Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki

Transkrypt

1 Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki LABORATORIUM Z MIKROBIOLOGII ŚRODOWISKA Autorzy: Waldemar Adamiak, Barbara Kołwzan Wrocław, 2017

2 Program kursu: 1. Morfologia komórki i kolonii. Barwienie pozytywne proste i barwienie negatywne 2. Morfologia komórki bakteryjnej. Barwienie złożone 3. Morfologia grzybów drożdżowych i pleśni 4-5. Sterylizacja i dezynfekcja 6-7. Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów 8. Analiza mikrobiologiczna wody Analiza mikrobiologiczna gleby 11. Analiza mikrobiologiczna powietrza Mikrobiologia osadu czynnego Różnicowanie pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Izolacja bakteriofagów ze ścieków

3 Laboratorium 1: Morfologia komórki i kolonii. Barwienie pozytywne proste i barwienie negatywne Literatura: 1. Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str (mikroskop, imersja, preparaty), (metody barwienia), (morfologia komórki i kolonii), 2. Grabińska Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str (mikroskop, metody barwienia, pomiar wielkości komórek, preparaty). Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: wiedzieć, w jakim celu określa się morfologię komórek i kolonii; znać podstawowe typy morfologiczne komórek bakteryjnych; znać rodzaje preparatów i etapy ich przygotowania; wiedzieć, dlaczego barwi się komórki drobnoustrojów; znać ogólny podział metod barwienia preparatów; rozumieć, dlaczego przy użyciu obiektywu o powiększeniu 100x stosuje się olejek imersyjny; znać cechy, które bierze się pod uwagę przy opisie morfologii kolonii i umieć opisać wybraną kolonię; znać pojęcia: morfologia, imersja, pleomorfizm, kolonia, kolonia typu S i R; umieć wykonać preparat barwiony błękitem metylenowym i preparat barwiony negatywnie. Morfologia zajmuje się zewnętrznym wyglądem komórek i ich zgrupowań.(z gr. morphe kształt). Ma to znaczenie w identyfikacji drobnoustrojów, czyli określeniu, z jakim gatunkiem mamy do czynienia. Oczywiście na podstawie jedynie cech morfologicznych nie da się precyzyjnie zidentyfikować gatunku (konieczne są tu również m. in. testy biochemiczne). Badania te dostarczają jednak niezbędnych wstępnych informacji pozwalających zawęzić krąg poszukiwań. Na przykład stwierdzenie, że badane komórki mają kształt kulisty, pozwala wykluczyć dużą grupę bakterii cylindrycznych. Komórki bakteryjne mają rozmiar rzędu 1 m (10-6 m). Ich kształt da się sprowadzić do trzech podstawowych typów morfologicznych: kulisty, cylindryczny, skręcony. Formy kuliste nazywane są ziarniakami (łac. coccus). Ziarniaki mogą występować jako pojedyncze komórki lub układy dwukomórkowe (dwoinki), wielokomórkowe ułożone w pakiety sześcienne (pakietowce), łańcuszki (paciorkowce) lub grona (gronkowce). Formy cylindryczne nazywa się pałeczkami (łac. bacterium). Należy tu najważniejsza z sanitarnego punktu widzenia grupa bakterii - bakterie jelitowe. Niektóre pałeczki są na jednym końcu grubsze i przypominają maczugę (corynebacterium - maczugowiec). Część form pałeczkowatych bardziej wydłużona i prostopadle ucięta na końcach określana jest mianem laseczek (łac. bacillus). Laseczki mają zdolność do wytwarzania wewnątrz komórek tzw. przetrwalników (endospor), które sprawiają, że są one niezwykle odporne na niekorzystne warunki środowiska (wytrzymują gotowanie i długotrwałe wysuszenie). Formy skręcone mają zwykle albo postać przecinkowato zgiętych pałeczek (przecinkowce) albo komórek skręconych śrubowato (śrubowce i krętki). Niektóre bakterie tworzą formy nitkowate, w tym rozgałęzione (np. promieniowce). Jeszcze inne wykazują tzw. pleomorfizm (wielopostaciowość) przybierając różne formy

4 morfologiczne. Np. pospolite bakterie glebowe z rodzaju Arthrobacter w zależności od ilości składników pokarmowych w podłożu, mają albo postać pałeczek (gdy jest dużo pokarmu) albo ziarniaków (w warunkach głodowych). Dlatego formy te określa się mianem ziarniakopałeczek. Pleomorfizm można też wywołać sztucznie, np. działając penicyliną, która zaburza syntezę ściany komórkowej. Powstają wówczas komórki o zniekształconym, wydłużonym i często rozgałęzionym kształcie, tzw. formy L. Po zaprzestaniu działania czynnika szkodliwego, komórki wracają do swojej naturalnej postaci. W stanie naturalnym bakterie są słabo widoczne pod mikroskopem i trudno jest określić ich morfologię. Dlatego w celu ich lepszego uwidocznienia stosuje się różnorodne techniki barwienia. Ogólnie barwienie dzieli się na proste, gdy używa się jednego barwnika, złożone, gdy używa się przynajmniej dwóch barwników. Stosując inne kryterium podziału można wyróżnić: barwienie pozytywne, gdy barwi się obiekt badań, barwienie negatywne, gdy barwi się jedynie tło. Aby zabarwić bakterie, należy najpierw wykonać preparat. Preparat wykonuje się na szkiełku mikroskopowym przedmiotowym (podstawowym) przez naniesienie drobnoustrojów na jego powierzchnię. Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje preparatów: preparaty przyżyciowe, preparaty utrwalone. W pierwszym przypadku naniesione na szkiełko mikroorganizmy zachowuje się przy życiu, a w drugim komórki poddaje się tzw. utrwaleniu. Celem utrwalania jest zwiększenie podatności komórek na barwienie i zapobieżenie zmyciu komórek ze szkiełka w trakcie procesu barwienia. Utrwalanie może polegać np. na ogrzewaniu preparatu w płomieniu palnika lub na polaniu go alkoholem. W efekcie komórki giną i ich osłony stają się przepuszczalne dla barwników. Poza tym wewnętrzne struktury komórkowe ulegają denaturacji odsłaniając grupy funkcyjne makromolekuł reagujące z barwnikami. Do barwienia pozytywnego stosuje się zwykle barwniki zasadowe, czyli takie, które w roztworach wodnych mają ładunek dodatni. Dodatnio naładowane jony barwnika łatwo łączą się bowiem ze zwykle ujemnie naładowanymi komórkami bakterii. Często stosowanymi barwnikami zasadowymi są m. in.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fuksyna karbolowa i safranina. Inną techniką barwienia bakterii jest barwienie negatywne, w którym barwi się nie obiekt, lecz tło. Używa się do tego celu barwników kwaśnych o ładunku ujemnym, których jony są odpychane od bakteryjnych ścian komórkowych. Są to barwniki o charakterze tuszu np. tusz chiński lub nigrozyna. Barwienie negatywne stosuje się wówczas, kiedy chcemy lepiej uwidocznić bakterie nie przyjmujące barwników (np. krętki wywołujące kiłę) lub w celu uwidocznienia otoczek bakteryjnych. Komórka bakteryjna po dostaniu się na powierzchnię zestalonej pożywki, zaczyna się dzielić (z różną szybkością, zależną od czynników zewnętrznych i od gatunku) i po określonym czasie (zwykle paru dób) wytwarza bardzo liczne zgrupowanie komórek zwane kolonią (kolonią powierzchniową), które jest widoczne gołym okiem. W jednej kolonii znajduje się ok komórek. Wygląd zewnętrzny kolonii powierzchniowej, czyli jej morfologia, jest charakterystyczny dla danego rodzaju mikroorganizmu, dlatego jest pomocny w jego identyfikacji. Niektóre gatunki bakterii tworzą dwa typy kolonii: S i R. Kolonie typu S mają gładką powierzchnię (ang. smooth - gładki ), a kolonie R szorstką (ang. rough - szorstki). Jest to związane z różnicami w budowie błony zewnętrznej pokrywającej ścianę komórkową tych bakterii; komórki tworzące kolonie R wykazują braki w kompleksie lipopolisacharydowym (LPS) tworzącym tę błonę. Jako że błona zewnętrzna odpowiada za właściwości

5 chorobotwórcze wielu bakterii (np. pałeczek Salmonella), szczepy tworzące kolonie typu R nie wywołują zakażeń. Mniej charakterystyczne kolonie powstają, gdy komórka znajdzie się nie na powierzchni, lecz w głębi zestalonej pożywki. Powstają wówczas tzw. kolonie wgłębne, mające zwykle kształt soczewkowaty, z powodu ciśnienia działającego wewnątrz pożywki na dzielące się komórki.

6 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Morfologia komórki wykonanie barwienia prostego błękitem metylenowym Przygotowanie preparatu i utrwalenie go: 1. Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką. 2. Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę. 3. Po ostudzeniu ezy opalić wylot probówki zawierającej zawiesinę bakterii przeznaczoną do barwienia. 4. Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą hodowlę bakterii. 5. Opalić wylot probówki i nałożyć korek. 6. Odstawić probówkę do statywu. 7. Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka. 8. Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia. 9. Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu. 10. Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne). Barwienie błękitem metylenowym:. 1. Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat błękitem metylenowym na 1,5 minuty. 2. Spłukać wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły. 3. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i położyć kroplę olejku imersyjnego na środek preparatu. 4. Nastawić obiektyw imersyjny (100x) i kręcąc śrubą makrometryczną obniżać go aż do momentu zetknięcia się czoła obiektywu z olejkiem. 5. Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość i obserwować preparat. Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj rysunek. Zadanie 2. Morfologia komórki wykonanie barwienia negatywnego 1. Pobrać dwa szkiełka przedmiotowe i jedno z nich odtłuścić jak w zadaniu Pobrać sterylną pipetą 1 kroplę zawiesiny bakterii przeznaczonej do barwienia negatywnego i położyć ją na odtłuszczone szkiełko. 3. Pobrać inną pipetą 1 kroplę tuszu (lub nigrozyny) i położyć ją obok kropli z bakteriami. 4. Drugim szkiełkiem (jego krótszym brzegiem) zmieszać obie krople i wykonać rozmaz trzymając szkiełko pod kątem ok i przeciągając wzdłuż pierwszego szkiełka. 5. Pozostawić preparat do wyschnięcia i oglądać pod imersją UWAGA! Bakterie barwione tą metodą pozostają żywe. Należy zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się z preparatem! Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj rysunek.

7 Zadanie 3. Pomiar wielkości komórek bakteryjnych za pomocą okularu mikrometrycznego (z użyciem instrukcji obsługi okularu) 1.Wycechować mikrometr okularowy, tzn. określić wartość odległości między kreskami podziałki, za pomocą płytki z podziałką wzorcową (jedna działka na płytce wzorcowej równa jest 0,01 mm) i obliczyć powiększenie obiektywu (P). 2. Dokonać pomiaru długości komórki bakteryjnej (ΔL = L 2 L 1 ) nastawiając wskaźnik (środek krzyża) na punkty krańcowe komórki. 3. Obliczyć rzeczywiste wymiary badanej komórki X = ΔL/P Zadanie 4. Morfologia kolonii Wybierz dwie różne kolonie spośród wyrosłych na pożywce agarowej na szalce Petriego i opisz ich morfologię uwzględniając: wielkość, kształt, wzniesienie, brzeg, przejrzystość, barwę, strukturę, kształt i wzrost. Opisując kolonie korzystaj z lupy i tablic. Wykonaj rysunki:

8 Laboratorium 2: Morfologia komórki bakteryjnej. Barwienie złożone Literatura: 3. Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str , 78-84, , 4. Grabińska Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: rozumieć procedurę barwienia Grama i umieć wykonać preparat barwiony tą metodą; znać różnice między bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi; wiedzieć, które formy morfologiczne komórek barwią się dodatnio, a które ujemnie metodą Grama; znać pojęcia: forma wegetatywna i forma przetrwalna bakterii; wiedzieć, co to są endospory i umieć wykonać preparat barwiony metodą Wirtza. Najczęściej stosowaną w mikrobiologii techniką barwienia jest metoda Grama (od nazwiska duńskiego badacza). Jest to barwienie złożone pozytywne, w którym stosuje się kolejno dwa kontrastowe barwniki zasadowe: fioletowy (fiolet krystaliczny) i czerwony (fuksyna). Właściwy proces barwienia poprzedzony jest termicznym utrwaleniem preparatu. Barwienie to składa się z następujących etapów: zabarwienia preparatu fioletem krystalicznym, utrwalenia zabarwienia przez dodanie jodu w postaci płynu Lugola (roztwór J 2 w KJ), wymycia barwnika alkoholem, dobarwienia preparatu barwnikiem kontrastowym fuksyną. Po dodaniu pierwszego barwnika wszystkie komórki barwią się na fioletowo. Dodanie płynu Lugola powoduje powstanie nierozpuszczalnego kompleksu fioletu krystalicznego z jodem. Kompleks ten jest następnie ekstrahowany 95 % alkoholem. Okazuje się, że te bakterie, które mają grubą warstwę mureiny (peptydoglikanu) w ścianie komórkowej nie tracą barwnego kompleksu i pozostają fioletowe po działaniu alkoholem. Te natomiast, których warstwa mureiny jest cienka, łatwo tracą barwnik i ulegają odbarwieniu. Aby je uwidocznić stosuje się drugi barwnik kontrastowy, którym jest czerwona fuksyna zasadowa. W efekcie część komórek zabarwi się na fioletowo, a część na czerwono. Te pierwsze określa się mianem bakterii gramdodatnich, drugie mianem bakterii gramujemnych. Barwienie Grama jest więc barwieniem różnicowym, gdyż pozwala zróżnicować bakterie na dwie podstawowe grupy, w zależności od tego, którym barwnikiem się zabarwią. Strukturalnym podłożem tych różnic jest przede wszystkim różnica w budowie ściany komórkowej. Znaczenie barwienia Grama polega na tym, że różnice w barwliwości bakterii gramdodatnich i gramujemnych są skorelowane z innymi, bardziej istotnymi różnicami między nimi. Oto tylko niektóre z nich: Bakterie gramdodatnie: mają grubą ścianę komórkową z dużym procentowym udziałem mureiny, są wrażliwe na penicylinę,

9 są wrażliwe na lizozym (enzym występujący np. we łzach), który rozpuszcza ich ścianę komórkową (a konkretnie peptydoglikan mureinę) pozostawiając tzw. protoplasty komórki bez ściany, są bardzo wrażliwe na detergenty anionowe, część z nich ma zdolność wytwarzania przetrwalników (endospor). Bakterie gramujemne: mają cienką ścianę komórkową z niewielkim udziałem peptydoglikanu ale z dodatkową specyficzną błoną na zewnątrz ściany (tzw. błoną zewnętrzną), są zwykle mało wrażliwe na penicylinę, są odporne na działanie samego lizozymu, są mało wrażliwe na detergenty anionowe, nie mają zdolności do wytwarzania endospor. Bakteriami gramdodatnimi są zasadniczo laseczki i ziarniaki, natomiast typowe pałeczki (np. pałeczki jelitowe) są gramujemne. Barwliwość metodą Grama nie jest cechą stałą bakterii. Niektóre z nich, w zasadzie gramdodatnie, w starych hodowlach barwią się gramujemnie lub mozaikowato: część komórki jest fioletowa a część czerwona. Dlatego wiarygodny wynik barwienia dają tylko komórki pochodzące ze świeżych hodowli. Trzeba też wspomnieć, że nie wszystkie bakterie barwią się metodą Grama, np. prątki, zaliczane do promieniowców (w tym słynny prątek gruźlicy) mają ścianę tak silnie wysyconą substancjami lipidowymi i woskami, że barwniki nie wnikają do wnętrza ich komórek. Natomiast barwią się metodą Grama grzyby (np. drożdże), które zwykle są gramdodatnie. Niektóre bakterie mogą występować zarówno w postaci komórek wegetatywnych, tzn. aktywnych metabolicznie i zdolnych do rozmnażania się, odżywiania, poruszania itd., jak i w postaci form przetrwalnych, których aktywność życiowa jest zahamowana. Najbardziej znaną formą przetrwaną są endospory, zwane też przetrwalnikami. Wytwarzają je głównie laseczki tlenowe z rodzaju Bacillus i laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium. Tworzą one endospory w niekorzystnych warunkach, szczególnie po wyczerpaniu się w podłożu substancji pokarmowych. Endospory są niezwykle odporne na wysoką temperaturę, wysychanie, promieniowanie, a także na działanie związków chemicznych, w tym barwników. W korzystnych warunkach są one zdolne przejść z powrotem w formę wegetatywną. W celu zabarwienia przetrwalników stosuje się specjalne metody z zastosowaniem wysokiej temperatury umożliwiającej przeniknięcie barwnika przez osłony endospor.

10 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Wykonanie barwienia metodą Grama Przygotowanie preparatu i utrwalenie go: 1. Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką. 2. Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę. 3. Po ostudzeniu ezy opalić wylot probówki zawierającej zawiesinę bakterii przeznaczoną do barwienia. 4. Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą hodowlę bakterii. 5. Opalić wylot probówki i nałożyć korek. 6. Odstawić probówkę do statywu. 7. Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka. 8. Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia. 9. Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu. 10. Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne). Barwienie metodą Grama: 1. Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat fioletem krystalicznym na 1,5 minuty. 2. Spłukać niewielką ilością wody i zalać płynem Lugola na 1,5 minuty. 3. Spłukać wodą i polewać alkoholem (denaturatem) do 30 sekund (nie dłużej!). 4. Spłukać dokładnie wodą. 5. Zalać fuksyną na sekund (nie dłużej!). 6. Spłukać dokładnie wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły. 7. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i położyć kroplę olejku imersyjnego na środek preparatu. 8. Nastawić obiektyw imersyjny (100x) i kręcąc śrubą makrometryczną obniżać go aż do momentu zetknięcia się czoła obiektywu z olejkiem. 9. Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość i obserwować preparat. Określ morfologię obserwowanych komórek i wykonaj kolorowy rysunek. Które typy morfologiczne bakterii barwią się metodą Grama dodatnio, a które ujemnie? Zadanie 2. Wykonanie barwienia przetrwalników metodą Wirtza 1. Wykonać preparat utrwalony z zawiesiny laseczek Bacillus sp. jak w zadaniu 1 2. Zalać preparat wodnym roztworem zieleni malachitowej 3. Uchwycić preparat za pomocą szczypiec i podgrzewać nad płomieniem palnika do pojawienia się pary, po czym odsunąć preparat znad płomienia i odczekać aż przestanie parować 4. Czynność powtarzać przez 5 minut uzupełniając odparowujący barwnik

11 5. Odczekać, aż preparat ostygnie 6. Spłukać dokładnie wodą destylowaną 5. Dobarwić roztworem fuksyny fenolowej przez 1 minutę 6. Spłukać wodą i wysuszyć 7. Obserwować pod imersją jak w zadaniu 1. Wykonaj kolorowy rysunek.

12 Laboratorium 3: Morfologia grzybów drożdżowych i pleśni Literatura: 5. Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str , 6. Grabińska Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str Schlegel H.: Mikrobiologia ogólna. PWN 1996, rozdz. 5 Grzyby (Mycota) Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: Umieć scharakteryzować drożdże właściwe, grzyby drożdżoidalne i pleśnie, z uwzględnieniem ich znaczenia dla człowieka i podaniem przykładowych gatunków; znać morfologię drożdży i pleśni; znać rodzaje zarodników grzybowych; rozumieć pojęcia: pączkowanie, grzybnia, pseudogrzybnia, grzybnia wegetatywna, zarodniki wewnętrzne i zewnętrzne; umieć wykonać preparat przyżyciowy i barwiony grzybów oraz sprawnie nastawić obraz pod mikroskopem; umieć rozróżniać pod mikroskopem drożdże od bakterii oraz podstawowe rodzaje pleśni (pleśniak, rozłożek, pędzlak, kropidlak); umieć opisać morfologię kolonii grzybowych; umieć zmierzyć wymiary komórek Grzyby, w przeciwieństwie do bakterii, są organizmami eukariotycznymi. Kiedyś były one uważane za rośliny i jeszcze do dziś są omawiane w podręcznikach botaniki. Jednak grzyby tworzą zupełnie odrębne królestwo organizmów, nie spokrewnione z roślinami ani zwierzętami. Przedmiotem zainteresowania mikrobiologii są jedynie tzw. grzyby mikroskopowe obejmujące drożdże i pleśnie. Drożdże są grzybami jednokomórkowymi i występują dziko w miejscach o dużym nagromadzeniu węglowodanów: w sokach wydzielanych przez rośliny (np. po zranieniu lub jako nektar w kwiatach), na owocach, a także w glebie czy na odchodach zwierzęcych. Niektóre powodują choroby u człowieka, zwane drożdżycami (ogólnie mikozami), a wywołane np. przez Candida sp. kandydozami. Candida albicans wywołuje tzw. pleśniawki, zmiany w błonie śluzowej jamy ustnej w postaci charakterystycznych białych plamek. Drożdże w szerokim znaczeniu obejmują zarówno drożdże właściwe, jak i grzyby drożdżopodobne. Drożdże właściwe należą do workowców, ponieważ wytwarzają zarodnie workowe (worki), a w nich zarodniki workowe (askospory) w procesie rozmnażania płciowego. Należą tu powszechnie znane drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae. Natomiast grzyby drożdżopodobne (drożdżoidalne, drożdże bezworkowe) nie rozmnażają się płciowo, a więc nie wytwarzają worków i są zaliczane do prowizorycznego taksonu tzw. grzybów niedoskonałych, grupujących grzyby, które zatraciły zdolność do wytwarzania ogranów rozmnażania płciowego. Należą tu np. gatunki z rodzaju Candida i Rhodotorula. Drożdże, zarówno workowe, jak i bezworkowe, cechuje charakterystyczny sposób rozmnażania bezpłciowego w postaci tzw. pączkowania. Polega ono na tym, że w pewnym miejscu komórka tworzy rosnące stopniowo uwypuklenie, do którego przechodzi jedno z powstałych po podziale jąder potomnych. Następnie wytwarza się ściana komórkowa oddzielająca komórkę potomną od macierzystej. U drożdży piekarniczych powstałe komórki są jednakowej wielkości i oddzielają się od siebie. Po oddzieleniu, na obu komórkach (potomnej i macierzystej) pozostaje trwała blizna. W miejscu starej blizny komórka nie może utworzyć nowego pączka, a więc liczba blizn świadczy zarówno o wieku komórki, jak i o jej

13 zdolności do rozmnażania. U grzybów drożdżoidalnych komórki często nie rozdzielają się po pączkowaniu i wydłużają tworząc tzw. pseudogrzybnię w postaci rozgałęziających się łańcuszków, gron lub krzaczków. Pseudogrzybnia (pseudomycelium) to wydłużone, nitkowate struktury, często rozgałęziające się, utworzone wyłącznie przez komórki pączkujące. Struktura ta przypomina prawdziwą grzybnię (mycelium). Ta jednak utworzona jest przez komórki dzielące się, a nie pączkujące i jest charakterystyczna dla grzybów pleśniowych. Chociaż zdolność do pączkowania jest cechą charakterystyczną większości drożdży, to nie jest to cecha wyłącznie tej grupy grzybów (zdolność do pączkowania mają też np. niektóre podstawczaki). Niektóre drożdże nie pączkują, lecz rozmnażają się bezpłciowo przez zwykły podział komórki. Są to tzw. drożdże rozszczepkowe. Drożdże mogą również rozmnażać się przez zarodniki, czyli spory. Oprócz wspomnianych zarodników workowych, czyli askospor (wytwarzanych tylko przez drożdże właściwe w procesie płciowym), drożdże wytwarzają też zarodniki na drodze bezpłciowej. Mogą to być blastospory, które powstają w wyniku pączkowania (charakterystyczne np. dla Candida sp.) lub chlamydospory, czyli zarodniki przetrwalnikowe, charakteryzujące się grubą ścianą. Drugą grupą grzybów mikroskopowych są pleśnie. Jest to popularna nazwa określająca grzyby tworzące grzybnię zbudowaną z luźno skupionych strzępek, tzw. grzybnię powietrzną. Grzybnia ta tworzy charakterystyczne watowate skupienia o różnorodnym zabarwieniu (zielonym, zielononiebieskim, żółtym, różowym, białym lub czarnym). Wytwarza ona zarodniki i wyrasta z tzw. grzybni wegetatywnej, wrośniętej w podłoże, z którego pobiera substancje odżywcze. Podobnie jak drożdże, pleśnie również nie stanowią grupy jednorodnej systematycznie. Należą tu bowiem zarówno przedstawiciele grzybów niższych - sprzężniaki z rzędu pleśniakowców (pleśniak i rozłożek), jak i grzyby wyższe - workowce właściwe (kropidlak, pędzlak). Pleśnie rozmnażają się za pomocą zarodników. Sprzężniaki z rzędu pleśniakowców, jak pleśniak biały (Mucor mucedo), czy rozłożek czerniejący (Rhizopus nigricans) wytwarzają grzybnię nie podzieloną ścianami poprzecznymi (septami) na poszczególne komórki. Są więc komórczakami tworzą jedną dużą wielojądrową komórkę. Wytwarzają one (bezpłciowo i na drodze płciowej) zarodniki wewnątrz kulistych zarodni (sporangiów) osadzonych na trzonkach zarodnionośnych (sporangioforach). Pleśnie te wytwarzają więc zarodniki wewnętrzne. Pleśnie należące do workowców, a więc kropidlaki (Aspergillus spp.) i pędzlaki (Penicillium spp.) tworzą grzybnie wielokomórkowe, a więc podzielone ścianami poprzecznymi i wytwarzają tzw. zarodniki konidialne (konidiospory), czyli konidia. Konidia to zarodniki tworzone zewnętrznie, tj. przez odcięcie końcowej (górnej) części specjalnej, pionowo wzniesionej strzępki, zwanej strzępką konidionośną albo konidioforem.

14 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Barwienia komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae i komórek grzybów drożdżoidalnych Yarrowia lipolytica (Candida lipolytica) za pomocą fioletu krystalicznego na jednym szkiełku Przygotowanie i utrwalenie preparatu: 1. Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką 2. Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę 3. Po ostudzeniu ezy opalić wylot probówki zawierającej zawiesinę drożdży 4. Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą oczko zawiesiny 5. Opalić wylot probówki i nałożyć korek. 6. Odstawić probówkę do statywu 7. Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka 8. Wyżarzyć ezę i z drugiej probówki pobrać zawiesinę grzybów drożdżoidalnych jak wyżej 9. Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia. 10. Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu 11. Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne). Barwienie fioletem krystalicznym: 11. Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat fioletem krystalicznym na 1,5 minuty 12. Spłukać wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły 13. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i nastawić obiektyw 10x 14. Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość 15. Zmienić obiektyw na 40x i obserwować preparat Wykonaj rysunek zaznaczając komórki pączkujące, pseudogrzybnię i zarodniki. Zadanie 2. Obserwacja zarodników workowych (askospor) drożdży Saccharomyces cerevisiae w preparacie przyżyciowym 1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym 2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli drożdży z pożywki sporulacyjnej i zawiesić w kropli wody 3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując początkowo obiektyw 10x, a następnie 40x. Wykonać rysunek zaznaczając worki i zarodniki workowe (askospory)

15 Zadanie 3. Obserwacja komórek grzybów drożdżoidalnych w preparacie przyżyciowym 1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym 2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli grzybów drożdżoidalnych i zawiesić w kropli wody 3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując początkowo obiektyw 10x, a następnie 40x. Wykonać rysunek zaznaczając komórki pączkujące. Zadanie 4. Obserwacja grzybów pleśniowych w preparacie przyżyciowym 1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym 2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli grzybów pleśniowych i zawiesić w kropli wody 3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując początkowo obiektyw 10x, a następnie 40x. Wykonać rysunek zaznaczając: strzępki wegetatywne, strzępki zarodnionośne, zarodnie z zarodnikami lub zarodniki konidialne i inne wyróżniające się struktury. Zadanie 5. Pomiar wielkości komórek grzybowych (drożdży i pleśni) za pomocą okularu mikrometrycznego 1.Wycechować mikrometr okularowy przy nastawionym obiektywie 40x, tzn. określić wartość odległości między kreskami podziałki, za pomocą płytki z podziałką wzorcową (jedna działka na płytce wzorcowej równa jest 0,01 mm) i obliczyć powiększenie obiektywu (P). 2. Dokonać pomiaru długości i szerokości komórki grzybowej (ΔL = L 2 L 1 ) nastawiając wskaźnik (środek krzyża) na punkty krańcowe komórki. 3. Obliczyć rzeczywiste wymiary badanej komórki X = ΔL/P Porównaj wymiary komórek grzybowych z wymiarami komórek bakterii. Zadanie 6: Opis morfologii kolonii grzybowych Opisz morfologię kolonii grzybowych wyrosłych na pożywce Sabouraud a na szalce Petriego uwzględniając: wielkość, kształt, wzniesienie, brzeg, przejrzystość, barwę, strukturę. Opisując kolonie korzystaj z lupy i tablic. Porównaj kolonie drożdży z koloniami pleśni. Wykonaj rysunki.

16 Laboratorium 4-5: Sterylizacja i dezynfekcja Literatura: Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, Rozdział 5: Sterylizacja (wyjaławianie) i jej metody (str ) Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: rozumieć różnicę między sterylizacją a dezynfekcją; znać podstawowe metody wyjaławiania oraz ich wady i zalety, ze szczególnym uwzględnieniem sterylizacji parą wodną pod ciśnieniem (autoklaw); znać podstawowe grupy chemicznych środków dezynfekcyjnych z podaniem ich krótkiej charakterystyki; wiedzieć, od jakich czynników i jak zależy działanie środków dezynfekcyjnych; wiedzieć, co to jest współczynnik fenolowy, jak się go określa i od czego zależy jego wartość; znać czynniki wpływające na działanie promieniowania UV; wiedzieć, jak można sprawdzić skuteczność sterylizacji; znać pojęcia: środek bakteriobójczy, środek bakteriostatyczny, współczynnik temperatury, forma wegetatywna, formy przetrwalne drobnoustrojów; umieć określić współczynnik fenolowy danego związku (substancji). 1. Sterylizacja Sterylizacja, czyli wyjaławianie, jest to niszczenie lub usuwanie wszystkich drobnoustrojów, zarówno ich form wegetatywnych (wykazujących aktywność życiową: odżywiających się, oddychających, rozmnażających się itp.) jak i przetrwalnych (endospory laseczek, zarodniki grzybów). Efekt taki można uzyskać poprzez zastosowanie czynników fizycznych, takich jak temperatura i promieniowanie oraz przez filtrację. Sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem Metodą tą uzyskuje się najlepsze efekty jałowienia. Prowadzi ona do usunięcia form wegetatywnych i przetrwalnych wszystkich drobnoustrojów znajdujących się w sterylizowanych materiałach. Proces ten można przeprowadzać w szybkowarach i autoklawach. Najszersze zastosowanie ma autoklaw. Para wodna zasilająca to urządzenie może przechodzić z zewnętrznego źródła i wówczas przed wprowadzeniem do autoklawu wmontowany jest reduktor ciśnienia. Większość autoklawów posiada własne wytwornice pary wmontowane do aparatu. Autoklaw jest to dwuścienny kocioł z grubej blachy, zamykany szczelnie ciężką pokrywą. Zaopatrzony jest w manometr, termometr i zawór bezpieczeństwa. Zwykle wodę podgrzewa się za pomocą grzejnika elektrycznego. Wytworzona para wodna wypycha powietrze przez otwarty wypust. Następnie urządzenie zamyka się i para wytwarza w kotle ciśnienie wyższe od atmosferycznego. Dzięki temu podnosi się temperatura. Zwiększenie ciśnienia o 0,5 atmosfery powoduje ogrzanie pary wodnej do 111,7 0 C, a zwiększenie o 1 atmosferę do 121,6 0 C. W takich warunkach giną nawet formy przetrwalne drobnoustrojów. Najczęściej do sterylizacji podłoży bakteriologicznych stosuje się temperaturę C przez 20 minut. Nie jest to pełny cykl pracy urządzenia, bo należy także doliczyć czas usuwania powietrza, wprowadzania pary oraz czas schładzania, co razem zajmuje około 100 minut. Materiały, do których para wodna ma utrudniony dostęp wymagają zwiększenia ciśnienia pary wodnej lub wydłużenia czasu efektywnej pracy autoklawu.

17 Dekoktacja Jest to wyjaławianie w gorącej parze bieżącej o temp C. Proces ten prowadzi się w aparacie Kocha. Urządzenie to ma budowę kotła z pokrywą. Wyposażone jest w grzałkę do podgrzewania wody wypełniającej dno kotła. Nad wodą znajduje się metalowa siatka, na której ustawia się przedmioty i podłoża przeznaczone do jałowienia. Następnie kocioł nakrywa się. Para wydzielająca się podczas podgrzewania wody usuwa powietrze z kotła i przy ciśnieniu równym atmosferycznemu, przepływa przez aparat. Dekoktację prowadzi się przez minut. W takich warunkach nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów i wirusy zapalenia wątroby typu B. Metoda ta służy do wyjaławiania pożywek i przedmiotów termowrażliwych. Tyndalizacja Zabieg ten polega na trzykrotnym ogrzaniu materiałów w bieżącej parze wodnej przez 30 minut w odstępach 24 godzinnych. W takich warunkach przy pierwszym ogrzaniu giną jedynie formy wegetatywne drobnoustrojów. W okresach 24 godzinnych pomiędzy poszczególnymi ogrzewaniami, próby inkubuje się w termostacie w temp. pokojowej. Kiełkują wówczas formy przetrwane drobnoustrojów. Powstałe z nich formy wegetatywne ulegają zniszczeniu w czasie następnego ogrzania. Dla pewności, że wszystkie przetrwalniki miały szansę wykiełkowania, po następnej 24 godzinnej przerwie przeprowadza się trzecie ogrzanie próby. Pasteryzacja Proces ten pozwala na częściowe wyjałowienie materiału i polega na jednorazowym podgrzaniu płynu do temp C przez 30 min. W warunkach przemysłowych stosuje się temp. wyższe ( C), krótszy czas pasteryzacji (sekundy) oraz szybkie schładzanie, w celu maksymalnego ograniczenia rozpadu składników odżywczych (witamin) zawartych w wyjaławianych produktach oraz uniknięcia zmian smaku i zapachu. Pasteryzuje się m.in. mleko, soki owocowe i warzywne, moszcz winny i piwo. Zabieg ten niszczy większość bakterii i innych drobnoustrojów (pierwotniaki, grzyby, glony, wirusy). Natomiast nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów oraz wirusy zapalenia wątroby typu B. Tych ostatnich nie usuwa także gotowanie. Gorące powietrze Metoda ta służy do sterylizacji przedmiotów opornych na działanie wysokiej temperatury. Wyjaławianie przeprowadza się w zakresie temperatur od C. Służą do tego celu urządzenia zwane sterylizatorami lub suszarkami. Przedmioty poddawane sterylizacji muszą być opakowane w celu ich ochrony przed wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym po zakończeniu sterylizacji. W praktyce najczęściej używa się do tego celu papieru lub specjalnych metalowych tubusów. Czas pracy suszarki zależy od zastosowanej temperatury, stopnia wypełnienia suszarki, czasu jej nagrzewania i oziębiania. W sterylizatorach wyposażonych w wentylatory przeciętny czas ekspozycji wsadu w temp C wynosi 60 minut, a czas cyklu pracy ok. 150 minut, natomiast w temp C czas ekspozycji wynosi 30 min. W sterylizatorach starego typu, tzw. suszarkach, nie mających wymuszonego obiegu powietrza, czas sterylizacji jest dłuższy. W C czas ekspozycji wsadu wynosi min. a pełny cykl pracy aparatu trwa kilka godzin. Wyjaławianie przez spalanie i opalanie. Spalanie służy do niszczenia materiałów i przedmiotów zakażonych drobnoustrojami chorobotwórczymi. Spala się np. plastikowe płytki Petriego z hodowlą zakaźnych

18 mikroorganizmów zwłoki zwierząt doświadczalnych. Opalanie nad płomieniem palnika stosuje się jako jałowienie drobnych przedmiotów nie ulegających spaleniu, takich jak ezy, druciki platynowe, igły preparacyjne, łopatki, skalpele. Ponadto opala się zawsze brzegi kolb i probówek, w celu zabezpieczenia hodowli przed zakażeniem z zewnątrz. Sterylizacja za pomocą radiacji Do wyjaławiania stosuje się dwa typy promieniowania jonizującego: beta i gamma. Promieniowanie gamma charakteryzuje się dużą przenikliwością, natomiast promieniowanie beta jest promieniowaniem elektronowym o dużej energii. Skuteczna dawka promieniowania gamma waha się w zakresie 0,1 1 megarada. Przy stosowaniu tego typu wyjaławiania należy zwrócić uwagę na właściwy dobór dawki. Zbyt mała dawka może spowodować, że wśród komórek bakterii, które przeżyły wyjaławianie, pojawią się mutanty o zmienionych właściwościach biologicznych. Niektóre z tych cech mogą okazać się niebezpieczne np. podwyższenie zjadliwości (zdolności wywoływania choroby). Praktycznie stosowana dawka sterylizująca jest duża i wynosi 2,5 3,0 megaradów. Należy także zwrócić uwagę na fakt, że promieniowanie jonizujące może powodować zmiany struktury związków chemicznych lub ich rozpad, co wiąże się ze zmianą cech chemicznych oraz odmiennym oddziaływaniem na drobnoustroje. Ponadto w wyniku napromieniowania związków organicznych powstają często nadtlenki, związki o podwójnych wiązaniach i wolne rodniki. Prowadzić to może do powstania produktów wykazujących działanie mutagenne i rakotwórcze. Wyjaławianie przez filtrację Proces ten polega na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze. Działa on na zasadzie sita i w związku z tym średnica porów filtra musi być mniejsza od średnicy komórek oraz form przetrwalnych. Dodatkowo, część mikroorganizmów zatrzymywana jest przez siły adsorpcyjne na powierzchni filtra. Wyjaławianie tego typu stosowane jest do płynów, których składniki charakteryzują się dużą wrażliwością na działanie czynników fizycznych. Metoda ta pozwala na usunięcie nie tylko żywych komórek, form przetrwalnych, ale także komórek martwych oraz ich części. Do najczęściej stosowanych filtrów należą: filtry z ziemi okrzemkowej, spiekanego szkła oraz filtry membranowe. Posiadają one zbyt małe pory, aby filtrację można było przeprowadzić z wykorzystaniem siły ciężkości. Konieczne jest więc zastosowanie nadciśnienia lub podciśnienia. Uzyskuje się je za pomocą pompy próżniowej. Filtr z ziemi okrzemkowej Znane są m. in. filtry Berkefelda. Zwykle są to świece otrzymane poprzez spiekanie w temp o C ziemi okrzemkowej. Charakteryzują się one dużą sprawnością działania. Skutecznie usuwają z filtrowanych roztworów formy wegetatywne i przetrwalne, jednakże nie zatrzymują wirusów. Wadą tych urządzeń jest też zbyt duża kruchość, wypłukiwanie ich cząstek do filtratu. Ponadto, część sączonego płynu pochłaniana jest przez filtr. W mikrobiologii stosowane są filtry o najdrobniejszych porach, o symbolu W. Świece sterylizuje się w autoklawie. Podczas filtracji sączony płyn nalewa się tak, aby świeca była w nim całkowicie zanurzona. Filtry ze szkła spiekanego Najpopularniejsze w tej grupie są filtry Schotta. Powstają one poprzez stopienie w odpowiedniej temperaturze sproszkowanego szkła. Są to lejki z warstwą filtracyjną na dnie. Do wyjaławiania roztworów stosowane są tylko filtry nr 5, o najmniejszej średnicy porów. Filtry ze szkła spiekanego charakteryzują się dużą sprawnością działania oraz brakiem efektów ubocznych w postaci adsorpcji sączonych płynów, wymywania składników filtrów

19 oraz zmiany ph przesączu. Ponadto mogą być one jałowione termicznie. Filtry tego typu zatrzymują wszystkie formy drobnoustrojów oprócz wirusów. Filtry membranowe Filtry (sączki) membranowe zbudowane są z pochodnych celulozy (np. z nitrocelulozy). Są to cienkie błony o grubości μm. Wielkość porów w filtrach jest zróżnicowana. Odpowiedni dobór sączka pozwala na całkowite usunięcie z roztworów drobnoustrojów. Filtry produkowane są w postaci krążków o różnych średnicach. Jałowi się je przez gotowanie w wodzie destylowanej. Następnie umieszcza w odpowiednich jałowych aparatach filtracyjnych. Sączenie odbywa się w podciśnieniu lub nadciśnieniu w zależności od konstrukcji aparatu. Sączony płyn nie ulega żadnym zmianom odczynu, nie jest adsorbowany przez filtr oraz do przesączu nie są uwalniane składniki filtra. Filtry membranowe są stosowane nie tylko do sterylizacji płynów, ale także w badaniu stanu sanitarnego wody, gdzie celem nie jest oczyszczenie z mikroorganizmów, lecz wydzielenie ich z wody i dalsza hodowla na specjalnych pożywkach. 2. Dezynfekcja Dezynfekcją nazywamy proces niszczenia wegetatywnych form drobnoustrojów za pomocą czynników chemicznych i fizycznych. Dezynfekcja nie niszczy wszystkich form przetrwanych. Celem dezynfekcji jest możliwie szybkie zabicie drobnoustrojów, ale głównym jej zadaniem jest wyeliminowanie mikroorganizmów chorobotwórczych z powierzchni sprzętów, podłóg, naczyń, pojemników z płynami, z części ciała ludzkiego (ręce, pole operacyjne), z ciała zwierząt.. A zatem dotyczy ona tych obiektów, które należy odkazić, nie mogąc poddać ich sterylizacji. Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych jest tak różny jak różna jest budowa chemiczna dezynfektantów. Środki dezynfekcyjne powodują bardzo istotne, nieodwracalne zmiany zarówno struktury jak i metabolizmu komórki bakteryjnej. Zmiany te mogą mieć charakter okresowego hamowania rozwoju drobnoustrojów, bądź ich całkowitego wyeliminowania. W związku z tym, środki dezynfekcyjne można podzielić na dwie grupy: a) środki bakteriostatyczne mające właściwości hamowania rozmnażania bakterii (po ich usunięciu bakterie jednak ponownie zaczynają się rozmnażać); b) środki bakteriobójcze, posiadające właściwości zabijania bakterii, a więc ich działanie jest nieodwracalne. Działanie dezynfektantów zależy od wielu czynników, do których należą : a) stężenie środka dezynfekcyjnego, b) czas działania, c) temperatura, d) obecność substancji organicznych w środowisku, e) wilgotność środowiska, f) odczyn środowiska, Ad a) Na szybkość procesu dezynfekcji ma wpływ stężenie środka dezynfekcyjnego. Im stężenie jest wyższe, tym proces przebiega szybciej. Nie jest to jednak zależność proporcjonalna, np. podwojenie stężenia fenolu skraca czas wymagany do zabicia wszystkich osobników w hodowli Salmonella paratyphi w przybliżeniu siedmiokrotnie.

20 Ad b) W celu wyznaczenia zakresu działania środka dezynfekcyjnego oznacza się przeżywalność drobnoustrojów jako funkcję czasu działania badanego dezynfektanta w określonym stężeniu i przy określonej gęstości badanej hodowli. Ad c) Wpływ temperatury na skuteczność procesu dezynfekcji wyraża się za pomocą tzw. współczynnika temperatury, według wzoru: Czas wymierania w temp. x Wsp. temp = Czas wymierania w temp. x + 10 Wartości współczynnika są tym wyższe im wyższa jest temperatura, w której przebiega proces. Ad. d ) Charakter wpływu obecności związków organicznych może być chemiczny bądź fizyczny, przy czym mogą zachodzić różnego rodzaju reakcje: 1. Środek dezynfekcyjny reaguje ze związkami organicznymi, co powoduje jego unieczynnienie. W sytuacji, gdy związki organiczne są konkurencyjne w stosunku do drobnoustrojów, w reakcjach może dojść do całkowitego związania dezynfektanta i pozbawienia go skuteczności np. chlor stosowany do dezynfekcji wody jest wiązany przez zanieczyszczające ją związki organiczne tak, że efektywne stężenie dezynfektanta jest znacznie niższe od zastosowanego. 2. Środek dezynfekcyjny może dawać, w wyniku reakcji ze związkami organicznymi związek nierozpuszczalny, czego skutkiem jest jego wypadanie z roztworu i wyeliminowanie ze środowiska. 3. Eliminacja środka dezynfekcyjnego ze środowiska może być wynikiem jego adsorpcji przez mające postać zawiesiny lub koloidu substancje organiczne. 4. Tłuszcze, fosfolipidy, niektóre kationy i aniony mogą unieczynniać środek dezynfekcyjny poprzez jego eliminację ze środowiska 5. Związki organiczne mogą tworzyć wokół komórki bakteryjnej warstwę o mniejszej zawartości wody utrudniając dostęp środowiska dezynfekcyjnego do komórki. Ad e) Duże znaczenie dla skuteczności dezynfekcji ma wilgotność środowiska, gdyż większość środków dezynfekcyjnych nie działa w środowisku suchym. Odpowiednia wilgotność umożliwia prawidłową kondensację czynnika dezynfekcyjnego na powierzchni komórek i wnikanie w głąb. Ad f) Stężenie jonów wodorowych wpływa nie tylko bezpośrednio na organizm bakteryjny, lecz również na same środki odkażające, bowiem dla wielu substancji dezynfekcyjnych charakterystyczna jest mniejsza aktywność form zjonizowanych niż niezdysocjowanych, np. fenol w środowisku alkalicznym jest zdysocjowany, co poważnie obniża jego właściwości bakteriobójcze. Istotnym problemem jest powstawanie drobnoustrojów opornych na środki dezynfekcyjne. Główną tego przyczyną jest stosowanie środków w stężeniach subtelnych. Przyczyną oporności może być adaptacja enzymatyczna. Enzymy indukcyjne biorące udział w rozkładzie środka dezynfekcyjnego powstają w komórce dopiero po zetknięciu się z odpowiednim związkiem lub jego analogiem. W okresie adaptacji wzrost bakterii ustaje, część bakterii zamiera, natomiast te, które przeżyły mają zdolność do enzymatycznego rozkładu (biodegradacji) dezynfektanta. Poddając dostatecznie dużą populację bakterii działaniu czynnika szkodliwego, jakim są środki dezynfekcyjne, wśród przeżywających

21 komórek znajdujemy mutanty charakteryzujące się zwiększoną opornością na stosowany czynnik, w stosunku do komórki macierzystej. Do najczęściej stosowanych chemicznych środków dezynfekcyjnych zaliczamy: 1) Kwasy i zasady silne środki dezynfekcyjne zabijają formy wegetatywne oraz formy przetrwalne. Stosowanie ich jest jednak ograniczone ze względu na niszczące działanie na przedmioty i materiały. Zastosowanie znalazły : a) mleko wapienne w postaci 20% zawiesiny wodorotlenku wapnia, b) 10% roztwory zasad do dezynfekcji powierzchniowej, c) 1-10% gorące roztwory węglanu sodu do dezynfekcji szkła laboratoryjnego, d) mydła, zwłaszcza bardziej alkaliczne mydło szare, których skuteczność zwiększają nienasycone kwasy tłuszczowe, 2) Środki utleniające Do grupy tej należą chlorowce i ich pochodne. Mechanizm ich działania polega na wydzielaniu zjonizowanego chlorowca lub tlenu po zetknięciu się z komórką. Są to: a) podchloryny zawierające około 20% czynnego chloru, b) chloraminy nieorganiczne oraz organiczne jak np. chloramina T zawierająca 12, 5% czynnego chloru, chloramina T zawierająca 29,5% czynnego chloru. Są to związki dobrze rozpuszczalne w wodzie, mało wrażliwe na światło, trwałe w temp. pokojowej, których działanie bakteriobójcze jest najsilniejsze przy ph 6-6,2. Do dezynfekcji rąk np. stosuje się 0,6 1% roztwory chloramin. Do odkażania powierzchni podłóg i stołów 5% roztwór. Do odkażania wody wystarczy 1mg/ dm 3. c) odpowiednie roztwory nadmanganianu potasu, d) 3% woda utleniona, e) 10% roztwór jodu (jodyna) lub połączenia organiczne jodu. Związki tego typu niszczą wirusy, bakterie i pierwotniaki, f) ozon działający bakterio- i wirusobójczo, stosowany do dezynfekcji wody. 3) Sole metali ciężkich Działają one zabójczo na drobnoustroje, zwłaszcza przy dłuższym czasie działania i przy zastosowaniu wyższych stężeń. W niższych stężeniach działanie niektórych metali ma charakter bakteriostatyczny. Ponieważ metale ciężkie są toksyczne dla organizmów wyższych, ich stosowanie jako dezynfektantów jest ograniczone. Pewne zastosowania znajdują związki organiczne rtęci jak merkurochrom, a także sole srebra. 4) Alkohole Mechanizm ich działania polega na denaturacji białek komórkowych, przy czym wpływ ma tu obecność wody, dlatego lepiej działają % roztwory alkoholu niż 90%. Jako środek dezynfekcyjny używany jest: a) alkohol etylowy w stęż. 70% do odkażania skóry i w mieszaninie z innymi związkami do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych, b) 70% mieszanina złożona w 50 % z etanolu i 20% propanolu, c) alkohol izopropylowy, benzylowy oraz glikol stosowane do dezynfekcji powietrza.

22 5) Związki fenolowe i pochodne fenolu Fenole i ich pochodne mają działanie bakteriobójcze. Fenole niszczą bakterie, ale i grzyby. Największą aktywność dezynfekcyjną mają w środowisku kwaśnym. Fenol jest związkiem toksycznym i drażniącym, z tego względu nie jest obecnie stosowany do dezynfekcji. Zastosowanie znajduje natomiast szereg związków fenolu. a) mieszanina związków fenolowych i szarego mydła zwana lizolem stosowana w 3-10% roztworze b) alkilowe pochodne fenoli o działaniu dezynfekcyjnym, tym silniejszym im dłuższy jest łańcuch alkilowy c) izomery drugo- i trzeciorzędowe, chlorofenole oraz arylofenole d) cały szereg preparatów handlowych zawierających chloroheksydyny. Chloroheksydyna działa na bakterie gramdodatnie i gramujemne, drożdżaki i wirusy. 6) Czwartorzędowe związki amoniowe Są to związki działające na wirusy, bakterie, drożdże i grzyby. Związki te charakteryzują się wysoką aktywnością powierzchniową. W wodzie ulegają dysocjacji na kompleksowe kationy i ujemnie naładowany jon chlorowca, który wzmaga aktywność bakteriobójcza. W użyciu znajduje się cały szereg preparatów zawierających różne stężenia związków amoniowych (np.sterinol) 7) Aldehydy W praktyce stosuje się aldehyd glutarowy i formaldehyd. Formaldehyd stosowany jest w 5% roztworze. Ma silne działanie bakteriobójcze pod warunkiem, że temperatura środowiska będzie niższa niż 40 0 C. Roztworem 40 % posługują się laboratoria i prosektoria. Materiały biologiczne utrwala się roztworem formaldehydu. Ponadto może on służyć do gazowej dezynfekcji pomieszczeń w stężeniu 1-2 mg/ dm 3 powietrza. Dla skuteczności dezynfekcji powietrza formaldehydem konieczna jest duża wilgotność sięgająca 80% Do fizycznych czynników dezynfekcji należy promieniowanie UV, które stosuje się głównie do dezynfekcji powietrza i dostępnych powierzchni. Silne działanie przeciwbakteryjne wykazuje promieniowanie o długości fali nm (szczególnie nm). Jednakże poszczególne gatunki i formy drobnoustrojów wykazują różną wrażliwość na działanie tego promieniowania. Metoda dezynfekcji powietrza promieniami nadfioletowymi jest skuteczna przy zachowaniu odpowiednich warunków i zależy od szeregu czynników: a) stopnia zanieczyszczenia powietrza cząstkami mechanicznymi, b) objętości napromieniowanego powietrza, c) intensywności ruchu powietrza, d) długości fal emitowanych przez promiennik, e) czasu napromieniowania, f) bezpośredniego padania promieniowania, g) wilgotności powietrza, h) odległości, na jaką działają promienie. Stosując odpowiednią dawkę promieniowania UV można uzyskać nawet efekt całkowitego wyjałowienia (sterylizacji).

23 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji parą wodną w autoklawie. Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali A). Zarodniki te zdolne są do przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji parą wodną pod zwiększonym ciśnieniem. 1. Z opakowań wyjąć torebki papierowe z krążkami Sporal A i umieścić w różnych miejscach komory autoklawu lub wewnątrz sterylizowanych materiałów. 2. Włączyć autoklaw (osoby posiadające uprawnienia do obsługi) i dokonać sterylizacji w ciągu 20 minut w temperaturze nie mniejszej niż C. 3. Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do probówki z bulionem (użyć sterylnej pęsety). 4. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni 5. W przypadku nieskutecznej sterylizacji w bulionie wystąpi zmętnienie, a na powierzchni podłoża pojawi się kożuch z komórek bakterii. Jeżeli sterylizacja była skuteczna bulion pozostanie klarowny. Zadanie 2. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji w suchym gorącym powietrzu. Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali S). Zarodniki te zdolne są do przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji w suchym i gorącym powietrzu. 1. Wyjąć z opakowania foliowego torebki papierowe z krążkami sporalu S 2. Sterylizować co najmniej 2 godziny w temp. 160 o C 3. Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do probówki z bulionem 4. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni 5. W przypadku nieskutecznej sterylizacji, w bulionie wystąpi zmętnienie i pojawi się kożuch na powierzchni pożywki. Jeżeli sterylizacja była skuteczna, bulion pozostanie klarowny. Zadanie 3. Zapoznanie się z podstawowym sprzętem służącym do sterylizacji a. autoklaw b. suszarka