COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0

COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 HCV DO BADAÑ DIAGNOSTYCZNYCH IN VITRO. Informacje AMPLICOR HCV HCV PREP 96 Tests P/N: 21111086 123 dotycz¹ce zamówienia Specimen Preparation Kit, ART: 11 1108 6 version 2.0 US: 83126 AMPLICOR HCV HCV CTL 8 Sets P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 US: 83131 AMPLICOR HCV HCV AMP 96 Tests P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 US: 83127 COBAS AMPLICOR 100 Tests P/N: 21111132 123 HCV DK HCV Detection Kit, ART: 11 1113 2 version 2.0 US: 83130 COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 US: 83276 COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 US: 83305 COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 Poni szy zestaw s³u y wykrywaniu HCV Internal Control amplifikowanej przy u yciu AMPLICOR HCV Amplification Kit, version 2.0. Detekcja HCV Internal Control jest opcj¹ zalecan¹ dla u ytkownika. COBAS AMPLICOR IC 100 Tests P/N: 20757608 122 Internal Control Detection Kit ART: 07 5760 8 US: 83281 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 1/42 P/N: 04498313 190

Przeznaczenie COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) jest testem jakoœciowym in vitro do wykrywania wirusa RNA zapalenia w¹troby typu C w próbkach klinicznych przy u yciu analizatora COBAS AMPLICOR Analyzer. Obecnoœæ HCV RNA œwiadczy o aktualnym zaka eniu HCV u chorych wykazuj¹cych kliniczne i/lub biochemiczne cechy choroby w¹troby. Niniejszy test do wykrywania HCV RNA w ludzkiej surowicy lub osoczu u ywa odwrotnej transkrypcji badanego RNA do wytworzenia komplementarnego DNA (cdna), amplifikacji badanego cdna przy u yciu ³añcuchowej reakcji polimerazy (PCR, Polymerase Chain Reaction) oraz hybrydyzacji kwasów nukleinowych. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 nie jest przeznaczony do badañ przesiewowych krwi ani produktów krwiopochodnych na obecnoœæ wirusa zapalenia w¹troby typu C. Podsumowanie i objaœnienie testu Wirus zapalenia w¹troby typu C uwa any jest za g³ówny czynnik etiologiczny odpowiedzialny za 90 95% przypadków wirusowego zapalenia w¹troby nie-a i nie-b po przetoczeniach 1,2. HCV jest jednoniciowym wirusem RNA zawieraj¹cym niæ sensown¹ z genomem licz¹cym oko³o 10 000 nukleotydów koduj¹cych 3000 aminokwasów 1. Jako wirus wystêpuj¹cy we krwi, HCV mo e byæ przenoszony przez krew i produkty krwiopochodne. Zaka enie HCV wystêpuje z du ¹ czêstoœci¹ u chorych po przeszczepach narz¹dowych, przetoczeniach krwi lub dostêpnych w handlu czynników krzepniêcia, jak równie u chorych nadu ywaj¹cych leków podawanych do ylnie i nara onych na przezskórn¹ drogê zaka enia, oraz u chorych dializowanych. Czêstoœæ wystêpowania zaka enia HCV oceniana w oparciu o badania immunoserologiczne waha siê od 0,6% w Kanadzie do 1,8% w Stanach Zjednoczonych 3. Obecnoœæ przeciwcia³ anty-hcv u chorych zaka onych HCV doprowadzi³a od opracowania swoistych dla nich testów immunoserologicznych 4,5. Wprowadzenie tego typu testów zmniejszy³o na ca³ym œwiecie czêstoœæ wystêpowania poprzetoczeniowego zapalenia w¹troby. Dodatkowe oznaczenia uzupe³niaj¹ce w celu dok³adniejszej oceny próbek, które wielokrotnie wykazywa³y pozytywny wynik w teœcie przesiewowym dla przeciwcia³, wykonywano przy u yciu testu typu RIBA (recombinant immunoblot assay). W przeprowadzonych niedawno badaniach stwierdzono, e interpretacja takiego testu uzupe³niaj¹cego uzale niona jest od stopnia zagro enia danego chorego. Na przyk³ad w obarczonej niskim ryzykiem populacji dawców krwi, test HCV RNA daje dodatni wynik jedynie w 50% próbek z dodatnim wynikiem testu RIBA 6,7,8. Tak wiêc dodatni wynik testu RIBA nie stanowi rzeczywistego wskaÿnika aktywnej infekcji HCV RNA poniewa chorzy po przebytym wirusowym zapaleniu w¹troby typu C mog¹ przez wiele lat wykazywaæ dodatni wynik testu anty-hcv 5. Ponadto niejednoznaczne wyniki testu uzupe³niaj¹cego obserwowano zarówno u niedawno zaka onych osób w trakcie serokonwersji, jak i u osób przewlekle zaka onych HCV 9,10. Badanie immunoserologiczne œwiadczy o aktualnej i/lub wczeœniejszej ekspozycji na zaka enie HCV, ale nie jest w stanie rozró niæ tych dwóch przypadków. Co wiêcej, w przypadkach ostrego zaka enia HCV, chorzy mog¹ nie wytworzyæ przeciwcia³ skierowanych przeciwko HCV 11, co uniemo liwia rozpoznanie aktualnego zaka enia HCV przy u yciu technik immunoserologicznych. Ewentualnie, wykrycie HCV RNA przy u yciu testów oznaczaj¹cych kwas nukleinowy mo e dostarczyæ dowodów aktualnie trwaj¹cego zaka enia. U ywaj¹c testów oznaczaj¹cych kwas nukleinowy mo liwe staje siê wykrycie wiremii HCV przed serokonwersj¹ immunologiczn¹ 12,13. Poniewa testy oznaczaj¹ce kwas nukleinowy umo liwiaj¹ bezpoœrednie wykrycie HCV RNA, tj. niezale nie od stanu immunologicznego chorego, tego typu test ma du ¹ wartoœæ w wykrywaniu HCV RNA u chorych z obni on¹ odpornoœci¹ 8. 2/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Zasady procedury Wewnêtrzna kontrola Przygotowanie próbki Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 oparty jest na z piêciu g³ównych procesach: przygotowanie próbki; odwrotna transkrypcja badanego RNA w celu wytworzenia komplementarnego DNA (cdna) 14 ; amplifikacja PCR 14 badanego cdna przy u yciu swoistych odcinków startowych (primerów) komplementarnych dla HCV; hybrydyzacja amplifikowanych produktów z oligonukleotydowymi sondami swoistymi dla badanego materia³u; oraz wykrywanie amplifikowanych produktów zwi¹zanych z sondami przy u yciu pomiarów kolorymetrycznych. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 umo liwia równoczesn¹ odwrotn¹ transkrypcjê i amplifikacjê PCR badanego HCV oraz docelowego RNA z HCV Internal Control. Odczynnik Master Mix zawiera parê primerów swoistych zarówno dla HCV RNA jak i RNA z HCV Internal Control. Amplifikowany DNA oznacza siê przy u yciu oligonukleotydowych sond swoistych dla badanego materia³u, pozwalaj¹cych na niezale n¹ identyfikacjê amplikonu zarówno HCV jak i HCV Internal Control. W procesach amplifikacji opartych na metodach enzymatycznych, takich jak PCR, inhibitory, które mog¹ byæ obecne w próbce klinicznej, mog¹ zmniejszaæ wydajnoœæ amplifikacji. COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 uzupe³niono o kontrolê wewnêtrzn¹ HCV Internal Control aby umo liwiæ identyfikacjê poddanych obróbce próbek zawieraj¹cych substancje, które mog¹ zak³ócaæ amplifikacjê PCR. HCV Internal Control jest transkryptem RNA zawieraj¹cym obszar wi¹zania primerów identyczny z badan¹ sekwencj¹ HCV, losow¹ wewnêtrzn¹ sekwencjê o d³ugoœci i sk³adzie zasad podobnej do badanej sekwencji HCV, oraz unikalny obszar wi¹zania primerów, który odró nia HCV Internal Control od badanego amplikonu. Powy sze cechy wybrano, aby zapewniæ równowa n¹ amplifikacjê HCV Internal Control i badanego RNA HCV. HCV RNA izoluje siê z surowicy lub osocza poprzez lizê cz¹steczek wirusa przy u yciu czynnika chaotropowego, a nastêpnie str¹cenie RNA alkoholem. RNA jest ponownie zawieszany w rozcieñczalniku do próbki. RNA z HCV Internal Control, wprowadzany do ka dej próbki wraz z odczynnikiem lizuj¹cym s³u y jako kontrola ekstrakcji, amplifikacji i detekcji dla ka dej indywidualnie przygotowywanej próbki. Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji RNA dla HCV uzale niony jest od identyfikacji regionów w obrêbie genomu HCV wykazuj¹cych maksymalny konserwatyzm spoœród ró nych genotypów HCV 15,16,17. W zwi¹zku z tym odpowiednia selekcja primerów i sondy jest kluczowym elementem decyduj¹cym o zdolnoœci testu do wykrycia wszystkich genotypów (Zobacz punkt Ocena skutecznoœci w badania nieklinicznych, badanie reprezentatywnoœci genotypu HCV). Region 5' nie ulegaj¹cy translacji (UTR, 5'-untranslated region) genomu HCV zidentyfikowano jako najbardziej konserwatywn¹ sekwencjê RNA spoœród znanych genotypów HCV 18,19. Do okreœlenia sekwencji 244 nukleotydów w obrêbie wysoce konserwatywnego obszaru 5'-UTR genomu HCV, COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 u ywa primerów KY78 i KY80 13. Sekwencje sondy wychwytuj¹cej i rimerów znajduj¹ siê w najbardziej konserwatywnych domenach w obrêbie 5'-UTR 18. Odwrotna transkrypcja Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji wykonywane s¹ przy u yciu termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Thermus thermophilus (rtth pol). W obecnoœci manganu (Mn 2+ ) i w odpowiednich warunkach uk³adu buforowego, rtth pol wykazuje aktywnoœæ zarówno odwrotnej transkryptazy, jak i polimerazy DNA 14. Umo liwia to prowadzenie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Poddane obróbce próbki dodaje siê do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (A-tubes), gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja PCR. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 3/42

Primer inicjuj¹cy transkrypcjê nici sensownej, okreœlany jako primer antysensowny (KY78) jest biotynylowany na koñcu 5'; primer inicjuj¹cy transkrypcjê nici antysensownej, okreœlany jako primer sensowny (KY80) nie jest biotynylowany. Mieszaninê reakcyjn¹ podgrzewa siê, aby umo liwiæ primerowi antysenswnemu swoiste zwi¹zanie siê z docelowym RNA HCV oraz docelowym RNA HCV Internal Control. W obecnoœci Mn 2+ i nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp, deoxynucleoside triphosphates), w³¹czaj¹c trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), rtth pol wyd³u a primer zwi¹zany z nici¹ RNA tworz¹c niæ DNA (cdna) komplementarn¹ do badanego RNA. Amplifikacja badanego DNA Po zakoñczeniu odwrotnej transkrypcji badanego HCV i RNA HCV Internal Control, mieszania reakcyjna jest podgrzewana aby umo liwiæ denaturacjê hybrydy RNA:cDNA i ods³oniæ sekwencje docelowe primerów. Po och³odzeniu mieszaniny i swoistym zwi¹zaniu primera sensownego (KY80) z nici¹ cdna, rtth pol wyd³u a primer syntetyzuj¹c drug¹ niæ DNA. Proces ten koñczy pierwszy cykl PCR, dostarczaj¹c dwuniciowej kopii DNA badanego regionu HCV i RNA HCV Internal Control. Mieszanina reakcyjna podgrzewana jest po raz kolejny w celu rozdzielenia powsta³ego dwuniciowego DNA i ods³oniêcia sekwencji docelowych primerów. Po och³odzeniu mieszaniny, primery KY78 i KY80 wi¹ ¹ siê z badanym DNA. W obecnoœci Mn 2+ i nadmiaru dntps, rtth pol wyd³u a primery zwi¹zane z niæmi DNA zgodnie z badanym wzorcem wytwarzaj¹c cz¹steczkê dwuniciowego DNA d³ugoœci 244 par zasad nazywan¹ amplikonem. Analizator COBAS AMPLICOR Analyzer automatycznie powtarza powy szy proces przez okreœlon¹ liczbê cykli, w ka dym z nich podwajaj¹c rzeczywist¹ iloœæ DNA amplikonu. Wymagana liczba cykli w analizatorze COBAS AMPLICOR jest wstêpnie zaprogramowana. Amplifikacja zachodzi jedynie w obszarze genomu HCV miêdzy primerami; ca³oœæ genomu nie ulega amplifikacji. Amplifikacja wybiórcza Selektywn¹ amplifikacjê badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej w teœcie COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 uzyskuje siê dziêki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozydaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje rozk³ad nici DNA zawieraj¹cych dezoksyurydynê 20, nie wp³ywaj¹c na DNA zawieraj¹cy dezoksytymidynê. Dezoksyurydyny nie stwierdza siê w wystêpuj¹cym w naturze DNA, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie z uwagi na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego spoœród dntps w odczynniku Master Mix; dlatego te jedynie amplikon zawiera dezoksyurydynê. Dezoksyurydyna sprawia, e przed amplifikacj¹ docelowego DNA amplikon zanieczyszczaj¹cy próbkê staje siê podatny na rozk³ad przez enzym AmpErase. Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master Mix katalizuje rozk³ad DNA zawieraj¹cego dezoksyurydynê w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierœcienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Z chwil¹ podgrzania w czasie pierwszego etapu cyklu termicznego w alkalicznym ph odczynnika Master Mix, ³añcuch DNA amplikonu ulega rozerwaniu w pozycji dezoksyurydyny, przez co uniemo liwia amplifikacjê DNA. Enzym AmpErase ulega inaktywacji w temperaturach przekraczaj¹cych 55 C, tj. w trakcie kolejnych etapów cyklu termicznego, i dlatego nie niszczy badanego amplikonu. Pozosta³y enzym jest po amplifikacji denaturowany przez dodanie roztworu denaturuj¹cego (Denaturation Solution), zapobiegaj¹c degradacji docelowych amplikonów. W przypadku COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 wykazano, e enzym AmpErase inaktywuje co najmniej 10 3 kopii amplikonu HCV zawieraj¹cego dezoksyurydynê w przeliczeniu na jedn¹ reakcjê PCR. 4/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Reakcja hybrydyzacji Reakcja detekcji Odczynniki Po amplifikacji PCR, Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie dodaje roztwór denaturuj¹cy (Denaturation Solution) do probówek typu A-tubes w celu chemicznej denaturacji amplikonu HCV oraz amplikonu HCV Internal Control i uzyskania jednoniciowego DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi siê nastêpnie do kubeczków u ywanych do oznaczeñ (D-cups). Do poszczególnych pojemników typu D-cups dodaje siê zawiesiny magnetycznych cz¹steczek pokrytych sond¹ oligonukleotydow¹ swoist¹ dla HCV (KY150) lub HCV Internal Control (SK535). Znakowane biotyn¹ amplikony HCV i HCV Internal Control ulegaj¹ hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materia³u sondami oligonukleotydowymi zwi¹zanymi z cz¹steczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja amplikonów ze swoist¹ dla badanego materia³u sond¹ zwiêksza ogóln¹ swoistoœæ testu. Po reakcji hybrydyzacji Analizator COBAS AMPLICOR przemywa cz¹steczki magnetyczne w pojemnikach typu D-cup w celu usuniêcia niezwi¹zanego materia³u, a nastêpnie dodaje koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyn¹. Koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyn¹ wi¹ e siê ze znakowanymi biotyn¹ amplikonami, które uleg³y hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materia³u (HCV lub Internal Control) sondami oligonukleotydowymi zwi¹zanymi z cz¹steczkami magnetycznymi. Analizator COBAS AMPLICOR usuwa niezwi¹zany kompleks p³ucz¹c cz¹steczki magnetyczne, a nastêpnie do ka dego pojemnika typu D-cup dodaje roztwór substratów zawieraj¹cy nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynê (TMB). W obecnoœci nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa zwi¹zana z cz¹steczkami katalizuje utlenianie TMB, tworz¹c barwny kompleks, którego absorbancja mierzona jest przez analizator COBAS AMPLICOR przy d³ugoœci fali 660 nm. AMPLICOR HCV HCV PREP 96 testów P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 Zestaw do przygotowania próbki AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83126 HCV LYS, v2.0 (Odczynnik lizuj¹cy HCV, wersja 2.0) 8 x 6,9 ml Xn Bufor Tris-HCl 68% tiocyjanian guanidyny 3% ditiotreitol < 1% glikogen + 68% (udzia³ wagowy) tiocyjanian guanidyny Produkt szkodliwy HCV DIL, v2.0 (Rozcieñczalnik próbki HCV, wersja 2.0) 8 x 4,8 ml Bufor Tris-HCl < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 5/42

HCV IC, v2.0 (Kontrola wewnêtrzna HCV, wersja 2.0) 8 x 0,1 ml < 0,001% niezakaÿny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawieraj¹cy sekwencje wi¹ ¹ce primery HCV oraz unikalny obszar wi¹ ¹cy sondê < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu AMPLICOR HCV HCV CTL 8 zestawów P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 Zestaw kontroli AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83131 NHP [Osocze ujemne (ludzkie)] 8 x 0,6 ml Ludzkie osocze, wykazuj¹ce ujemny wynik testów licencjonowanych przez US FDA w kierunku przeciwcia³ przeciw HCV, HIV-1/2, antygenowi HIV p24 oraz HBsAg; brak obecnoœci HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA przy u yciu metod PCR 0,1% ProClin 300 HCV ( ) C, v2.0 [Kontrola HCV ( ), wersja 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu HCV (+) C, v2.0 [Kontrola HCV (+), wersja 2.0] 8 x 0,1 ml < 0,001% niezakaÿny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawieraj¹cy sekwencje HCV < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu AMPLICOR HCV HCV AMP 96 testów P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 Zestaw do amplifikacji AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (G³ówny rozcieñczalnik HCV, wersja 2.0) 8 x 0,7 ml Bufor Bicine 16% DMSO Glicerol < 0,01% rtth polimeraza DNA (rtth pol, bakteryjna) Octan potasu < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% primery KY78 i KY80 (jeden z nich biotynylowany) < 0,01% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozydaza) (bakteryjny) 0,05% azydek sodu 6/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus HCV Mn 2+, v2.0 (Roztwór manganu HCV, wersja 2.0) 8 x 0,1 ml < 2% mangan Kwas octowy Barwnik amarantowy 0,05% azydek sodu COBAS AMPLICOR HCV DK 100 testów P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 Zestaw do detekcji COBAS AMPLICOR, wersja 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (Zawiesina sondy 1 HCV, wersja 2.0) 1 x 100 testów Bufor MES < 0,4% zawiesina Dynabeads (cz¹steczki paramagnetyczne) pokrytych oligonukleotydow¹ sond¹ wychwytuj¹c¹, swoist¹ dla HCV (KY150) 0,09% azydek sodu CX4, v2.0 (Zawiesina sondy 2 HCV, wersja 2.0) Bufor fosforanu sodu < 0,2% œrodek zwiêkszaj¹cy rozpuszczalnoœæ 42,2% tiocyjanian sodu Xn 42,2% (udzia³ wagowy) tiocyjanian sodu + 1 x 100 testów Produkt szkodliwy COBAS AMPLICOR DK 100 testów P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 Zestaw odczynników do wykrywania COBAS AMPLICOR US: 83276 DN4 (Roztwór denaturuj¹cy) Xi 1,6% wodorotlenek sodu EDTA B³êkit tymolowy + 1,6% (udzia³ wagowy) wodorotlenek sodu 1 x 100 testów Produkt dra ni¹cy CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) 1 x 100 testów Bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej Albumina surowicy wo³owej (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 7/42

SB3 (Substrat A) Roztwór kwasu cytrynowego 0,01% nadtlenek wodoru 0,1% ProClin 150 SB (Substrat B) 5 x 75 testów 5 x 5 ml 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB) 40% dimetyloformamid (DMF) T 40% (udzia³ wagowy) dimetyloformamid (DMF) Produkt toksyczny R: 61-20/21-36 Mo e dzia³aæ szkodliwie na dziecko w ³onie matki. Dzia³a szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skór¹. Dzia³a dra ni¹co na oczy. S: 53-45 Unikaæ nara enia - przed u yciem zapoznaæ siê z instrukcj¹. W przypadku awarii lub je eli Ÿle siê poczujesz, niezw³ocznie zasiêgnij porady lekarza - je eli to mo liwe, poka etykietê. COBAS AMPLICOR CN4 200 testów P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 Odczynnik do wykrywania koniugatu COBAS AMPLICOR US: 83305 CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) 2 x 100 testów Bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej Albumina surowicy wo³owej (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 testów P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 Bufor p³ucz¹cy COBAS AMPLICOR US: 83314 WB (10X koncentrat p³ucz¹cy) < 2% bufor fosforanowy < 9% chlorek sodu EDTA < 2% detergent 0,5% ProClin 300 2 x 250 testów 8/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Ostrzeżenia i środki ostrożności Do badañ diagnostycznych in vitro. Niniejszy test przeznaczony jest do u ycia z surowic¹ lub osoczem pobranym od ludzi wy³¹cznie przy u yciu œrodków przeciwkrzepliwych EDTA lub ACD. Wykazano, e heparyna hamuje PCR i dlatego nie mo e byæ stosowana w niniejszej procedurze. Nie pipetowaæ ustami. W obszarach, gdzie prowadzone s¹ prace laboratoryjne nie wolno spo ywaæ posi³ków, piæ napojów ani paliæ papierosów. W czasie pos³ugiwania siê próbkami i odczynnikami z zestawów nale y ubraæ jednorazowe rêkawiczki ochronne, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne. Po u yciu próbek i odczynników z zestawów nale y dok³adnie umyæ rêce. Pobieraj¹c próbki z butelek zawieraj¹cych odczynniki nale y unikaæ ich zanieczyszczenia bakteriami i rybonukleaz¹. Zaleca siê stosowanie sterylnych pipet jednorazowych i koñcówek do pipet pozbawionych RNazy. Nie nale y mieszaæ odczynników z ró nych serii produkcyjnych lub ró nych butelek tej samej serii. Niewykorzystane odczynniki i odpady nale y usuwaæ zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi i lokalnymi. Nie nale y u ywaæ zestawu po up³ywie daty jego wa noœci. Karty charakterystyki bezpieczeñstwa materia³u (MSDS, Material Safety Data Sheets) dostêpne s¹ na ¹danie w lokalnym przedstawicielstwie firmy Roche. Praca w laboratorium musi zachodziæ w sposób jednokierunkowy, z pocz¹tkiem w obszarze przedamplifikacyjnym i z jednokierunkowym ruchem w stronê obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynnoœci przed procesem amplifikacji musz¹ zaczynaæ siê od przygotowania odczynników, a nastêpnie zaœ przygotowania próbki. Materia³y i wyposa enie musz¹ byæ przeznaczone wy³¹cznie od okreœlonej czynnoœci przed procesem amplifikacji i nie wolno u ywaæ ich do innych czynnoœci ani przemieszczaæ miêdzy obszarami. W ka dym z obszarów konieczne jest u ywanie rêkawiczek, które nale y zmieniæ przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposa enia i materia³ów u ytych do przygotowania odczynników nie wolno u ywaæ w czynnoœciach zwi¹zanych z przygotowaniem próbki, pipetowaniem, obróbk¹ amplifikowanego DNA ani innych Ÿróde³ badanego DNA. Materia³y i wyposa enie zwi¹zane z etapem po amplifikacji musz¹ przez ca³y okres czasu pozostawaæ w obszarze poamplifikacyjnym. Próbki nale y traktowaæ jako potencjalnie zakaÿne, stosuj¹c laboratoryjne procedury bezpieczeñstwa podobne do wymienionych w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 oraz dokumencie M29-A CLSI 22. Nale y dok³adnie czyœciæ i dezynfekowaæ wszystkie powierzchnie robocze przy u yciu œwie o sporz¹dzonego 0,5% roztworu podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. Uwaga Dostêpne na rynku typowe p³yny wybielaj¹ce do zastosowania w gospodarstwach domowych zawieraj¹ podchloryn sodu o stê eniu 5,25%. Rozcieñczenie wybielacza przeznaczonego do gospodarstw domowych w stosunku 1:10 pozwoli uzyskaæ 0,5% roztwór podchlorynu sodu. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 9/42

PRZESTROGA: Niniejszy zestaw zawiera sk³adnik (NHP) otrzymany z ludzkiej krwi. Materia³ Ÿród³owy zbadano przy u yciu testów zaaprobowanych przez US FDA, nie stwierdzaj¹c odczynów w kierunku obecnoœci przeciwcia³ przeciwko HCV, przeciwcia³ przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 ani antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia w¹troby typu B (HBsAg, Hepatitis B Surface Antigen). Badania ujemnego osocza ludzkiego przy u yciu metod PCR nie wykry³y obecnoœci HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA. adna ze znanych metod badania nie mo e zaoferowaæ ca³kowitej pewnoœci, e produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie bêd¹ przenosiæ czynników zakaÿnych. Dlatego te ka dy materia³ pochodzenia ludzkiego nale y traktowaæ jako potencjalnie zakaÿny. NHP nale y traktowaæ jako potencjalnie zakaÿne, stosuj¹c laboratoryjne procedury bezpieczeñstwa podobne do przedstawionych w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 oraz dokumencie M29-A CLSI 22. Nale y dok³adnie czyœciæ i dezynfekowaæ wszystkie powierzchnie robocze przy u yciu œwie o sporz¹dzonego 0,5% roztworu podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. HCV IC, v2.0; HCV DIL, v2.0; HCV MMX, v2.0; HCV Mn 2+, v2.0; HCV ( ) C, v2.0; HCV (+) C, v2.0 i CX PS1, v2.0 zawieraj¹ azydek sodu. Azydek sodu mo e wchodziæ w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z o³owiu lub miedzi, tworz¹c silnie wybuchowe azydki metali. Usuwaj¹c roztwory zawieraj¹ce azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, nale y sp³ukaæ rury du ¹ objêtoœci¹ wody aby zapobiec nagromadzeniu azydków. U ywaj¹c HCV LYS, v2.0; HCV MMX, v2.0; CX4, v2.0, DN4, CN4, SB3, SB oraz substratu roboczego (mieszanina odczynnika SB3 i SB) nale y za³o yæ okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne i rêkawiczki jednorazowe. Nale y unikaæ kontaktu powy szych materia³ów ze skór¹, oczami oraz b³onami œluzowymi. W razie kontaktu nale y natychmiast przemyæ nara one miejsce du ¹ iloœci¹ wody. Je eli nie zostan¹ podjête odpowiednie œrodki, mo e dojœæ do oparzeñ. W razie rozlania powy szych odczynników, przed wytarciem plam nale y rozcieñczyæ je wod¹. Nale y unikaæ kontaktu SB i substratu roboczego ze skór¹ i b³onami œluzowymi. W razie kontaktu ze skór¹ nale y natychmiast przemyæ nara one miejsce du ¹ iloœci¹ wody. Dimetyloformamid zawarty w SB i substrat roboczy mo e wywieraæ szkodliwe dzia³anie na p³ód, a tak e opisywano dzia³ania toksyczne po przyjêciu wysokich dawek doustnych. Nale y unikaæ kontaktu ze skór¹, wdychania dymu i doustnego spo ycia dimetyloformamidu. W razie kontaktu ze skór¹, miejsce nara one nale y dok³adnie umyæ myd³em i wod¹ oraz niezw³ocznie zasiêgn¹æ porady lekarza. Nie wolno dopuœciæ do kontaktu HCV LYS, v2.0, zawieraj¹cego tiocyjanian guanidyny ani CX4, v2.0 zawieraj¹cego tiocyjanian sodu z roztworem podchlorynu sodu (wybielacz). Tego typu mieszanina mo e powodowaæ powstanie silnie toksycznego gazu. Do próbek i preparatu kontrolnego nale y u ywaæ zakrêcanych probówek, aby zapobiec rozlewaniu siê i potencjalnej kontaminacji miêdzy próbkami. Nie nale y stosowaæ probówek z zatrzaskowym zamkniêciem. 10/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Wymagania dotycz¹ce przechowywania i obchodzenia siê Odczynników nie wolno zamra aæ. HCV LYS, v2.0, HCV DIL, v2.0 i HCV IC, v2.0 przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki przechowywane w zamkniêtym opakowaniu s¹ trwa³e do czasu podanej daty wa noœci. Po otwarciu opakowania, pozosta³e po badaniu odczynniki nale y wyrzuciæ. Przechowywanie HCV LYS, v2.0 w temperaturze 2 8 C prowadzi do powstania osadu. Aby rozpuœciæ osad, zestaw przed u yciem nale y ogrzaæ w temperaturze 25-37 C i dok³adnie wymieszaæ. HCV LYS, v2.0 nale y ogrzewaæ przez okres maksymalnie 30 minut, a nastêpnie dok³adnie wymieszaæ do czasu rozpuszczenia kryszta³ów. Ka d¹ butelkê HCV LYS, v2.0 nale y przed u yciem oceniæ na bia³ym tle czy nie wyst¹puje ó³ty kolor lub cechy nieszczelnoœci. W razie ó³tego zabarwienia zawartoœci butelki lub cech jej nieszczelnoœci, nie nale y u ywaæ butelki do badañ. Nale y skontaktowaæ siê z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany zestawu. Po otwarciu opakowania, pozosta³e po badaniu odczynniki nale y wyrzuciæ. Roboczy czynnik lizujacy (przygotowany przez dodanie HCV IC, v2.0 do HCV LYS, v2.0) nale y przechowywaæ w temperaturze pokojowej i u yæ w ci¹gu 8 godzin od chwili przygotowania. HCV MMX, v2.0 i HCV Mn 2+, v2.0 nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki s¹ trwa³e do czasu podanej daty wa noœci. Po otwarciu opakowania, pozosta³e po badaniu odczynniki nale y wyrzuciæ. G³ówna mieszanina robocza (przygotowana przez dodanie HCV Mn 2+, v2.0 do HCV MMX, v2.0) nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C i u yæ w ci¹gu 4 godzin od chwili przygotowania. NHP, HCV ( ) C, v2.0 i HCV (+) C, v2.0 nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki s¹ trwa³e do czasu podanej daty wa noœci. Po otwarciu opakowania, pozosta³e po badaniu odczynniki nale y wyrzuciæ. CX PS1, v2.0 i CX4, v2.0 nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki s¹ trwa³e do czasu podanej daty wa noœci. Po wymieszaniu CX PS1, v2.0 i CX4, v2.0, odczynnik roboczy zachowuje trwa³oœæ przez 30 dni w temperaturze 2 8 C. Odczynnik roboczy stosowaæ mo na w ci¹gu maksymalnie 6 cykli pracy urz¹dzenia (12 godzin/cykl), a miêdzy poszczególnymi cyklami nale y go przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. DN4 nale y przechowywaæ w temperaturze 2 25 C. DN4 jest trwa³y do czasu podanej daty wa noœci. Po otwarciu opakowania, DN4 jest trwa³y przez 30 dni w temperaturze 2 8 C lub do up³ywu daty wa noœci. DN4 stosowaæ mo na w ci¹gu maksymalnie szeœciu cykli pracy urz¹dzenia (12 godzin/cykl), a miêdzy poszczególnymi cyklami nale y go przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. CN4 nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. CN4 jest trwa³y do czasu podanej daty wa noœci. Po otwarciu opakowania, CN4 jest trwa³y przez 30 dni w temperaturze 2 8 C lub do up³ywu daty wa noœci. CN4 stosowaæ mo na w ci¹gu szeœciu maksymalnie cykli pracy urz¹dzenia (12 godzin/cykl), a miêdzy poszczególnymi cyklami nale y go przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. SB3 i SB nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. Wspomniane odczynniki przechowywane w zamkniêtym opakowaniu s¹ trwa³e do czasu podanej daty wa noœci. Substrat roboczy musi byæ przygotowywany codziennie poprzez zmieszanie SB3 z SB. W analizatorze COBAS AMPLICOR, substrat roboczy jest trwa³y przez 16 godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie nale y poddawaæ dzia³aniu metali, œrodków utleniaj¹cych lub bezpoœredniego œwiat³a. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 11/42

Dostarczane materia³y WB nale y przechowywaæ w temperaturze 2 30 C. WB jest trwa³y do czasu podanej daty wa noœci. WB nale y oceniæ przed rozcieñczeniem i w razie koniecznoœci ogrzaæ w temperaturze 30 37 C celem rozpuszczenia ewentualnego osadu. Roboczy bufor p³uczacy (1X), przygotowany przez rozcieñczenie WB wod¹ destylowan¹ lub dejonizowan¹ w stosunku 1:10 nale y przechowywaæ w temperaturze 2 25 C w zbiorniku na bufor p³ucz¹cy COBAS AMPLICOR. Bufor ten jest trwa³y przez okres 2 tygodni od daty przygotowania. Miêdzy cyklami pracy urz¹dzenia, czêœciowo zu yte odczynniki do badania nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C. Przed wprowadzeniem do analizatora COBAS AMPLICOR odczynników z otwartych opakowañ lub odczynników roboczych, nale y sprawdziæ ich datê wa noœci. AMPLICOR HCV HCV PREP P/N: 21111086 123 Specimen Preparation Kit, version 2.0 ART: 11 1108 6 Zestaw do przygotowania próbki US: 83126 AMPLICOR HCV,wersja 2.0 HCV LYS, v2.0 (Odczynnik lizujacy HCV, wersja 2.0) HCV DIL, v2.0 (Rozcieñczalnik próbki HCV, wersja 2.0) HCV IC, v2.0 (Kontrola wewnêtrzna HCV, wersja 2.0) AMPLICOR HCV HCV CTL P/N: 21111175 123 Controls Kit, version 2.0 ART: 11 1117 5 Zestaw kontroli AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83131 NHP [Osocze ujemne (ludzkie)] HCV ( ) C, v2.0 [Kontrola HCV ( ), wersja 2.0] HCV (+) C, v2.0 [Kontrola HCV (+), wersja 2.0] AMPLICOR HCV HCV AMP P/N: 21111094 123 Amplification Kit, version 2.0 ART: 11 1109 4 Zestaw do amplifikacji AMPLICOR HCV, wersja 2.0 US: 83127 HCV MMX, v2.0 (G³ówny rozcieñczalnik HCV, wersja 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (Roztwór manganu HCV, wersja 2.0) COBAS AMPLICOR HCV DK P/N: 21111132 123 HCV Detection Kit, version 2.0 ART: 11 1113 2 Zestaw do detekcji COBAS AMPLICOR, wersja 2.0 US: 83130 CX PS1, v2.0 (Zawiesina sondy 1 HCV, wersja 2.0) CX4, v2.0 (Zawiesina sondy 2 HCV, wersja 2.0) 12/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus COBAS AMPLICOR DK P/N: 20757470 122 Detection Reagents Kit ART: 07 5747 0 Zestaw odczynników do wykrywania US: 83276 COBAS AMPLICOR DN4 (Roztwór denaturuj¹cy) CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: 20764213 123 Conjugate Detection Reagent ART: 07 6421 3 Odczynnik do wykrywania koniugatu US: 83305 COBAS AMPLICOR CN4 (Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 Bufor p³uczacy COBAS AMPLICOR US: 83314 WB (10X koncentrat p³ucz¹cy) Materia³y wymagane, lecz niedostarczane Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania odczynników Pierœcieñ (A-ring) przeznaczony do aparatu COBAS AMPLICOR z wbudowanymi 12 probówkami (A-tube) (ART: 10 4563 6; P/N: 21045636001) Statyw pierœcienia (A-ring) przeznaczony do aparatu COBAS AMPLICOR Plastikowy worek do wielokrotnego zamykania Pipeta Eppendorf Multipette z pojemnikiem 1,25 ml Combitip (sterylny, indywidualnie pakowany) Pipetory (o pojemnoœci 50 µl i 100 µl)* z barier¹ aerozolow¹ lub koñcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy Rêkawice jednorazowe bezpudrowe Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania próbek i kontroli Polipropylenowe probówki z nakrêtk¹ o pojemnoœci 1,5 ml, sterylne, nie silikonowane, sto kowe (Sarstedt 72.692.005 lub równowa ne)** Stojaki do próbówek (Sarstedt 93.1428 lub równowa ne) 95% etanol, o klasie czystoœci odczynnika do zastosowañ w mikrobiologii lub histologii (œwie o rozcieñczony do 70% przy u yciu wody destylowanej lub dejonizowanej) Alkohol izopropylowy, o stopniu czystoœci odczynnika chemicznego 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 13/42

Ja³owe pipety transferowe o cienkiej koñcówce, wolne od RNazy Sterylne, jednorazowe, polistyrenowe pipety serologiczne (5 ml, 10 ml i 25 ml) Pipetory (pojemnoœæ 20 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 600 µl i 1000 µl)* z barier¹ aerozolow¹ lub koñcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy Mikrowirówka (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub równorzêdna Mieszad³o wibracyjne 60 C ± 2 C suchy blok grzejny Rêkawice jednorazowe bezpudrowe Po amplifikacji obszar amplifikacji/detekcji Analizator COBAS AMPLICOR z drukark¹ Instrukcja obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR Instrukcja u ytkowania COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 Stojaki na pojemniki typu D-cup (ART: 10 4564 4: P/N: 21045644001) Woda destylowana lub dejonizowana Pipety serologiczne o pojemnoœci 5 ml Rêkawice jednorazowe bezpudrowe * Dok³adnoœæ pipetorów musi wahaæ siê w zakresie 3% podanej objêtoœci. Koñcówki z barier¹ aerozolow¹ lub dodatnim wypieraniem wolne od RNazy musz¹ byæ zastosowane zgodnie z przeznaczeniem, aby unikn¹æ ska enia krzy owego próbki i amplikonu. ** Do przygotowywania próbek badanych i kontrolnych konieczne jest stosowanie zakrêcanych probówek, aby zapobiec rozchlapaniu i potencjalnej kontaminacji miêdzy próbkami badanymi i kontrolnymi. Nie nale y stosowaæ probówek z zatrzaskowym zamkniêciem. Pobieranie próbek, transport i przechowywanie Uwaga: Pobieranie próbek Transport próbek Przechowywanie próbek Ze wszystkimi próbkami nale y obchodziæ siê jak z materia³em zdolnym do przenoszenia czynników zakaÿnych. COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 stosuje siê wy³¹cznie do próbek surowicy lub osocza. Krew nale y pobieraæ do probówek typu SST (Serum Separation Tubes) lub sterylnych probówek stosuj¹c jako koagulant EDTA (lawendowa nakrêtka) lub ACD ( ó³ta nakrêtka). Próbki, w których u yto heparyny jako czynnika przeciwkrzepliwego, nie nadaj¹ siê do niniejszego testu. Pe³n¹ krew nale y przechowywaæ w temperaturze 2 25 C nie d³u ej ni 6 godzin. Surowicê lub osocze nale y oddzieliæ od krwi pe³nej w ci¹gu 6 godzin od pobrania, odwirowuj¹c przy 1500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Surowicê lub osocze nale y przenieœæ do sterylnych polipropylenowych probówek. Transport pe³nej krwi, surowicy lub osocza musi przebiegaæ zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi i lokalnymi dla transportu czynników zakaÿnych 23. Krew pe³n¹ nale y transportowaæ w temperaturze 2 25 C i poddaæ obróbce w ci¹gu 6 godzin od pobrania. Surowicê lub osocze transportowaæ mo na w temperaturze 2 8 C lub zamro one w temperaturze -70 C lub poni ej i nale y je poddaæ obróbce w podanych poni ej granicach czasu. Próbki surowicy lub osocza przechowywaæ mo na w temperaturze 2 8 C przez okres do 72 godzin, lub zamro one w temperaturze -70 C i poni ej. Zaleca siê przechowywanie próbek w porcjach o objêtoœci 250 300 µl, w sterylnych, polipropylenowych, zakrêcanych o pojemnoœci 1,5 ml (takich jak firmy Sarstedt 72.692.105). Próbki surowicy i osocza mo na dwukrotnie zamra aæ i rozmra aæ. 14/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Instrukcje u ytkowania Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Liczba cykli Szczegó³owe instrukcje u ytkowania mo na znaleÿæ w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR. Wszystkie odczynniki musz¹ mieæ temperaturê otoczenia przed u yciem. Przed rozpoczêciem procedury oznaczenia, sprawdÿ wzrokowo, czy objêtoœæ odczynników jest wystarczaj¹ca. Próbki surowicy i osocza musz¹ mieæ temperaturê otoczenia przed u yciem. Gdzie to zaznaczono, u ywaæ pipetorów z barier¹ aerozolow¹ lub z koñcówkami dodatniego wypierania. Do³ó wszelkich starañ, aby zapewniæ selektywn¹ amplifikacjê. Do przygotowywania próbek badanych i kontrolnych konieczne jest stosowanie zakrêcanych probówek, aby zapobiec rozchlapaniu i potencjalnej kontaminacji miêdzy próbkami badanymi i kontrolnymi. Nie nale y stosowaæ probówek z zatrzaskowym zamkniêciem. Ka dy zestaw zawiera odczynniki wystarczaj¹ce dla oœmiu cykli po 12 oznaczeñ ka dy, które wykonywaæ mo na oddzielnie lub równoczeœnie. Ka dy cykl oznaczeñ musi zawieraæ co najmniej jedno powtórzenie AMPLICOR HCV ( ) Control i AMPLICOR HCV (+) Control (patrz punkt Kontrola jakoœci). Odczynniki do przygotowania próbki i amplifikacji pakowane s¹ w butelki jednorazowe, wystarczaj¹ce na przeprowadzenie 12 testów. Kontrole HCV ( ) i HCV (+) pakowane s¹ w fiolki jednokrotnego u ytku. Aby najwydajniej wykorzystaæ odczynniki, próbki badane i kontrolne nale y poddawaæ obróbce w seriach bêd¹cych wielokrotnoœci¹ 12. Przebieg pracy Test AMPLICOR HCV Test, v2.0 mo na wykonaæ w ci¹gu jednego dnia lub dwóch dni. Aby przeprowadziæ oznaczenie w ci¹gu jednego dnia roboczego nale y kolejno wykonywaæ instrukcje w punktach Przygotowanie odczynników, Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych oraz Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Test przeprowadziæ mo na w ci¹gu 2 dni rozpoczynaj¹c od punktu Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych w dniu 1, a nastêpnie Przygotowanie odczynników i Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja w dniu 2 lub rozpoczynaj¹c od Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, Odwrotna transkrypcja i Amplifikacja w dniu 1, a Detekcja w dniu 2. Aby przygotowaæ próbkê badan¹ i kontroln¹ w dniu 1, a odwrotn¹ transkrypcjê, amplifikacja i detekcja w dniu 2, nale y wykonaæ punkty Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy 1 do 15) i przechowaæ przygotowane próbki badane i kontrolne w sposób przedstawiony w etapie 15. Dzieñ 2 nale y rozpocz¹æ od Przygotowanie odczynników, a nastêpnie rozmroziæ przygotowane próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej, po czym wykonaæ punkt Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, etap 16, oraz Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Aby przygotowaæ próbki badane i kontrolne oraz wykonaæ odwrotn¹ transkrypcjê i amplifikacjê w dniu 1, nale y wykonaæ wszystkie etapy Przygotowanie odczynników i Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych. Nale y zaprogramowaæ analizator COBAS AMPLICOR do pracy w trybie równoleg³ym, a nastêpnie zakoñczyæ etapy amplifikacji (szczegó³owe instrukcje u ytkowania mo na znaleÿæ w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR). Nale y pozostawiæ zdenaturowany amplikon przez noc w temperaturze 2 8 C i kontynuowaæ oznaczenie od punktu Detekcja w dniu 2. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 15/42

Przygotowanie odczynników Wykonywane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania odczynników 1. Ustal odpowiedni¹ liczbê pierœcieni (A-ring) potrzebnych do oznaczenia próbek pacjentów i kontrolnych. Umieœæ pierœcienie (A-ring) w odpowiednim statywie(ach). 2. Przygotuj g³ówn¹ mieszaninê robocza dodaj¹c 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 do jednej fiolki z HCV MMX, v2.0. Nie musisz mierzyæ objêtoœci g³ównej mieszaniny. Dodaj 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 do ca³ej fiolki HCV MMX, v2.0. Zamknij probówkê i dok³adnie wymieszaj, odwracaj¹c j¹ 10 15 razy. Nie mieszaj na mieszadle wibracyjnym roztworu g³ównej mieszaniny roboczej. Ró owy barwnik w HCV Mn 2+, v2.0 u ywany jest do wizualnego potwierdzenia, e HCV Mn 2+, v2.0 dodano do HCV MMX, v2.0. Usuñ pozosta³y HCV Mn 2+, v2.0. G³ówna mieszanina robocza musi byæ przechowywana w temperaturze 2 8 C i zu yta w ci¹gu 4 godzin od przygotowania. 3. Dodaj 50 µl g³ównej mieszaniny roboczej do ka dej z probówek (A-tube) u ywaj¹c pipetora powtarzalnego lub pipetora wyposa onego w barierê aerozolow¹ lub koñcówkê dodatniego wypierania. Nie nale y jeszcze zamykaæ probówek (A-tube). 4. W³ó pierœcieñ(nie) (A-ring) zawieraj¹ce g³ówn¹ mieszaninê robocz¹ do plastikowego woreczka przeznaczonego do wielokrotnego zamykania i zamknij go pewnie. Przenieœ pierœcieñ(nie) (A-ring) do Obszaru przed amplifikacj¹ przygotowanie próbek badanych i kontrolnych. Pierœcieñ(nie) (A-ring) zawieraj¹ce g³ówn¹ mieszaninê robocz¹ nale y przechowywaæ w temperaturze 2 8 C w Obszarze przed amplifikacj¹ przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, do czasu zakoñczenia przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. G³ówna mieszanina robocza zachowuje stabilnoœæ przez 4 godziny w temperaturze 2 8 C w probówkach (A-tube) umieszczonych w szczelnie zamkniêtej torebce z tworzywa. Przygotowanie próbek Wykonywane w: Obszar przed amplifikacj¹ obszar przygotowania próbek badanych i kontrolnych badanych i kontrolnych Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga W celu amplifikacji uprzednio przygotowanych próbek badanych i kontrolnych, nale y najpierw wykonaæ etapy w punkcie Przygotowanie odczynników. Nale y rozmroziæ przygotowane próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej, a nastêpnie wykonaæ Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, etap 16. Ka d¹ butelkê HCV LYS, v2.0 nale y przed u yciem oceniæ na bia³ym tle pod k¹tem wyst¹pienia ó³tego koloru lub cech nieszczelnoœci. W razie ó³tego zabarwienia zawartoœci butelki lub cech jej nieszczelnoœci, nie nale y u ywaæ butelki do badañ. Nale y skontaktowaæ siê z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany zestawu. Przechowywanie HCV LYS, v2.0 w temperaturze 2 8 C prowadzi do powstania osadu. Przed u yciem odczynnik nale y ogrzaæ w temperaturze 25 37 C przez maksymalnie 30 minut oraz dok³adnie wymieszaæ w celu rozpuszczenia osadu. 1. Przygotuj 70% etanol. W celu wykonania 12 testów, wymieszaj 11,0 ml 95% etanolu i 4,0 ml dejonizowanej lub destylowanej wody. 2. Oznacz jedn¹ zakrêcan¹ probówkê pojemnoœci 1,5 ml dla jednego pacjenta oraz dwie dodatkowe probówki jako HCV ( ) C i HCV (+) C. 3. Przygotuj roboczy odczynnik lizuj¹cy. Przed u yciem, wymieszaj na mieszadle wibracyjnym HCV IC, v2.0 przez 5 10 sekund. Dla ka dej serii licz¹cej do 12 próbek badanych i kontrolnych, dodaj 100 µl HCV IC, v2.0 do jednej butelki HCV LYS, v2.0 i dobrze wymieszaj. Nie musisz mierzyæ objêtoœci HCV LYS, v2.0. HCV IC, v2.0 musi byæ dodany do HCV LYS, v2.0 nawet je eli HCV Internal Control nie zostanie wykryty. Usuñ pozosta³y HCV IC, v2.0. Roboczy odczynnik lizuj¹cy jest trwa³y przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. 16/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Uwaga W razie u ywania zamro onych próbek, nale y je rozmroziæ w temperaturze pokojowej i wymieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Aby zebraæ badan¹ próbk¹ na dnie probówki, odwiruj j¹ krótko. Zachowaæ ostro noœæ, aby unikn¹æ ska enia rêkawic przy obchodzeniu siê z próbkami. 4. Dodaj 400 µl roboczego odczynnika lizuj¹cego do ka dej z oznaczonych probówek i zamknij je. 5. Przygotuj kontrole w nastêpuj¹cy sposób: Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym NHP, HCV ( ) C, v2.0 i HCV (+) C, v2.0 co najmniej 5 10 sekund. Dodaj 200 µl NHP do ka dej z kontrolnych probówek. Zamknij probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3 5 sekund. Dodaj 20 µl HCV ( ) C, v2.0 do probówki oznaczonej HCV ( ) C zawieraj¹cej roboczy odczynnik lizuj¹cy i NHP. Zamknij probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3 5 sekund. Dodaj 20 µl HCV (+) C, v2.0 do probówki oznaczonej HCV (+) C zawieraj¹cej roboczy odczynnik lizuj¹cy i NHP. Zamknij probówkê i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. 6. Dodaj 200 µl ka dej badanej próbki chorego doodpowiednio oznaczonej probówki zawieraj¹cejroboczy odczynnik lizuj¹cy. Zamknij probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. 7. Inkubuj probówki z próbkami badanymi i kontrolnymi w suchym bloku grzejnym przez 10 minut w temperaturze 60 C ± 2 C. Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 10 sekund. 8. Otwórz probówki i do ka dej z nich dodaj 600 µl 100% alkoholu izopropylowego (o temperaturze pokojowej). Zamknij ponownie probówki i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. Inkubuj wszystkie probówki przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. 9. Na ka d¹ probówkê nanieœ znak orientacyjny, a nastêpnie umieœæ probówki w mikrowirówce tak, aby wspomniany znak skierowany by³ na zewn¹trz, a peletki ustawi³y siê zgodnie ze znakami. Odwiruj próbki badane i kontrolne w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy maksymalnej prêdkoœci (12 500 16 000 x g). 10. U ywaj¹c dla ka dej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienk¹ koñcówk¹ na ka d¹ próbkê odci¹gnij ostro nie i usuñ supernatant z ka dej probówki, zachowuj¹c ostro noœæ, aby nie uszkodziæ peletki (która mo e byæ nie widoczna). Usuñ tak du o p³ynu, jak to jest mo liwe bez uszkodzenia peletki. Usuñ powoli supernatant, pozwalaj¹c na ca³kowite sp³yniêcie p³ynu po œcianie probówki. Nie nale y stosowaæ aspiracji pró niowej. 11. Do ka dej probówki dodaj 1,0 ml 70% etanolu (o temperaturze pokojowej), a nastêpnie zamknij j¹ i wymieszaj na mieszadle wibracyjnym co najmniej 3 5 sekund. 12. Umieœæ probówki w mikrowirówce ze znakami orientacyjnymi skierowanymi na zewn¹trz i wiruj probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy maksymalnej prêdkoœci (12 500 16 000 x g). 13. U ywaj¹c dla ka dej probówki nowej, jednorazowej pipety transferowej z cienk¹ koñcówk¹ na ka d¹ probówkê odci¹gnij ostro nie i usuñ supernatant nie uszkadzaj¹c peletki. Na tym etapie peletka powinna byæ wyraÿnie widoczna. Usuñ tak du o supernatantu, jak to jest mo liwe. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 17/42

Uwaga Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja 14. Zamknij ponownie probówki i odwiruj przy maksymalnej prêdkoœci przez 3 5 sekund. Ostro nie usuñ supernatant bez uszkadzania peletki przy u yciu pipetora o pojemnoœci 200 µl zaopatrzonego w now¹ koñcówkê dla ka dej probówki. Na tym etapie peletka powinna byæ wyraÿnie widoczna. Usuñ tak du o supernatantu, jak to jest mo liwe. Pozosta³y etanol mo e hamowaæ amplifikacjê. 15. Dodaj 200 µl HCV DIL, v2.0 do ka dej probówki. Jak najdok³adniej rozprowadÿ peletkê przy u yciu pipetora o pojemnoœci 200 µl zaopatrzonego w koñcówkê z barier¹ aerozolow¹. Zamknij ponownie probówki. Wymieszaj na mieszadle wibracyjnym energicznie przez 10 sekund. Pozostaæ mo e niewielka iloœæ nierozpuszczalnego materia³u. Przygotowane próbki badane i kontrolne nale y poddaæ amplifikacji w ci¹gu 3 godzin od przygotowania lub przechowywaæ zamro one w temperaturze -70 C lub ni szej przez okres do jednego miesi¹ca, przy nie wiêcej ni dwóch cyklach zamra anie/rozmra anie. Wiêcej ni dwa cykle zamra anie/rozmra anie mog¹ powodowaæ utratê sygna³u HCV lub HCV Internal Control. Je eli przygotowane próbki badane i kontrolne przechowywano w stanie zamro enia przed amplifikacj¹, przed przejœciem do etapu 16 nale y je rozmroziæ w temperaturze pokojowej, wymieszaæ na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. 16. Do odpowiednich probówek (A-tube) zawieraj¹cych g³ówn¹ mieszaninê robocz¹ dodaj przy u yciu mikropipetora wyposa onego w koñcówki z barier¹ aerozolow¹ lub dodatniego wypierania 50 µl ka dej z przygotowanych próbek pacjenta i kontrolnych. Do ka dej próbki badanej i kontrolnej u yj nowej koñcówki. Zwróæ uwagê, eby unikn¹æ przenoszenia wytr¹conego materia³u, który móg³ nie ulec rozpuszczeniu. Zamknij probówki (A-tube). 17. Zapisz lokalizacjê próbek kontrolnych i badanych w pierœcieniach (A-ring). Amplifikacjê nale y rozpocz¹æ w ci¹gu 45 minut od czasu dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do probówek (A-tube) zawieraj¹cych g³ówn¹ mieszaninê robocz¹. Przenieœ przygotowane próbki badane i kontrolne w pierœcieniach (A-ring) do obszaru amplifikacji/detekcji. Pozosta³¹ czêœæ przygotowanej próby mo na zamroziæ w temperaturze -70 C lub ni szej przez okres do jednego miesi¹ca. Przygotowane próbki mo na zamra aæ i rozmra aæ nie wiêcej ni dwa razy. Wiêcej ni dwa cykle zamra anie/rozmra anie mog¹ powodowaæ utratê HCV RNA. Wykonywana w: Obszarze obróbki poamplifikacyjnej obszarze amplifikacji/detekcji Nale y wykonaæ codzienne czynnoœci serwisowe w sposób okreœlony w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR, ³¹cznie z: Przetrzyj stanowisko startowe przy u yciu wilgotnej szmatki pozbawionej k³aczków, a nastêpnie osusz je Przetrzyj koñcówkê uchwytu do pojemników D-cup przy u yciu wilgotnej szmatki pozbawionej k³aczków, a nastêpnie osusz j¹ SprawdŸ pojemnik buforu p³ucz¹cego i nape³nij go w razie potrzeby Przygotuj roboczy bufor p³uczacy (1X) w sposób podany poni ej. SprawdŸ WB, a w razie potrzeby ogrzej go w temperaturze 30 37 C w celu rozpuszczenia osadu. Dodaj 1 objêtoœæ WB do 9 objêtoœci destylowanej lub dejonizowanej wody. Wymieszaj dok³adnie. Przez ca³y czas utrzymuj co najmniej 3 4 litry buforu p³ucz¹cego (1X) w zbiorniku buforu p³ucz¹cego systemu. Opró nij pojemnik na odpady Za³aduj system Podczas ³adowania systemu sprawdÿ strzykawki i przewody Podczas ³adowania systemu sprawdÿ koñcówkê pipetuj¹c¹ 18/42 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 10/2005, Revision 6.0

Hepatitis C Virus Przed ka dym cyklem SprawdŸ pojemnik na odpady i opró nij go w razie potrzeby SprawdŸ pojemnik bufora p³ucz¹cego i dodaj buforu w razie potrzeby Usuñ zu yte stojaki do pojemników D-cup Za³aduj system Montowanie przyrz¹dów i sterowanie systemem 1. SprawdŸ iloœci odczynników wewn¹trz analizatora COBAS AMPLICOR. Przygotuj wystarczaj¹c¹ iloœæ kaset z odczynnikami do ukoñczenia analizy wprowadzonych próbek. 2. Wymieszaj dok³adnie CX PS1, v2.0 na mieszadle wibracyjnym. Dodaj 2,5 ml CX PS1, v2.0 do jednej kasety zawieraj¹cej CX4, v2.0. Umieœæ kasetê w stojaku dla odczynników specyficznych dla okreœlonego testu. Usuñ zu yt¹ fiolkê CX PS1, v2.0. Zanotuj datê przygotowania odczynnika na kasecie CX4, v2.0. 3. Oznaczaj¹c HCV Internal Control, dok³adnie wymieszaj na mieszadle wibracyjnym IC PS1. Dodaj 2,5 ml IC PS1 do jednej kasety z IC4. Umieœæ kasetê w stojaku dla odczynników specyficznych dla okreœlonego testu. Usuñ zu yt¹ fiolkê IC PS1. Zanotuj datê przygotowania odczynnika na kasecie IC4. 4. Przygotuj substrat roboczy pipetuj¹c 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby wymieszaæ roztwór, kilkakrotnie nabierz i usuñ p³yn z pipety. Usuñ pust¹ fiolkê SB. Odnotuj datê przygotowania na kasecie z SB3. 5. Umieœæ substrat roboczy w ogólnym stojaku dla roztworów. 6. Umieœæ kasety z DN4 i CN4 w ogólnym stojaku dla roztworów. Na ka dej kasecie odnotuj datê jej otwarcia. 7. Zdefiniuj stojaki dla odczynników jako ogólne lub swoiste dla danego oznaczenia przy u yciu klawiatury lub czytnika kodów paskowych w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR, lub u ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi dla oprogramowania AMPLILINK. 8. Skonfiguruj stojaki dla odczynników wprowadzaj¹c pozycje odczynników i numery serii do analizatora przy u yciu klawiatury lub czytnika kodów paskowych w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR, lub u ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi dla oprogramowania AMPLILINK. 9. Za³aduj stojaki z odczynnikami do analizatora przy u yciu klawiatury lub czytnika kodów paskowych w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS AMPLICOR, lub u ywaj¹c oprogramowania AMPLILINK w sposób opisany w Instrukcji obs³ugi dla oprogramowania AMPLILINK. Upewnij siê, e ka da kaseta z odczynnikami znajduje siê w przypisanej dla niej lokalizacji oraz, e ka da kaseta jest œciœle zamocowana w jej stojaku. 10. Umieœæ stojak dla pojemników D-cup na przeznaczonej dla nich platformie. Dla ka dej reakcji detekcji wymagany jest jeden pojemnik D-cup, a dla ka dej kasety z substratem roboczym wymagane s¹ dwa pojemniki D-cup, aby umo liwiæ wyzerowanie analizatora COBAS AMPLICOR. 10/2005, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, v2.0 19/42