Temat 1: Morfologia komórki i kolonii. Barwienie pozytywne proste i barwienie negatywne Literatura: 1. Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str. 32-49 (mikroskop, imersja, preparaty), 78-84 (metody barwienia), 95-101 (morfologia komórki i kolonii), 2. Grabińska Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str. 13-19 (mikroskop, metody barwienia, pomiar wielkości komórek, preparaty). Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: wiedzieć, w jakim celu określa się morfologię komórek i kolonii; znać podstawowe typy morfologiczne komórek bakteryjnych; znać rodzaje preparatów i etapy ich przygotowania; wiedzieć, dlaczego barwi się komórki drobnoustrojów; znać ogólny podział metod barwienia preparatów; rozumieć, dlaczego przy użyciu obiektywu o powiększeniu 100x stosuje się olejek imersyjny; znać cechy, które bierze się pod uwagę przy opisie morfologii kolonii i umieć opisać wybraną kolonię; znać pojęcia: morfologia, imersja, pleomorfizm, kolonia, kolonia typu S i R; umieć wykonać preparat barwiony błękitem metylenowym i preparat barwiony negatywnie. Morfologia zajmuje się zewnętrznym wyglądem komórek i ich zgrupowań.(z gr. morphe kształt). Ma to znaczenie w identyfikacji drobnoustrojów, czyli określeniu, z jakim gatunkiem mamy do czynienia. Oczywiście na podstawie jedynie cech morfologicznych nie da się precyzyjnie zidentyfikować gatunku (konieczne są tu również m. in. testy biochemiczne). Badania te dostarczają jednak niezbędnych wstępnych informacji pozwalających zawęzić krąg poszukiwań. Na przykład stwierdzenie, że badane komórki mają kształt kulisty, pozwala wykluczyć dużą grupę bakterii cylindrycznych. Komórki bakteryjne mają rozmiar rzędu 1 m (10-6 m). Ich kształt da się sprowadzić do trzech podstawowych typów morfologicznych: kulisty, cylindryczny, skręcony. Formy kuliste nazywane są ziarniakami (łac. coccus). Ziarniaki mogą występować jako pojedyncze komórki lub układy dwukomórkowe (dwoinki), wielokomórkowe ułożone w pakiety sześcienne (pakietowce), łańcuszki (paciorkowce) lub grona (gronkowce). Formy cylindryczne nazywa się pałeczkami (łac. bacterium). Należy tu najważniejsza z sanitarnego punktu widzenia grupa bakterii - bakterie jelitowe. Niektóre pałeczki są na jednym końcu grubsze i przypominają maczugę (corynebacterium - maczugowiec). Część form pałeczkowatych bardziej wydłużona i prostopadle ucięta na końcach określana jest mianem laseczek (łac. bacillus). Laseczki mają zdolność do wytwarzania wewnątrz komórek tzw. przetrwalników (endospor), które sprawiają, że są one niezwykle odporne na niekorzystne warunki środowiska (wytrzymują gotowanie i długotrwałe wysuszenie). Formy skręcone mają zwykle albo postać przecinkowato zgiętych pałeczek (przecinkowce) albo komórek skręconych śrubowato (śrubowce i krętki). Niektóre bakterie tworzą formy nitkowate, w tym rozgałęzione (np. promieniowce). Jeszcze inne wykazują tzw. pleomorfizm (wielopostaciowość) przybierając różne formy
morfologiczne. Np. pospolite bakterie glebowe z rodzaju Arthrobacter w zależności od ilości składników pokarmowych w podłożu, mają albo postać pałeczek (gdy jest dużo pokarmu) albo ziarniaków (w warunkach głodowych). Dlatego formy te określa się mianem ziarniakopałeczek. Pleomorfizm można też wywołać sztucznie, np. działając penicyliną, która zaburza syntezę ściany komórkowej. Powstają wówczas komórki o zniekształconym, wydłużonym i często rozgałęzionym kształcie, tzw. formy L. Po zaprzestaniu działania czynnika szkodliwego, komórki wracają do swojej naturalnej postaci. W stanie naturalnym bakterie są słabo widoczne pod mikroskopem i trudno jest określić ich morfologię. Dlatego w celu ich lepszego uwidocznienia stosuje się różnorodne techniki barwienia. Ogólnie barwienie dzieli się na proste, gdy używa się jednego barwnika, złożone, gdy używa się przynajmniej dwóch barwników. Stosując inne kryterium podziału można wyróżnić: barwienie pozytywne, gdy barwi się obiekt badań, barwienie negatywne, gdy barwi się jedynie tło. Aby zabarwić bakterie, należy najpierw wykonać preparat. Preparat wykonuje się na szkiełku mikroskopowym przedmiotowym (podstawowym) przez naniesienie drobnoustrojów na jego powierzchnię. Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje preparatów: preparaty przyżyciowe, preparaty utrwalone. W pierwszym przypadku naniesione na szkiełko mikroorganizmy zachowuje się przy życiu, a w drugim komórki poddaje się tzw. utrwaleniu. Celem utrwalania jest zwiększenie podatności komórek na barwienie i zapobieżenie zmyciu komórek ze szkiełka w trakcie procesu barwienia. Utrwalanie może polegać np. na ogrzewaniu preparatu w płomieniu palnika lub na polaniu go alkoholem. W efekcie komórki giną i ich osłony stają się przepuszczalne dla barwników. Poza tym wewnętrzne struktury komórkowe ulegają denaturacji odsłaniając grupy funkcyjne makromolekuł reagujące z barwnikami. Do barwienia pozytywnego stosuje się zwykle barwniki zasadowe, czyli takie, które w roztworach wodnych mają ładunek dodatni. Dodatnio naładowane jony barwnika łatwo łączą się bowiem ze zwykle ujemnie naładowanymi komórkami bakterii. Często stosowanymi barwnikami zasadowymi są m. in.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fuksyna karbolowa i safranina. Inną techniką barwienia bakterii jest barwienie negatywne, w którym barwi się nie obiekt, lecz tło. Używa się do tego celu barwników kwaśnych o ładunku ujemnym, których jony są odpychane od bakteryjnych ścian komórkowych. Są to barwniki o charakterze tuszu np. tusz chiński lub nigrozyna. Barwienie negatywne stosuje się wówczas, kiedy chcemy lepiej uwidocznić bakterie nie przyjmujące barwników (np. krętki wywołujące kiłę) lub w celu uwidocznienia otoczek bakteryjnych. Komórka bakteryjna po dostaniu się na powierzchnię zestalonej pożywki, zaczyna się dzielić (z różną szybkością, zależną od czynników zewnętrznych i od gatunku) i po określonym czasie (zwykle paru dób) wytwarza bardzo liczne zgrupowanie komórek zwane kolonią (kolonią powierzchniową), które jest widoczne gołym okiem. W jednej kolonii znajduje się ok. 10 9 komórek. Wygląd zewnętrzny kolonii powierzchniowej, czyli jej morfologia, jest charakterystyczny dla danego rodzaju mikroorganizmu, dlatego jest pomocny w jego identyfikacji. Niektóre gatunki bakterii tworzą dwa typy kolonii: S i R. Kolonie typu S mają gładką powierzchnię (ang. smooth - gładki ), a kolonie R szorstką (ang. rough - szorstki). Jest to związane z różnicami w budowie błony zewnętrznej pokrywającej ścianę komórkową tych bakterii; komórki tworzące kolonie R wykazują braki w kompleksie lipopolisacharydowym (LPS) tworzącym tę błonę. Jako że błona zewnętrzna odpowiada za właściwości
chorobotwórcze wielu bakterii (np. pałeczek Salmonella), szczepy tworzące kolonie typu R nie wywołują zakażeń. Mniej charakterystyczne kolonie powstają, gdy komórka znajdzie się nie na powierzchni, lecz w głębi zestalonej pożywki. Powstają wówczas tzw. kolonie wgłębne, mające zwykle kształt soczewkowaty, z powodu ciśnienia działającego wewnątrz pożywki na dzielące się komórki.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Morfologia komórki wykonanie barwienia prostego błękitem metylenowym Przygotowanie preparatu i utrwalenie go: 1. Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką. 2. Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę. 3. Po ostudzeniu ezy opalić korek i wylot probówki zawierającej zawiesinę bakterii przeznaczoną do barwienia. 4. Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą hodowlę bakterii. 5. Opalić wylot probówki i korek, a następnie zamknąć nim probówkę. 6. Odstawić probówkę do statywu. 7. Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka. 8. Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia. 9. Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu. 10. Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne). Barwienie błękitem metylenowym:. 1. Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat błękitem metylenowym na 1,5 minuty. 2. Spłukać wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły. 3. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i położyć kroplę olejku imersyjnego na środek preparatu. 4. Nastawić obiektyw imersyjny (100x) i kręcąc śrubą makrometryczną obniżać go aż do momentu zetknięcia się czoła obiektywu z olejkiem. 5. Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość i obserwować preparat. Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj rysunek:
Zadanie 2. Morfologia komórki wykonanie barwienia negatywnego 1. Pobrać dwa szkiełka przedmiotowe i jedno z nich odtłuścić jak w zadaniu 1. 2. Pobrać sterylną pipetą 1 kroplę zawiesiny bakterii przeznaczonej do barwienia negatywnego i położyć ją na odtłuszczone szkiełko. 3. Pobrać inną pipetą 1 kroplę tuszu (lub nigrozyny) i położyć ją obok kropli z bakteriami. 4. Drugim szkiełkiem (jego krótszym brzegiem) zmieszać obie krople i wykonać rozmaz trzymając szkiełko pod kątem ok. 45 0 i przeciągając wzdłuż pierwszego szkiełka. 5. Pozostawić preparat do wyschnięcia i oglądać pod imersją UWAGA! Bakterie barwione tą metodą pozostają żywe. Należy zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się z preparatem! Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj rysunek: Zadanie 3. Pomiar wielkości komórek bakteryjnych za pomocą okularu mikrometrycznego (z użyciem instrukcji obsługi okularu) 1.Wycechować mikrometr okularowy, tzn. określić wartość odległości między kreskami podziałki, za pomocą płytki z podziałką wzorcową (jedna działka na płytce wzorcowej równa jest 0,01 mm) i obliczyć powiększenie obiektywu (P). 2. Dokonać pomiaru długości komórki bakteryjnej (ΔL = L 2 L 1 ) nastawiając wskaźnik (środek krzyża) na punkty krańcowe komórki. 3. Obliczyć rzeczywiste wymiary badanej komórki X = ΔL/P Zadanie 4. Morfologia kolonii Wybierz dwie różne kolonie spośród wyrosłych na pożywce agarowej na szalce Petriego i opisz ich morfologię uwzględniając: wielkość, kształt, wzniesienie, brzeg, przejrzystość, barwę, strukturę, kształt i wzrost. Opisując kolonie korzystaj z lupy i tablic. Wykonaj rysunki: