METODY PRZECHOWYWANIA DROBNOUSTROJÓW Wysoka wydajność i powtarzalność wszystkich procesów biotechnologicznych osiągana jest dzięki zachowaniu czystości mikrobiologicznej i genetycznej szczepów produkcyjnych, a odpowiednie przechowywanie komórek zapewnia ich żywotność i stabilność. Stosowana metoda przechowywania powinna więc zapewniać: maksymalną przeżywalność komórek, minimalną ilość uszkodzonych komórek, zahamowanie procesów metabolicznych, ochronę przed spontanicznymi mutacjami i selekcją komórek mniej przydatnych w procesie technologicznych, ochronę przed kontaminacją innymi mikroorganizmami, łatwość uaktywnienia kultury, przygotowania materiału posiewowego, wykonania poszczególnych zabiegów technicznych i transportu, zachowanie pierwotnych funkcji życiowych po rozmrożeniu. Metody przechowywania drobnoustrojów Do najpopularniejszych metod przechowywania drobnoustrojów zalicza się: PASAŻOWANIE polegające na okresowym przesiewie hodowli na podłoże płynne lub stałe (również na skosy agarowe) i przechowywanie przygotowanych hodowli w temperaturze pokojowej lub 4 C. W celu ograniczenia procesów metabolicznych drobnoustrojów powierzchnię pożywki można zalać warstwą jałowej parafiny (ok. 1 cm), która uniemożliwia dostęp powietrza. Pasażowanie szczepów stwarza jednak ryzyko kontaminacji hodowli innymi mikroorganizmami oraz występowania zmian cech morfologicznych czy biochemicznych, które mogą być wynikiem spontanicznych mutacji. Metoda ta polecana jest do przechowywania szczepów stabilnych genetycznie, np. drożdży. Przechowywanie w +4 C w WODZIE DESTYLOWANEJ po usunięciu podłoża. Dynamiczny i prawidłowy rozwój drobnoustrojów możliwy jest wyłącznie w środowisku bogatym w wodę. Zarówno pobór substancji odżywczych z otoczenia, jak i wydalanie produktów przemian metabolicznych mikroorganizmów odbywa się za pośrednictwem wodnych roztworów tych związków. Dla utrzymania aktywności metabolicznej bakterii wymagana jest wilgotność 1
środowiska na poziomie 30%, podczas gdy grzyby strzępkowe wymagają ok. 15% wilgotności. W warunkach niesprzyjających wzrostowi wybrane gatunki drobnoustrojów mogą przechodzić w formę przetrwalną, znacznie mniej wrażliwą na niedobór wody. Anhydrobioza, czyli stan okresowego i odwracalnego zatrzymania lub spowolnienia funkcji życiowych, wywołany niedoborem wody w otoczeniu, wiąże się przede wszystkim z utratą wolnej wody z komórki (aktywnej metabolicznie). Wewnątrz komórek pozostaje jedynie woda związana tworząca otoczki polarne grup związków, które tworzą szkielet żelu protoplazmy. W niej nie rozpuszczają się jednak substancje obecne w wolnych przestrzeniach struktury żelowej, co powoduje zatrzymanie funkcji biochemicznych komórki. Niezbędność wody w środowisku wykorzystano w kolejnej metodzie ich przechowywania mikroorganizmów oraz ich bioproduktów. Proces SZUSZENIA hodowli (lub jej produktów) może przebiegać: pod normalnym ciśnieniem, w temperaturze pokojowej metoda polecana zwłaszcza dla obficie zarodnikujących grzybów strzępkowych i promieniowców. Suszenie hodowli odbywa się bezpośrednio na podłożu wzrostowym. Wysuszone spory można zeskrobać z podłoża i wymieszać z jałowym piaskiem, glebą, żelem silikonowym czy węglem aktywnym, co pozwala zabezpieczyć właściwości technologiczne drobnoustrojów nawet na kilka lat przy przechowywaniu ich w 4 C oraz chronić przed ponownym zawilgoceniem. pod zmniejszonym ciśnieniem, w ob. środka pochłaniającego wodę (np. P 2O 5) poprzez sublimację z stanu zamrożenia (liofilizacja) pozwala na wieloletnie przechowywanie szczepów z zachowaniem ich pierwotnych właściwości, jednak z upływem czasu maleje liczba żywych komórek, co prowadzi do wyselekcjonowania określonych populacji. Liofilizacji towarzyszy także duży efekt letalny oraz możliwość pojawiania się spontanicznych mutacji w czasie przechowywania komórek. Liofilizacja jest procesem dwuetapowym. W pierwszym następuje oziębienie i zamrożenie zawiesiny komórek w -70 C, a w drugim wysuszenie w wysokiej próżni. Uzyskany liofilizat powinien zawierać mniej niż 1% wody, jednak jej niewielka ilość w liofilizacje jest potrzebna do ochrony białek przed degradacją oraz utrzymania żywotności przechowywanej hodowli. Należy również pamiętać o zminimalizowaniu dostępu tlenu do komórek poddawanych liofilizacji, gdyż wywiera on na nie działanie toksyczne. Uzyskany liofilizat przechowuje się zwykle w 4 C. MROŻENIE jedna z najczęściej stosowanych metod, zwłaszcza w odniesieniu do kultur nie wytwarzających zarodników oraz hodowli komórek eukariotycznych. Standardowo stosuje się następujące temperatury mrożenia: -20 C, -80 C, -196 C (ciekły azot). W czasie zamrożenia i rozmrożenia komórki mogą ulec zniszczeniu na skutek tworzenia kryształów lodu czy wzrostu 2
stężenia elektrolitu. Uszkodzenia te można zniwelować poprzez dodatek krioprotektantów czynników ochronnych, zabezpieczających żywotność i aktywność komórek w czasie ich zamrażania, przechowywania i rozmrażania. Do najczęściej stosowanych krioprotektantów należą: glicerol i DMSO (dimetylosulfotlenek) w stężeniu 5-10% lub nawet 20%. Właściwości ochronne względem komórek posiadają również naturalne surowce o wysokiej zawartości białek (surowica krwi, pepton, mleko, żelatyna, bulion), aminokwasy (kwas glutaminowy i asparaginowy) oraz cukry (glukoza, sacharoza, dekstran). Na przeżywalność komórek przechowywanych tą metodą wpływ ma również szybkość zamrażania materiału. Wolne mrożenie sprzyja całkowitemu odwodnieniu komórek, tworzeniu dużych kryształów lodu, tworzeniu centrów krystalizacji w przestrzeni międzykomórkowej oraz zwiotczeniu komórek na skutek denaturacji białek (zwiększone stężenie soku komórkowego). Szybkie mrożenie natomiast prowadzi do wytworzenia większej liczby mniejszych kryształów i zapewnia większą żywotność komórek przy ich rozmrażaniu. Jednakże optymalna szybkość zamrażania uzależniona jest od wielkości komórek, zawartości wody czy indywidualnych właściwości danego organizmu. Dla odtworzenia maksymalnej żywotności i aktywności metabolicznej hodowli ogromne znaczenie ma również sposób ich ożywiania. Zaleca się szybkie rozmrażanie hodowli z uwagi na niebezpieczeństwo rekrystalizacji lodu w komórkach, co z kolei mogłoby spowodować uszkodzenie ich struktur. W komórkach, surowcach czy bioproduktach poddawanych mrożeniu mogą zmieniać się ich pierwotne właściwości. Zaburzenia te ogólnie dzielimy na: a) fizyczne spowodowane głównie przemiana fazową zmiana struktury produktów ubytek masy w wyniku parowania i sublimacji pary wodnej rekrystalizacja lodu b) chemiczne i biochemiczne wywołane działaniem enzymów wydzielanych przez drobnoustroje i enzymów tkankowych: denaturacja białek przemiana węglowodanów utlenianie i hydroliza tłuszczów straty witamin. 3
Banki komórkowe Nie ma jednej uniwersalnej metody przechowywania materiału biologicznego. Konieczne jest więc dobranie jej indywidualnie dla każdego gatunku mikroorganizmu, w zależności również od jego późniejszego przeznaczenia (procesu technologicznego, w którym ma zostać użyty). Jednakże najwłaściwsze warunki przechowywania, zapewniające wysoką aktywność biologiczną oraz stałość cech fizjologicznych osiągane są w kolekcjach (bankach) komórkowych. Instytucje takie mają za zadanie wyszukiwanie i identyfikację mikroorganizmów ze środowiska, ocenę ich przydatności biotechnologicznej, ulepszanie czy dobór i optymalizację odpowiedniej metody przechowywania. Ponadto są źródłem referencyjnych i patentowych szczepów dla celów edukacyjnych, badawczych i porównawczych. Wiele z nich ma znaczenie praktyczne, znajdując zastosowanie w przemyśle biotechnologicznym. Najstarsza kolekcja drobnoustrojów, holenderska CBS (hol. Centraalbureau voor Schimmelcutures), założona w 1904 r., początkowo gromadziła wybrane gatunki pleśni. Obecnie wszystkie banki komórkowe (476 z 62 krajów) zrzeszone są w Światowej Federacji Kultur Komórkowych (WFCC, ang. World Federation of Culture Collections), a do największych i najpopularniejszych należą: ATCC (ang. American Type of Culture Collection) założona w 1925 r. w USA. Gromadzi linie komórkowe, szczepy bakterii, grzybów, glonów, wirusy, plazmidy oraz genomowe DNA. NCTC (ang. National Collection of Type Cultures) kolekcja z Londynu deponująca kultury bakterii, mykoplazm oraz bakteriofagi, plazmidy i transpozony. DSMZ (niem. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) zawierająca szczepy bakterii, archeonów, drożdży, pleśni, a poza tym wirusy i plazmidy. NCAIM (ang. National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms) z Budapesztu gromadząca bakterie, pleśnie i drożdże wykorzystywane w rolnictwie i przemyśle. W Polsce 9 banków komórkowych zrzeszonych jest w WFCC, a są to: CCBA (ang. Culture Collection of Baltic Algae) Kolekcja Kultur Alg Bałtyckich Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański CPPIPP (ang. Collection of Plant Pathogens) Kolekcja Patogenów Roślin Instytut Ochrony Roślin, Poznań DMVB (ang. Department of Microbiology, Veterinary Branch of National Strain Collection) Państwowa Kolekcja Szczepów Oddziału Weterynarii Państwowy Instytut Weterynarii w Puławach IAFB (ang. Collection of Industrial Microorganisms) Kolekcja Mikroorganizmów Przemysłowych, Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie 4
IBA (ang. Collection of Microorganisms Producing Antibiotics) Kolekcja Mikroorganizmów Produkujących Antybiotyki Instytut Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie KOS (ang. Collection of Salmonella Microorganisms) Kolekcja Szczepów Salmonella Instytut Medycyny Morskiej i Tropikalnej w Gdyni LCC (ang. Culture Collection Laboratory) Laboratorium Kolekcji Kultur Instytut Biotechnologii Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie LOCK (ang. Centre of Industrial Microorganisms Collection) Ośrodek Czystych Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii, Politechnika Łódzka PCM (ang. Polish Collection of Microorganisms) Polska Kolekcja Mikroorganizmów, Instytut Mikrobiologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu. Stała izolacja i selekcja drobnoustrojów prowadzona przez ośrodki naukowe umożliwia uzyskanie nowych szczepów czy odmian mikroorganizmów, często posiadających cechy unikalne bądź znacznie zintensyfikowane cechy uprzednio zidentyfikowane. Daje to możliwość wykorzystania drobnoustrojów o precyzyjnie scharakteryzowanych cechach, do konkretnych bioprocesów zachowując ich zadany przebieg, zapewniając powtarzalność, znacznie zwiększając wydajność takiego procesu, podnosząc trwałość i jakość produktu. Szczepionki do procesów mikrobiologicznych Kultury starterowe (startery, szczepionki) ze względu na specyficzne właściwości są odpowiednio wyselekcjonowanymi drobnoustrojami w postaci kultury czystej lub mieszanej. Historia stosowania szczepionek mikrobiologicznych sięga XVII w., kiedy to po raz pierwszy zezwolono na dodatek drożdży winnych do wypieku chleba, zauważono bowiem, że osady winne dodane do ciasta oraz jego leżakowanie przed wypiekiem przyczynia się do zwiększenia objętości ciasta, a dodatkowo chleb po wypieku staję się bardziej pulchny. W przemyśle spożywczym nadal często wykorzystuje się fermentację spontaniczną, co powiązane jest z szeregiem zagrożeń, które mogą prowadzić do powstania produktów wadliwych, zagrażającym zdrowiu konsumentów. Decydując się na wykorzystanie "mikroflory naturalnej", należy więc używać sprawdzonych surowców wysokiej jakości i bezbłędnie stosować odpowiednie technologie. Jednakże coraz ostrzejsze przestrzeganie zasad higieny, powodujące obniżenie ilości swoistej mikroflory może być związane z niebezpieczeństwem rozwoju innych drobnoustrojów niepożądanych. Kultury starterowe są zdefiniowane i przebadane pod względem składu. Zdolne są do namnażania po bezpośrednim dodatku do surowca, a w niektórych przypadkach, przy zachowaniu 5
najwyższych środków bezpieczeństwa, ze względu na ryzyko kontaminacji, wstępnie namnażane są do ilości wymaganej warunkami szczepienia. Skuteczność działania dodanych drobnoustrojów zależy głównie od ich zdolności do tworzenia pożądanych produktów w warunkach panujących w substracie, tj. dostępność pożywki, aktywność wody (zawartość soli), temperatura, potencjał oksydoredukcyjny, ph, obecność mikroflory konkurencyjnej czy obecność substancji konserwujących i inhibitorów wzrostu. Produkcja szczepionek do celów przemysłowych rozpoczyna się od namnożenia drobnoustrojów w najbardziej optymalnych dla nich warunkach aż do uzyskania jak największej ilości komórek w dobrej kondycji metabolicznej. Następnie komponuje się skład szczepionki poprzez zestawienie odpowiednich gatunków i/lub szczepów drobnoustrojów we właściwych proporcjach i utrwala się ją zachowując żywotność i właściwości biochemiczne komórek. Zależnie od zastosowania szczepionki i rodzaju bakterii ją tworzących może występować w postaci zawiesiny, zamrożonego stock u, liofilizatu, hodowli na skosach agarowych lub w hodowli płynnej. Kultury starterowe grzybów mikroskopowych przygotowywane są w postaci liofilizatów zarodników lub grzybni wegetatywnej bądź jako mieszaniny wysuszonych zarodników w węglu aktywnym, sterylnym piasku czy cytrynianie wapnia. 6