aβ40 oraz Aβ42, do otrzymywania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby cechującej się akumulacją złogów amyloidu w mózgu pacjenta. [0029] Zgodnie z najbardziej korzystnym wykonaniem obecnego wynalazku, białkiem stosowanym do skoniugowania ze wskazanym peptydem jest hemocyjanina morskich ślimaków gatunku Diodora apertura białko KLH. [0030] Zgodnie z obecnym wynalazkiem, wskazanym peptydem jest peptyd o sekwencji SEQ ID NO 3. [0031] Opisano również zastosowanie przeciwciała lub aktywnego fragmentu bądź pochodnej przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje dowolny spośród dominujących wariantów beta peptydu amyloidowego Aβ40 oraz Aβ42, do wytwarzania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby cechującej się akumulacją złogów amyloidu w mózgu pacjenta. [0032] Zgodnie z obecnym wynalazkiem, wskazane przeciwciało lub aktywny fragment bądź pochodna wskazanego przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje dowolny spośród dominujących wariantów peptydu Aβ, otrzymywane jest z peptydu o sekwencji SEQ ID NO 3. [0033] Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem, wskazane przeciwciało lub aktywny fragment bądź jego pochodna otrzymywane jest w wyniku immunizacji ssaków lub ptaków peptydem o sekwencji SEQ ID NO 3. [0034] W niniejszym zgłoszeniu, stosowane są jednoliterowe kody aminokwasów przyjęte w tej dziedzinie nauki, zgodnie z poniższym wykazem: A = C = D = E = F = G = Ala = alanina Cys = cysteina Asp = kwas asparaginowy Glu = kwas glutaminowy Phe = fenyloalanina Gly = glicyna 6
H = His = histydyna I = Ile = izoleucyna K = Lys = lizyna L = Leu = leucyna M = Met = metionina N = Asn = asparagina P = Pro = prolina Q = Gln = glutamina R = Arg = arginina S = Ser = seryna T = Thr = treonina V = Val = walina W = Trp = tryptofan Y = Tyr = tyrozyna [0035] Wskazana sekwencja opisana w obecnym wynalazku i zidentyfikowana jako sekwencja SEQ ID NO 3 odpowiada następującej sekwencji aminokwasów: SEQ ID NO 3: GLMVGGVVIA [0036] Obecnemu przeciwciału otrzymywanemu z powyższego peptydu nadano kod SAR-4, odpowiadający kodowi przedstawionemu poniżej: SEQ ID NO 3 SAR-4 [0037] Informacja dotycząca identyfikacji sekwencji peptydowych, opisanych w obecnym wynalazku, która dołączona jest do obecnej dokumentacji w formacie odczytywanym przez komputer, podana jest w liście sekwencji, przedstawianej wraz z niniejszym dokumentem. Przykłady [0038] Obecny wynalazek został zilustrowany przy pomocy poniższych przykładów. Przykład 1. Generowanie przeciwciał poliklonalnych [0039] Wskazane poliklonalne przeciwciało przeciw wskazanemu peptydowi skoniugowanemu z KLH, który był stosowany jako immunogen, zostało wygenerowane na drodze immunizacji królików nowozelandzkich białych. [0040] Wskazany immunogen wstrzyknięto dwóm królikom, podając każdemu królikowi pięć iniekcji: pierwsza iniekcja śródskórna wskazanego koniugatu peptyd-klh w PBS 7
zemulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda oraz dalsze cztery iniekcje domięśniowe, jako dodatkowe dawki pobudzające w dniach 14, 28, 49 oraz 80, tego samego koniugatu peptyd-klh w PBS, lecz tym razem zemulgowanego w niekompletnym adiuwancie Freunda, z pobraniem krwi w dniu 90, w celu wykrycia obecności przeciwciał. [0041] Po pobraniu krwi, oddzielono surowicę i wstępnie oczyszczono metodą odsalania, a następnie uzyskane przeciwciało oczyszczono metodą powinowactwa stosując matrycę obejmującą 1,5 ml aktywowanej żywicy polimetakrylanowej firmy Merck EMD-Epoxy activated material, do której dodano 5 mg odpowiedniego peptydu. Oczyszczone frakcje zapakowano w 0,1 % BSA (firmy Sigma) i przechowywano w 4 C, a jako krioprotektant można było dodać 20-50% glicerolu. Przykład 2. Analiza Aβ metodą Western-Blot 1. Elektroforeza [0042] Zastosowano metodę prof. Laemmli, opisaną w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998, zmodyfikowaną pod kątem poprawy rozdziału małych peptydów. [0043] Stosowano urządzenie Miniprotean 3 firmy Bio-Rad. [0044] Stosowano 15% żel akrylamidowy zmieszany z następującymi składnikami: ROZTWORY PODSTAWOWE ŻEL DO ROZDZIAŁU (15%) ŻEL BLOKUJĄCY 40% akryloamid 3,75 ml 500 μl Tris 3M, ph=8,45 3,3 ml 250 μl Glicerol 1,05 ml - Woda 1,9 ml 4,2 μl SDS 20% 50 μl 18,6 μl APS 10% 50 μl 25 μl TEMED* 10 μl 5 μl */ TEMED = N,N,N,N -tetrametyloetylenodiamina [0045] Stosowano wyjściowe roztwory podstawowe peptydu Aβ40 oraz 42 o stężeniu 1 mg/ml (rozpuszczonego w PBS). Pobierano konieczną objętość tych roztworów do każdej próbki i rozcieńczano do 20 μl stosując SBL-T (SBL + Tris zasada 2 M). Następnie próbki gotowano przez 5 minut w celu denaturacji peptydów oraz eliminacji ewentualnych proteaz. 8
[0046] Środek kuwety wypełniony był buforem katodowym, a na zewnątrz znajdował się bufor anodowy; skład tych buforów był następujący: Bufor anodowy 24,2 g Tris zasada (0,2 M stężenie końcowe) Rozcieńcz do 1 litra dodając H 2 O Dostosuj ph do wartości 8,9 stosując stężony HCl Przechowuj w 4 C przez okres do 1 miesiąca Bufor katodowy 12,11 g Tris zasada (0,1 M stężenie końcowe) 17,92 g tricyny (0,1 M stężenie końcowe) 1 g SDS (0,1% stężenie końcowe) Rozcieńcz do 1 litra dodając H 2 O Nie reguluj wartości ph Przechowuj w 4 C przez okres do 1 miesiąca [0047] Na koniec, próbki zostały wprowadzone do studni, w ilości: 20 μl/studnię. Przy zastosowaniu wzorców Polypeptide Standard Kaleidoscope produkcji Bio-Rad jako markera, migracja została zapoczątkowana przy niskim napięciu (30 V), a następnie napięcie zostało podwyższone do 100 V, po około 1 godzinnym prowadzeniu elektroforezy. 2. Przeniesienie na membranę [0048] Białka rozdzielone na żelu zostały przeniesione na membranę PVBF metodą elektroblottingu. W stosie nośników do realizacji przeniesienia, umieszczono następujące elementy: [0049] strona czarna - gąbka - 3 papiery Whatmanna (lub bibuły filtracyjne) - żel - - membrana - - 3 papiery Whatmanna - - gąbka - - strona przezroczysta. [0050] Następnie kuwetę napełniono buforem do elektroblottingu: Glicyna 38 nm Tris zasada 50 mm Metanol 40% [0051] Przeniesienie realizowano przez 2 godziny przy 200 ma. Podczas przenoszenia, bufor mieszano stosując mieszadło magnetyczne. 9
3. Inkubacja z przeciwciałami [0052] Wskazane przeciwciało i mleko w proszku rozpuszczono w PBS-T (PBS + 0,5% Tween 20), prowadząc przemywanie także za pomocą PBS-T. [0053] Po przeniesieniu, powierzchnię membrany zablokowano stosując 5% roztwór mleka w proszku przez 1 godzinę przy ciągłym mieszaniu i w temperaturze pokojowej (RT). [0054] Następnie, membranę przemyto 2 x 5 minut w RT. [0055] Potem, poddano ją inkubacji z pierwszorzędowym przeciwciałem (SAR-4) przez 1 godzinę w RT, a na końcu rozcieńczono 1:500 w PBS-T. [0056] Tę membranę przemyto: 3 x 10 minut w RT. Następnie, została poddana inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym: kozim przeciw-króliczym-hrp przez 1 godzinę w RT (1:10.000 we wszystkich przypadkach). [0057] Przemywanie membrany powtórzono jeszcze raz: 3 x 10 minut w RT. 4. Wywoływanie [0058] Po ostatnim przemyciu, membrana poddana została inkubacji z roztworem z zestawu chemoluminescencyjnego, stosując zestaw ECL kit+plus firmy Pharmacia. [0059] Ta membrana została zawinięta w celofan i skierowana na błonę z podwójną emulsją (Hyperfilm MP firmy Amersham), z różnymi czasami ekspozycji od 30 sekund do 2 minut. Przykład 3. Immunohistochemia z przeciwciałami SAR-4 w tkance ludzkiego mózgu [0060] Wycinki tkanki zostały utrwalone w parafinie w następujących krokach: a) utrwalenie w neutralnej formalinie o stężeniu 10% b) odwodnienie w kolejno następujących po sobie etapach, w alkoholu o wzrastającym stężeniu c) przejście przez ksylol i parafinę, ten ostatni etap w piecu o temperaturze 60-62 C. d) przerób bloków parafinowych, które zostały pocięte na grubość 4 mikronów i oprawione na szkiełkach. [0061] Wycinki zostały następnie poddane deparafinizacji poprzez przejście przez następujące roztwory: Ksylol 100% 10 minut 10
Ksylol Etanol Etanol Etanol Etanol Etanol PBS 100% 10 minut 100% 5 minut 100% 5 minut 96% 5 minut 90% 5 minut 70% 5 minut 5 minut x 3 razy Następnie, poddano je obróbce w następujący sposób: a) 96% kwas mrówkowy przez 3 minuty pod dygestorium, z mieszaniem b) Szybkie przemycie wodą c) Przemycie PBS 2 x 5 minut d) Zablokowanie endogennych peroksydaz przez 15 minut w roztworze o składzie 70 ml PBS, 30 ml metanolu oraz 1 ml H 2 O 2 e) Przemycie PBS 3 x 5 minut f) Przemycie PBS-T (Triton lub Tween-20 w stężeniu 0,5% w PBS) 3 x 5 minut g) Zablokowanie niespecyficznego wiązania z surowicą kozią (Normal Goat Serum) rozcieńczoną w stosunku 10:100 w PBS-T, przez dwie godziny h) Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym przez całą noc w 4 C w komorze nawilżania: Sar-4... Rozcieńczenie 1:2000 w PBS i) Przemycie PBS-T 3 x 5 minut j) Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym (kozie anty-królicze) rozcieńczonym w stosunku 1:200 w PBS przez 45 minut k) Przemycie PBS 4 x 5 minut l) Inkubacja z ABC (kompleks awidyna-biotyna) firmy Vector Labs, w rozcieńczeniu 1:100 w PBS-T, przez 45 minut w ciemności, z utrzymywaniem tych warunków aż do zakończenia wywoływania m) Przemycie PBS 3 x 5 minuty n) wywołanie w diaminobenzydynie (DAB) [0062] Czas kontrolowano empirycznie pod mikroskopem stereoskopowym. W tym celu najpierw przeprowadzono przemywanie roztworem Tris-HCl 0,5 M przez 10 minut z jednoczesnym wytrząsaniem, by następnie kontynuować inkubację z substratem 11
diaminobenzydynowym (DAB) rozcieńczonym w Tris-HCl 0,05M, do którego dodano 0,5 μl/ml H 2 O 2 w 4 C. Gdy reakcja dobiegła końca, dokonano trzykrotnego przemycia PBS w 4 C przez 5 minut za każdym razem, a następnie poddano odwodnieniu stosując etanol w stężeniu 70%, 90% i 100% przez 2 minuty za każdym razem, przepuszczono przez ksylol przez 4 minuty, po czym dodatkowo przepuszczono przez ksylol przez 2 minuty, a na koniec zamontowano na szkiełkach Eukitt do obserwacji pod mikroskopem. Lista sekwencji [0063] ILOŚĆ SEKWENCJI: 1 INFORMACJE DOTYCZĄCE SEKWENCJI 1: CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: DŁUGOŚĆ: 10 RODZAJ: aminokwasowa RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd ŹRÓDŁO: synteza chemiczna OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO 3 12
LISTA SEKWENCJI [0064] <110> ARACLON BIOTECH, S.L. <120> Sposób leczenia choroby Alzheimera <130> EP1513.A.2.div2 <160> 4 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna <220> <223> dodatkowe cechy <400> 1 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna <220> <223> dodatkowe cechy <400> 2 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> sztuczna <220> <223> dodatkowe cechy <400> 3 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> sztuczna <220> <223> dodatkowe cechy <400> 4 13
Zastrzeżenia 1. Zastosowanie peptydu skoniugowanego z białkiem, który działa jako immunogen, do wytwarzania przeciwciał, zdolnych rozpoznać dowolny spośród dominujących wariantów peptydu beta amyloidowego Aβ40 oraz Aβ42, a także spowodować redukcję akumulacji blaszek amyloidowych, do otrzymywania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby wybranej z grupy obejmującej cukrzycę typu II, chorobę kłusową (ang. scrapie), gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), chorobę Creutzfeldta-Jakoba, chorobę Alzheimera oraz rodzinną angiopatię amyloidową (CAA), znamienne tym, że tym peptydem jest peptyd o sekwencji SEQ ID NO 3. 2. Zastosowanie według poprzedniego zastrz., znamienne tym, że wskazaną chorobą jest choroba Alzheimera. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wskazaną chorobą jest rodzinna angiopatia amyloidowa. 4. Zastosowanie według poprzedzających zastrz., znamienne tym, że wskazanym białkiem jest białko KLH pochodzące od morskich ślimaków gatunku Diodora apertura (KLH = keyhole limpet hemocyanin). 5. Zastosowanie przeciwciała lub aktywnego fragmentu bądź pochodnej przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje dowolny spośród dominujących wariantów peptydu beta amyloidowego Aβ40 oraz Aβ42, a także powoduje redukcję akumulacji blaszek amyloidowych, do wytwarzania środka leczniczego do zapobiegania i/lub leczenia choroby wybranej z grupy obejmującej cukrzycę typu II, chorobę kłusową, gąbczastą encefalopatię bydła (BSE), chorobę Creutzfeldta-Jakoba, chorobę Alzheimera oraz rodzinną angiopatię amyloidową (CAA), gdzie wskazane przeciwciało lub aktywny fragment bądź pochodna wskazanego przeciwciała, które specyficznie rozpoznaje dowolny spośród dominujących wariantów peptydu Aβ, otrzymywane jest z peptydu o sekwencji SEQ ID NO 3. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wskazaną chorobą jest choroba Alzheimera. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wskazaną chorobą jest rodzinna angiopatia amyloidowa. 8. Zastosowanie według dowolnego spośród zastrz. 5-7, znamienne tym, że wskazane przeciwciało lub aktywny fragment bądź pochodna wskazanego przeciwciała otrzymywane jest w wyniku immunizacji ssaków lub ptaków peptydem o sekwencji SEQ ID NO 3. 14
WCZEŚNIEJSZE PUBLIKACJE WYMIENIONE W OPISIE: Niniejsza lista publikacji przywołanych przez Zgłaszającego przygotowana jest wyłącznie dla wygody czytelników. Nie stanowi ona części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż dołożono wielkiej staranności przy układaniu listy przywołanych publikacji, nie można wykluczyć błędów lub pominięć, a Europejski Urząd Patentowy uchyla się od wszelkiej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe wymienione w opisie: EP 526511 A [0007] WO 9927944 A, Schenk D. [0009] Literatura niepatentowa wymieniona w opisie PRICE, D.L. Drug Development Research, 1985, vol. 5, 59-68 [0002] SCHENK et al. Nature, 1999, vol. 400, 173-177 [0008] Scrip Daily Online, 25 February 2002 [0010] The Scientist, 01 April 2002, vol. 16 (7), 22 [0010] Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1998 [0042] 15