cobas 4800 HPV Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.

Transkrypt

1 cobas 4800 HPV Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 960 Tests P/N: Tests P/N: cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 960 Tests P/N: Tests P/N: cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 Sets P/N: cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 960 Tests P/N: Tests P/N: cobas 4800 System Wash Buffer Kit c4800 WB 960 Tests P/N: Tests P/N: UWAGA: Zakup niniejszego produktu umożliwi nabywcy zastosowanie go do amplifikacji i detekcji sekwencji kwasu nukleinowego z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz związanych z nią procesów w ramach diagnostyki in vitro z użyciem materiału ludzkiego. Wraz z nabyciem niniejszego produktu nabywca nie otrzymuje żadnego patentu ogólnego ani innej licencji, oprócz prawa do określonego, szczególnego zastosowania produktu. ZASTOSOWANIE Test cobas 4800 Human Papillomavirus (HPV) jest jakościowym testem in vitro służącym do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego w próbkach pacjentek. Do detekcji 14 typów wirusa HPV o wysokim stopniu ryzyka (ang. high-risk HR) w teście tym, w ramach pojedynczej analizy, wykorzystuje się amplifikację docelowego DNA przez reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz hybrydyzację kwasów nukleinowych. Test pozwala na oznaczenie szczególnie typów wirusa HPV 16 i HPV 18 i równoczesne wykrycie innych typów o wysokim stopniu ryzyka (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) przy klinicznie istotnych poziomach zakaźności. Próbki są ograniczone do komórek szyjki macicy pobieranych do podłoża do przechowywania pobranych komórek cobas PCR Cell Collection Media (Roche Molecular Systems, Inc.), płynnego podłoża PreservCyt (Hologic Corp.) oraz płynu konserwującego SurePath (BD Diagnostics-TriPath). Wskazania do stosowania testu cobas 4800 HPV są następujące: (a) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia jako badanie przesiewowe u pacjentek, których wyniki cytologii szyjki macicy wykazały ASC-US (atypowe komórki nabłonka płaskiego szyjki macicy o nieokreślonym znaczeniu, ang. atypical squamous cells of undetermined significance), w celu określenia potrzeby skierowania ich na kolposkopię. (b) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia jako badanie przesiewowe u pacjentek, których wyniki cytologii szyjki macicy wykazały ASC-US w celu oceny obecności lub braku genotypów 16 i 18 wirusa HPV o wysokim stopniu ryzyka. (c) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia dodatkowo obok cytologii szyjki macicy w celu oceny obecności lub braku typów wirusa HPV o wysokim stopniu ryzyka. (d) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia dodatkowo obok cytologii szyjki macicy w celu oceny obecności lub braku genotypów 16 i 18 wirusa HPV. (e) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia jako pierwotne badanie przesiewowe pierwszego rzutu w celu identyfikacji kobiet, u których występuje zwiększone ryzyko rozwoju raka szyjki macicy lub obecności choroby w wysokim stopniu zaawansowania. (f) Test cobas 4800 HPV jest wskazany do użycia jako pierwotne badanie przesiewowe pierwszego rzutu w celu oceny obecności lub braku genotypów 16 i 18 wirusa HPV. Wyniki testu cobas HPV łącznie z dokonaną przez lekarza oceną wcześniejszych badań cytologicznych, innych czynników ryzyka i znanych lekarzowi wytycznych mogą służyć jako wskazówka do wyboru sposobu leczenia pacjentki. Wyniki testu cobas HPV nie powinny być powodem rezygnacji z kolposkopii u kobiet. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU Długotrwałe zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) jest przyczyną raka szyjki macicy oraz jego prekursora neoplazji śródnabłonkowej szyjki macicy (ang. cervical intraepithelial neoplasia CIN) 1-3. Obecność zakażenia wirusem HPV można domniemywać w ponad 99% przypadków raka szyjki macicy na całym świecie 3. HPV jest małym wirusem pozbawionym otoczki, zawierającym dwie nici DNA, którego genom składa się z około 8000 nukleotydów. Istnieje przeszło 118 różnych typów HPV 4,5 i około 40 różnych gatunków wirusa HPV, które mogą zakażać błonę śluzową w okolicy odbytowo-płciowej człowieka 6,7. Jednak tylko część spośród typów od 13 do 18 jest uważana za wirusy wysokiego ryzyka dla rozwinięcia się raka szyjki macicy i jego zmian prekursorowych 3,8-13. W analizie danych wieloośrodkowego badania porównawczego przypadków Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem (International Agency of Research on Cancer, IARC) iloraz szans (ang. Odds Ratio OR) dla raka płaskonabłonkowego z powodu zakażenia wirusem HPV wynosił 158,2, przy czym analiza była ograniczona do badań z zastosowaniem zatwierdzonych technik detekcji wirusa HPV 12. W badaniu tym iloraz szans dla raka szyjki macicy wynosił od 109 do 276 w badaniach z różnych części świata 12. Chociaż długotrwałe zakażenie wirusem HPV o wysokim stopniu ryzyka (HR) stanowi niezbędny czynnik powstania raka szyjki macicy i jego zmian prekursorowych, bardzo niewielki procent tych zakażeń prowadzi do rozwinięcia się opisanych stanów chorobowych. Zakażenie wirusem HPV przenoszone drogą płciową jest niezwykle częste, przy szacunkowej częstości dochodzącej do 75% wszystkich kobiet narażonych na ekspozycję na wirusa 14. Jednak > 90% zakażonych kobiet rozwinie skuteczną odpowiedź immunologiczną i zwalczy zakażenie w okresie od 6 do 24 miesięcy, bez wystąpienia jakichkolwiek następstw zdrowotnych Zakażenie dowolnym typem wirusa HPV może wywołać neoplazję śródnabłonkową szyjki macicy (CIN), choć po zwalczeniu zakażenia wirusem HPV takie niebezpieczeństwo zwykle także zanika 21. Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu PL 1 Doc Rev. 10.0

2 W krajach rozwiniętych, prowadzących przesiewowe programy wykrywania raka szyjki macicy, od połowy lat 50. stosuje się rozmaz Pap jako podstawowe narzędzie wykrywania wczesnych prekursorów raka szyjki macicy. Chociaż badanie to spektakularnie zmniejszyło w tych krajach wskaźniki umieralności z powodu raka szyjki macicy, jednak rozmaz Pap wymaga interpretacji przez bardzo doświadczonego cytopatologa i jest to test o relatywnie niskiej dokładności, z wysokim odsetkiem wyników fałszywie ujemnych. Nieprawidłowe cechy cytologiczne, obserwowane w rozmazie Pap, są wywoływane przede wszystkim przez infekcję wirusem HPV, jednak różnorodne zmiany o podłożu zapalnym bądź związane ze sposobem pobierania próbek mogą skutkować fałszywie dodatnimi wynikami rozmazu Pap. W przypadku nieprawidłowego wyniku rozmazu Pap postępowanie z wyboru obejmuje: powtórzenie badania, kolposkopię oraz biopsję. Histologicznie potwierdzone zmiany wysokiego stopnia wymagają usunięcia chirurgicznego w celu zapobieżenia rozwojowi inwazyjnego raka szyjki macicy. Wirus brodawczaka ludzkiego jest niezwykle trudny do hodowania in vitro, a nie wszyscy pacjenci zakażeni HPV wykazują możliwą do zaobserwowania reakcję z wytworzeniem przeciwciał. Badanie kwasu nukleinowego (DNA) za pomocą reakcji PCR jest nieinwazyjną metodą stwierdzenia obecności zakażenia szyjki macicy wirusem HPV. Wprowadzenie badania DNA w kierunku obecności wirusa HPV zwiększyło skuteczność programów badań przesiewowych dotyczących wykrywania raka szyjki macicy dzięki wcześniejszemu wykrywaniu zmian wysokiego ryzyka u kobiet po 30. roku życia z wynikiem NILM badania cytologicznego oraz zmniejszeniu zapotrzebowania na niepotrzebną kolposkopię i leczenie u pacjentek po 21. roku życia z wynikiem ASC-US badania cytologicznego. Ponadto dobrze udokumentowano wyższą czułość badania na obecność wirusa HPV w porównaniu z rozmazami Pap w wykrywaniu choroby o wysokim stopniu zaawansowania w populacji poddawanej badaniom przesiewowym 22,23. Badanie DNA w kierunku obecności wirusa HPV o udowodnionej wyższej czułości zaproponowano i zastosowano jako pierwotne badanie przesiewowe pierwszego rzutu w niektórych programach badań przesiewowych. ZASADY PROCEDURY Test cobas 4800 HPV oparty jest na dwóch głównych procesach: (1) zautomatyzowanym przygotowaniu próbek w celu jednoczesnej ekstrakcji DNA wirusa HPV i DNA komórkowego; (2) amplifikacji 24 PCR docelowych sekwencji DNA z wykorzystaniem zarówno par primerów komplementarnych swoistych dla HPV i β-globiny, jak i detekcji w czasie rzeczywistym oznaczonych fluorescencyjnie, rozszczepionych detekcyjnych sond oligonukleotydowych swoistych dla HPV i β-globiny. Ta jednoczesna ekstrakcja, amplifikacja i detekcja β-globiny w teście cobas 4800 HPV pozwala na kontrolowanie całego procesu oznaczania. Odczynnik Master Mix do testu cobas 4800 HPV zawiera pary primerów i próby swoiste dla DNA 14 typów wirusów HPV wysokiego ryzyka oraz dla DNA β-globiny. Detekcja DNA (amplikonu) poddanego amplifikacji jest przeprowadzana podczas cyklu termicznego z zastosowaniem sond oligonukleotydowych oznaczanych przy użyciu czterech różnych barwników fluorescencyjnych. Poddany amplifikacji sygnał pochodzący od dwunastu typów wirusa HPV wysokiego ryzyka (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) jest wykrywany przy użyciu tego samego barwnika fluorescencyjnego, natomiast każdy z sygnałów pochodzących od wirusa HPV16, HPV18 i β-globiny jest wykrywany przy użyciu przypisanego mu barwnika fluorescencyjnego. Przygotowanie próbki Przygotowanie próbek do testu cobas 4800 HPV jest zautomatyzowane za pomocą aparatu cobas x 480. Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, są poddawane trawieniu w warunkach denaturujących w podwyższonych temperaturach, a następnie poddawane lizie w obecności odczynnika chaotropowego. Uwolnione kwasy nukleinowe wirusa HPV, razem z DNA β-globiny służącym jako kontrola procesu, są oczyszczane przez ich absorpcję do cząstek szkła magnetycznego, czyszczone i oddzielane od tych cząstek, po czym są gotowe do procesu amplifikacji i detekcji PCR. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej W teście cobas 4800 HPV wykorzystano primery do określenia sekwencji o długości około 200 nukleotydów w obrębie polimorficznego regionu L1 genomu HPV. Pula primerów HPV zawarta w odczynniku Master Mix została zaprojektowana w celu amplifikacji DNA wirusów HPV z grupy 14 typów wysokiego ryzyka (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) 3,8-13,25. Fluorescencyjne sondy oligonukleotydowe wiążą się z polimorficznymi regionami w obrębie sekwencji określonej przez te primery. Dodatkowa para primerów i sonda ukierunkowana na ludzki gen β-globiny (amplikon o długości 330 par zasad) umożliwiają kontrolę procesu. Amplifikacja sekwencji docelowej Polimerazę DNA 26 EagleZ05, chemicznie zmodyfikowaną wersję polimerazy DNA Thermus species Z05 27, wykorzystuje się do wyzwalanej wysoką temperaturą amplifikacji docelowych fragmentów wirusa HPV oraz kontrolnej β-globiny. Mieszanina zawierająca substraty do reakcji PCR jest najpierw podgrzewana w celu uaktywnienia polimerazy DNA EagleZ05, denaturacji DNA wirusa i DNA genomu oraz odsłonięcia docelowych sekwencji dla primerów. W miarę ochładzania się mieszaniny primery sensowne oraz antysensowne hybrydyzują z docelowymi sekwencjami DNA. Polimeraza DNA EagleZ05 w obecności jonu dwuwartościowego metalu oraz nadmiaru dezoksyrybonukleotydów (dntp) wydłuża primer(y) i następuje synteza drugiej nici DNA. Proces ten kończy pierwszy cykl PCR, dostarczając dwuniciowej kopii DNA docelowego regionu genomu HPV oraz genu β-globiny. Polimeraza DNA wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowych matryc, wytwarzając docelowy fragment dwuniciowej cząsteczki DNA wirusa HPV o długości około 200 par zasad lub fragment cząsteczki DNA o długości 330 par zasad, kodujący β-globinę, określany jako amplikon. Proces ten jest powtarzany wielokrotnie, przy czym w każdym z cykli ilość zwielokrotnionego DNA (amplikonu) ulega podwojeniu. Amplifikacja odbywa się wyłącznie w tych obszarach genomu HPV i/lub genu β-globiny, które zawarte są pomiędzy parą odpowiednich primerów. Całość genomu nie ulega amplifikacji. Zautomatyzowana detekcja w czasie rzeczywistym Test cobas 4800 HPV wykorzystuje technologię reakcji PCR w czasie rzeczywistym 29,30. Każda sonda oligonukleotydowa w tej reakcji jest oznaczana barwnikiem fluorescencyjnym, służącym jako reporter, i wygaszaczem wygaszającym emisje fluorescencyjne pochodzące od barwnika w sondzie jako całości. W miarę postępowania procesu sondy komplementarne do amplikonu wiążą się ze swoistymi jednoniciowymi sekwencjami DNA i ulegają rozszczepieniu przez aktywność nukleazy od 5' do 3' polimerazy DNA EagleZ05. Po oddzieleniu się barwnika reporterowego od wygaszacza za sprawą aktywności nukleazy, po wzbudzeniu odpowiednim widmem światła, emituje on promieniowanie fluorescencyjne o charakterystycznej długości fali. Ta długość fali charakterystyczna dla każdego z barwników umożliwia niezależne oznaczanie amplikonu HPV16, amplikonu HPV18, innych amplikonów HR (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68) oraz kontroli β-globiny, ponieważ swoiste dla tych poszczególnych sekwencji sondy są oznaczane różnymi barwnikami PL 2 Doc Rev. 10.0

3 Amplifikacja wybiórcza Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy użyciu testu cobas 4800 HPV uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 28, lecz nie łańcuchów DNA zawierających dezoksytymidynę. Dezoksyurydyny nie stwierdza się w występującym naturalnie DNA, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie z uwagi na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny zamiast trójfosforanu tymidyny jako jednego spośród dntp w odczynniku Master Mix; dlatego jedynie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozszczepienie DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego nie niszczy on amplikonu docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase w teście cobas 4800 HPV inaktywuje co najmniej 10 3 kopii amplikonu HPV zawierającego dezoksyurydynę na jedną reakcję PCR. ODCZYNNIKI cobas 4800 System Sample Preparation Kit Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) Cząsteczki szkła magnetycznego 93% izopropanolu Xi 93% (udział wagowy) izopropanolu c4800 SMPL PREP 240 testów 10 x 4,5 ml Produkt drażniący F 93% (udział wagowy) izopropanolu Produkt wysoce łatwopalny R: , S: /25-26 EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu cobas 4800 System Sample Preparation Kit Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) Cząsteczki szkła magnetycznego 93% izopropanolu Xi 93% (udział wagowy) izopropanolu c4800 SMPL PREP 10 x 18 ml 960 testów 10 x 13,5 ml Produkt drażniący F 93% (udział wagowy) izopropanolu Produkt wysoce łatwopalny R: , S: /25-26 EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,09% azydku sodu 10 x 18 ml PL 3 Doc Rev. 10.0

4 cobas 4800 System Wash Buffer Kit Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) Dwuwodny cytrynian sodu 0,05% N-metyloizotiazolonu HCl cobas 4800 System Wash Buffer Kit Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) Dwuwodny cytrynian sodu 0,05% N-metyloizotiazolonu HCl cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) Bufor Tris-HCl < 0,05% EDTA Glicerol Chlorek wapnia Octan wapnia < 2% proteinazy K Xn < 2% (udział wagowy) proteinazy K c4800 WB c4800 WB c4800 LIQ CYT 240 testów 10 x 55 ml 960 testów 10 x 200 ml 240 testów 10 x 0,9 ml Produkt szkodliwy SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,2% odczynnika SDS 0,09% azydku sodu LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 37% chlorowodorku guanidyny < 5% polidokanolu Xn 37% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny 10 x 3 ml 10 x 10 ml Produkt szkodliwy R: 22-36/38, S: N < 5% (udział wagowy) polidokanolu Produkt niebezpieczny dla środowiska R: , S: PL 4 Doc Rev. 10.0

5 cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) Bufor Tris-HCl < 0,05% EDTA Glicerol Chlorek wapnia Octan wapnia < 2% proteinazy K Xn < 2% (udział wagowy) proteinazy K c4800 LIQ CYT 960 testów 20 x 1,2 ml Produkt szkodliwy SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 0,2% odczynnika SDS 0,09% azydku sodu LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl 37% chlorowodorku guanidyny < 5% polidokanolu Xn 37% (udział wagowy) chlorowodorku guanidyny 10 x 9 ml 10 x 36 ml Produkt szkodliwy R: 22-36/38, S: N < 5% (udział wagowy) polidokanolu Produkt niebezpieczny dla środowiska R: , S: cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu Glicerol < 0,13% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01% sensownych i antysensownych primerów HPV < 0,01% sensownych i antysensownych primerów β-globiny < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond HPV < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond β-globiny < 0,10% polimerazy DNA EagleZ05 (bakteryjnej) < 0,10% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjna) 0,09% azydku sodu HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) Octan magnezu Octan manganu < 0,02% lodowatego kwasu octowego 0,09% azydku sodu c4800 HPV AMP/DET 240 testów 10 x 0,5 ml 10 x 1,0 ml PL 5 Doc Rev. 10.0

6 cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 960 testów Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 (P/N: ) HPV MMX 20 x 1,0 ml (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu Glicerol < 0,13% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,01% sensownych i antysensownych primerów HPV < 0,01% sensownych i antysensownych primerów β-globiny < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond HPV < 0,01% oznaczanych fluorescencyjnie sond β-globiny < 0,10% polimerazy DNA EagleZ05 (bakteryjnej) < 0,10% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjna) 0,09% azydku sodu HPV Mg/Mn 10 x 1,0 ml (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) Octan magnezu Octan manganu < 0,02% lodowatego kwasu octowego 0,09% azydku sodu cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 zestawów Zestaw kontroli cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV (+) C 10 x 0,5 ml (Kontrola dodatnia cobas 4800 HPV Bufor Tris-HCl EDTA 0,05% azydku sodu < 0,00001% poly ra RNA (syntetycznego) < 0,00001% niezakaźnego plazmidu DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencje 16, 18, 39 HPV < 0,00001% niezakaźnego plazmidu DNA (bakteryjnego) zawierającego sekwencje ludzkiej β-globiny ( ) C 10 x 0,5 ml (Kontrola ujemna systemu cobas 4800) Bufor Tris-HCl EDTA 0,05% azydku sodu < 0,00001% poly ra RNA (syntetycznego) OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test służy do stosowania z próbkami z szyjki macicy pobranymi przy użyciu pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt oraz płynu konserwującego SurePath. C. Nie należy pipetować za pomocą ust. D. Nie wolno jeść, pić ani palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, należy stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Należy dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi. E. Należy unikać zakażenia odczynników: bakteryjnego i przez DNA. F. Należy wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. G. Nie wolno używać odczynników po upływie ich dat przydatności. H. Nie należy poddawać odczynników pulowaniu. I. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. J. W celu zapobieżenia zanieczyszczeniu konieczne jest noszenie rękawic i ich zmiana przed przystąpieniem do ponownej pracy z próbkami i odczynnikami cobas K. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 31 oraz CLSI Document M29-A3 32. L. Odczynnik LYS zawiera chlorowodorek guanidyny. Nie dopuścić do bezpośredniego kontaktu między chlorowodorkiem guanidyny i podchlorynem sodu (wybielacz) lub innymi wysoko reaktywnymi odczynnikami, takimi jak kwasy lub zasady. Takie mieszaniny mogą wydzielać trujące gazy. Jeśli płyn zawierający chlorowodorek guanidyny ulegnie rozlaniu, do czyszczenia należy używać odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. W przypadku rozlania płynu zawierającego potencjalne czynniki zakaźne do czyszczenia należy używać NAJPIERW detergentu laboratoryjnego i wody, a następnie 0,5-procentowego roztworu podchlorynu sodu PL 6 Doc Rev. 10.0

7 M. Odczynnik MGP zawiera izopropanol i jest wysoce łatwopalny. Należy przechowywać go z dala od otwartego ognia i potencjalnych źródeł iskier. N. Odczynniki EB, SDS, HPV MMX, HPV Mg/Mn, ( ) C i HPV (+) C zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą ilością zimnej wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. O. Podczas pracy z jakimikolwiek odczynnikami należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, należy natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania należy przed wytarciem rozcieńczyć wodą. P. Wszystkie przedmioty jednorazowego użytku są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Nie należy ich używać powtórnie. Q. Do czyszczenia aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 nie wolno używać roztworu podchlorynu sodu (utleniacza). Czyszczenia aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480 należy dokonywać zgodnie z procedurami opisanymi w Podręczniku użytkownika systemu cobas R. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności oraz procedury mające na celu zredukowanie ryzyka zakażenia, dotyczące aparatu cobas x 480 lub analizatora cobas z 480, można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Nie należy zamrażać odczynników. B. Odczynniki MGP, EB, PK, SDS, LYS, HPV MMX, HPV Mg/Mn, HPV (+) C i ( ) C należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. C. Odczynnik WB należy przechowywać w temperaturze C. Odczynnik zachowuje stabilność do podanej daty przydatności. DOSTARCZONE MATERIAŁY A. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 240 testów Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) B. cobas 4800 System Sample Preparation Kit c4800 SMPL PREP 960 testów Zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800 (P/N: ) MGP (Cząsteczki szkła magnetycznego systemu cobas 4800) EB (Bufor do elucji systemu cobas 4800) C. cobas c4800 WB 4800 System Wash Buffer Kit 240 testów Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) c4800 WB D. cobas 4800 System Wash Buffer Kit 960 testów Zestaw buforów płuczących systemu cobas 4800 (P/N: ) WB (Bufor płuczący systemu cobas 4800) E. cobas 4800 HPV Amplification/Detection Kit c4800 HPV AMP/DET 240 testów Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) F. cobas c4800 HPV AMP/DET 4800 HPV Amplification/Detection Kit 960 testów Zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV MMX (Odczynnik Master Mix cobas 4800 HPV) HPV Mg/Mn (Roztwór Mg/Mn cobas 4800 HPV) PL 7 Doc Rev. 10.0

8 G. cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 240 testów Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) H. cobas 4800 System Liquid Cytology Preparation Kit c4800 LIQ CYT 960 testów Zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 (P/N: ) PK (Proteinaza K cobas 4800) SDS (Odczynnik SDS systemu cobas 4800) LYS (Bufor do lizy systemu cobas 4800) I. cobas 4800 HPV Controls Kit c4800 HPV CTLS 10 zestawów Zestaw kontroli cobas 4800 HPV (P/N: ) HPV (+) C (Kontrola dodatnia cobas 4800 HPV) ( ) C (Kontrola ujemna systemu cobas 4800) MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Obsługa próbek i odczynników Pożywka do przechowywania pobranych komórek cobas PCR (Roche P/N , opcjonalna) Końcówki CO-RE, 1000 µl, statyw 96 (Roche P/N lub Hamilton P/N ) Pojemnik na odczynniki 50 ml (Roche P/N ) Pojemnik na odczynniki 200 ml (Roche P/N ) Płytka (z głębokimi dołkami) do ekstrakcji systemu cobas 4800 (Roche P/N ) Płytka AD 0,3 ml (z mikrodołkami) i film uszczelniający system cobas 4800 (Roche P/N ) Trwała torba na odpady [Roche P/N (mała) lub (duża)] Plastikowa zsuwnia Hamilton STAR (Roche P/N ) Probówki okrągłodenne 13 ml, (Sarstedt P/N ) do użytku jako wtórne probówki na próbki Korki, kolor naturalny (Sarstedt P/N , do ponownego zamykania przetworzonych próbek w okrągłodennych probówkach typu Sarstedt 13 ml) Rękawice jednorazowe bezpudrowe Przyrządy i oprogramowanie Aparat cobas x 480 Analizator cobas z 480 Jednostka sterująca systemu cobas 4800 z oprogramowaniem systemu w wersji 2.1 lub nowszej Wyposażenie i materiały opcjonalne Bufor do przygotowywania próbek cobas (Roche P/N ; bufor Tris-HCl, 0,4% SDS, 0,09% azydku sodu) Pipety: dostarczające do 1000 µl Końcówki z barierą aerozolową bez DNazy: dostarczające do 1000 µl Wirówka laboratoryjna, wyposażona w bęben wirówki o minimalnej wartości RCF równej 1500 Osobna płytka magnetyczna (Roche P/N ) Mieszadło wibracyjne (do mieszania jednej probówki) Mieszadło wibracyjne typu vortexer do mieszania wielu probówek [np. VWR P/N ] Etykiety z kodami kreskowymi odporne na działanie ciepła (RACO Industries; nr kat. RAC ) Termometr 20/150 C (VWR, nr kat ) lub odpowiednik Cyfrowy blok grzejny 120 V (VWR, nr kat ) lub odpowiednik Moduł bloku grzejnego z 12 otworami 16 mm (VWR, nr kat ) lub odpowiednik PL 8 Doc Rev. 10.0

9 POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. A. Pobieranie próbek Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, zostały zatwierdzone do użycia z testem cobas 4800 HPV. Próbki z szyjki macicy należy pobierać zgodnie z instrukcjami producenta. B. Transport próbek Próbki z szyjki macicy, pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath, można transportować w temperaturze 2 30 C. Próbki zawierające HPV muszą być transportowane zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 33. C. Przechowywanie próbek Próbki z szyjki macicy pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath można przechowywać w temperaturze 2 30 C przez okres do 6 miesięcy od daty pobrania. Próbki z szyjki macicy pobrane do płynu konserwującego SurePath można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 6 miesięcy lub w temperaturze C do 14 dni od daty pobrania. Próbki z szyjki macicy pobrane do płynu konserwującego SurePath można przechowywać w temperaturze C przez okres maksymalnie 6 tygodni od daty pobrania pod warunkiem usunięcia przed wykonaniem testu na obecność wirusa HPV indukowanych matrycą płynu konserwującego SurePath wiązań krzyżowych poprzez obróbkę z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas (patrz część Próbki oraz wyniki dotyczące stabilności próbek). INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA UWAGA: Wszystkie odczynniki oprócz odczynników HPV MMX i HPV Mg/Mn przed załadowaniem do aparatu cobas x 480 muszą znajdować się w temperaturze pokojowej. Odczynniki HPV MMX i HPV Mg/Mn można ładować bezpośrednio z temperatury przechowywania 2 8 C, ponieważ ich temperatura zrównoważy się z temperaturą otoczenia wewnątrz aparatu cobas x 480 podczas procesu ich przetwarzania. UWAGA: Próbki pobrane do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt lub płynu konserwującego SurePath przed ich załadowaniem do aparatu cobas x 480 muszą znajdować się w temperaturze pokojowej. UWAGA: Dokładne instrukcje użytkowania można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas Liczba testów w serii: System cobas 4800 jest przeznaczony do obsługi testu cobas 4800 HPV o liczbie próbek i kontroli od 1 do 94 (do 96 testów w jednym cyklu pracy). Każdy zestaw do przygotowania próbek systemu cobas 4800, zestaw do przygotowania płynu do badań cytologicznych systemu cobas 4800 i zestaw buforu płuczącego systemu cobas 4800 HPV zawiera ilość odczynników wystarczającą na 10 cykli pracy 24 testów (240 testów w zestawie) lub 96 testów (960 testów w zestawie). Każdy zestaw do amplifikacji/detekcji cobas 4800 HPV zawiera ilość odczynników wystarczającą na 10 cykli pracy 24 testów (240 testów w zestawie) lub 96 testów (960 testów w zestawie); w celu optymalizacji wykorzystania odczynników dla 48 lub 72 testów można użyć wielu zestawów 240 testów. Zestaw kontroli cobas 4800 HPV zawiera ilość odczynników wystarczającą na 10 cykli pracy (10 kompletów w zestawie). Minimalna liczba dla jednego cyklu pracy w systemie cobas 4800 to 1 próbka plus kontrole. Do przeprowadzenia każdego cyklu pracy konieczne jest jedno powtórzenie kontroli ujemnej systemu cobas 4800 [( ) C] i jedno powtórzenie kontroli dodatniej systemu cobas 4800 HPV [HPV (+) C] (patrz część Kontrola jakości ). Przebieg pracy: UWAGA: Chociaż nie stanowi to optymalnego zużycia odczynników, do cyklu pracy 24 próbek można użyć zestawu do przygotowania 960 testów, a do cyklu pracy 24, 48 lub 72 próbek można użyć zestawu do amplifikacji/detekcji 960 testów HPV. Test cobas 4800 HPV można przeprowadzać z zastosowaniem dwóch przebiegów pracy, nazywanych w oprogramowaniu cobas 4800: Full Workflow i Recovery Workflow. HPV Full Workflow: HPV Full Workflow obejmuje przygotowanie próbek w aparacie cobas x 480 oraz amplifikację/detekcję w analizatorze cobas z 480. Cykl pracy może obejmować 24 testy (z 1 22 próbek plus 2 kontrole) lub 96 testów (z 1 94 próbek plus 2 kontrole). Szczegółowe informacje można znaleźć w części Przeprowadzanie przebiegu pracy Full Workflow, poniżej, oraz w Podręczniku użytkownika systemu cobas HPV Recovery Workflow: HPV Recovery Workflow obejmuje ręczne przygotowanie płytek PCR przy użyciu eluatu z przetworzonej płytki głębokodołkowej, a następnie amplifikację/detekcję na analizatorze cobas z 480. Szczegółowe informacje można znaleźć w części Przeprowadzanie przebiegu pracy Recovery Workflow, poniżej, oraz w Podręczniku użytkownika systemu cobas Próbki: Istnieją trzy rodzaje próbek z szyjki macicy, które można poddać oznaczeniu przy użyciu testu cobas 4800 HPV: a) próbki z szyjki macicy w płynnym podłożu PreservCyt, b) próbki z szyjki macicy w podłożu do przechowywania pobranych komórek cobas PCR Cell Collection Media oraz c) próbki z szyjki macicy w płynie konserwującym SurePath. Próbki w podłożu płynnym PreservCyt, podłożu do przechowywania pobranych komórek cobas PCR Cell Collection Media oraz płynie konserwującym SurePath można przetwarzać w aparacie cobas x 480 bezpośrednio po ich wyjęciu z podstawowego pojemnika opatrzonego właściwym kodem kreskowym lub po wyjęciu z opatrzonej właściwym kodem kreskowym okrągłodennej probówki Sarstedt 13 ml. W celu uzyskania informacji na temat procedur właściwego kodowania kreskowego należy zapoznać się z Podręcznikiem użytkownika systemu cobas 4800 oraz listą kodów kreskowych dopuszczalnych dla systemu cobas UWAGA: Po 14 dniach przechowywania w temperaturze C próbki SurePath należy poddać obróbce w celu usunięcia wiązań krzyżowych indukowanych matrycą przed przeprowadzeniem testu na obecność wirusa HPV w systemie cobas PL 9 Doc Rev. 10.0

10 Obróbka próbek w płynie konserwującym SurePath z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas w celu usunięcia wiązań krzyżowych indukowanych matrycą UWAGA: UWAGA: W przypadku probówek używanych w procedurze usuwania wiązań krzyżowych indukowanych matrycą (patrz część Wyposażenie i materiały opcjonalne) konieczne jest zastosowanie etykiet z kodem kreskowym odpornych na działanie ciepła. Zaleca się przeprowadzenie czynności opisanych w punktach B, C, G i H poniżej w komorze z przepływem laminarnym, aby zminimalizować ryzyko zakażenia krzyżowego. A. Przygotuj po jednej okrągłodennej probówce Sarstedt o pojemności 13 ml oznaczonej kodem kreskowym zawierającej 0,5 ml buforu do przygotowywania próbek cobas na każdą próbkę w płynie konserwującym SurePath przeznaczoną do przebadania. B. Zworteksuj przez 10 sekund próbki w płynie konserwującym SurePath przed ich przeniesieniem. Przenieś po 0,5 ml każdej próbki w płynie konserwującym SurePath do przygotowanej w punkcie A okrągłodennej probówki Sarstedt o pojemności 13 ml. Przed przejściem do kolejnego etapu nałóż z powrotem korki na wszystkie probówki. W przypadku każdej z próbek zmieniaj końcówkę pipety. C. Mieszaj każdą probówkę na mieszadle wibracyjnym przez 1 sekundę. D. Przenieś probówki do modułu grzejnego (patrz część Wyposażenie i materiały opcjonalne). W jednej partii można przetworzyć maksymalnie 48 probówek. E. Prowadź ogrzewanie w temperaturze 120 C przez 20 minut. F. Po zakończeniu ogrzewania wyjmij probówki i umieść je w statywie, a następnie pozostaw je do schłodzenia przez 10 minut w temperaturze otoczenia. G. Wymieszaj każdą probówkę na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. H. Przenieś próbki do statywów cobas 4800 z 24 pozycjami, wyrzuć korki i przeprowadź przetwarzanie w systemie cobas 4800 w celu wykonania testu na obecność wirusa HPV. Próbki w płynie konserwującym SurePath poddane działaniu buforu do przygotowywania próbek cobas można przechowywać w celu wykonania testu na obecność wirusa HPV w przyszłości, jeśli przykładowo w pierwszej kolejności wymagane jest przeprowadzenie oceny cytologicznej. Należy postępować zgodnie z poniższą procedurą: A. Wykonaj kolejne czynności z powyższej procedury obróbki do punktu G. B. Probówki z próbkami w płynie konserwującym SurePath poddane obróbce z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas należy przechowywać przed wykonaniem testów na obecność wirusa HPV w systemie cobas 4800 przez maksymalnie 4 tygodnie w temperaturze 2 30 C. UWAGA: Badanie wirusa HPV bezpośrednio z fiolek podstawowych SurePath można wykonać jedynie przed badaniem cytologicznym. Badanie próbek SurePath po badaniu cytologicznym będzie wymagało przeniesienia przynajmniej 1 ml próbki do opatrzonej właściwym kodem kreskowym okrągłodennej probówki Sarstedt 13 ml. UWAGA: Minimalna objętość wypełnienia, jaka musi znajdować się w podstawowych pojemnikach zawierających podłoże do przechowywania pobranych komórek cobas PCR Cell Collection Media, płynne podłoże PreservCyt i podłoże SurePath, wynosi 3,0 ml. Stosując wtórne okrągłodenne probówki 13 ml należy napełniać je minimalną objętością 1,0 ml i maksymalną objętością 10 ml. UWAGA: Do pobierania próbek z szyjki macicy do testu cobas 4800 HPV należy używać wyłącznie podłoża do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt i płynu konserwującego SurePath. Używanie testu cobas 4800 HPV z innymi przyrządami do pobierania moczu i innymi rodzajami pożywek nie zostało zatwierdzone. Używanie testu cobas 4800 HPV z innymi przyrządami do pobierania próbek i/lub innymi rodzajami pożywek może prowadzić do otrzymania fałszywie ujemnych, fałszywie dodatnich i/lub nieważnych wyników. UWAGA: Może być konieczne podzielenie próbek na alikwoty do opatrzonych właściwym kodem kreskowym okrągłodennych probówek Sarstedt 13 ml w celu ich przetworzenia w aparacie cobas x 480. Do postępowania z próbkami należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Aby zapobiec skażeniu krzyżowemu przetworzonych próbek, do ponownego zatykania próbek po ich przetworzeniu należy używać dodatkowych korków do tych probówek w innym kolorze (neutralnym; patrz rozdział MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE). UWAGA: Podczas przenoszenia próbek z podstawowych pojemników do wtórnych, okrągłodennych probówek 13 ml należy zachować ostrożność. Przed przeniesieniem należy zamieszać próbki w mieszadle wibracyjnym. Należy zmieniać końcówki pipet po zakończeniu postępowania z każdą z próbek. UWAGA: Nie należy przetwarzać próbek, które zawierają widoczną krew lub mają ciemnobrązowy kolor. Pojedynczy przebieg pracy może obejmować różne kombinacje próbek (podłoża do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynne podłoże PreservCyt i/lub płyn konserwujący SurePath), a każda próbka może zostać poddana oznaczeniu zarówno przy użyciu podtypu testu metodą genotypowania HPV wysokiego ryzyka, jak i HPV wysokiego ryzyka Plus. Przebiegi pracy Przeprowadzanie przebiegu pracy Full Workflow: A. Testowi cobas 4800 HPV można poddawać cykle pracy od 1 do 94 próbek plus jedna kontrola ujemna systemu cobas 4800 i jedna kontrola dodatnia systemu cobas 4800 HPV. B. Uruchom system i wykonaj procedury konserwacyjne, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w Podręczniku użytkownika systemu cobas C. Uruchom nowy cykl pracy, klikając przycisk New run. D. W oknie Selection test jako przebieg pracy wybierz Full, a następnie wybierz test HPV PL 10 Doc Rev. 10.0

11 E. Wprowadź nazwę cyklu pracy lub pozostaw domyślną nazwę cyklu pracy, a następnie kliknij OK, aby kontynuować. F. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi ładowania próbek. UWAGA: Próbki mogą być w dowolnej kolejności ładowane do opatrzonych kodami kreskowymi probówek podstawowych lub wtórnych. UWAGA: Jeśli podstawowe pojemniki z próbkami zawierające podłoże do przechowywania pobranych komórek cobas PCR Cell Collection Media, podłoże płynne PreservCyt oraz płyn konserwujący SurePath są przeznaczone do przetwarzania, przed załadowaniem należy je zamieszać w mieszadle wibracyjnym. G. Wybierz rodzaj próbki dla każdej z próbek. Wybierz PC w przypadku zlecania próbek w podłożu płynnym PreservCyt lub podłożu do przechowywania pobranych komórek cobas PCR Cell Collection Media. Wybierz SP w przypadku zlecania próbek w płynie konserwującym SurePath. H. Wybierz żądany wynik dla każdej z próbek. Aby raportować pojedyncze wyniki lub kombinacje testów typów wirusa HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 wysokiego ryzyka, wybierz żądany wynik HPV High Risk Panel. Aby raportować pojedyncze wyniki lub kombinacje testów typów wirusa HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 wysokiego ryzyka oraz oddzielnie raportować wyniki testu typu wirusa HPV 16 wysokiego ryzyka i wyniki testu typu wirusa HPV 18 wysokiego ryzyka, wybierz żądany wynik HPV High Risk Panel Plus Genotyping. I. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi ładowania wszystkich produktów. J. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi ładowania wszystkich odczynników. UWAGA: Kontrole [HPV (+) C i ( ) C] nie są ładowane wraz z próbkami. Są one ładowane do nośnika na odczynniki podczas ładowania odczynnika. Kontrolom HPV (+) i ( ) są przydzielone odpowiednio dwie pozycje (A1 i B1) każdej z płytek do ekstrakcji i płytek z mikrodołkami. UWAGA: System cobas 4800 ma wewnętrzny zegar, kontrolujący czas, przez jaki odczynniki znajdują się w systemie. Po zeskanowaniu WB na zakończenie procesu ładowania jest przeznaczona 1 godzina. Następnie należy kliknąć przycisk Start. Na zakładce Workplace wyświetlany jest zegar odliczający czas. System nie zezwoli na rozpoczęcie kolejnego cyklu pracy, jeżeli zegar aparatu przeterminował się. UWAGA: Aby zapewnić właściwe przeniesienie odczynnika MGP, zamieszaj w mieszadle wibracyjnym lub energicznie wstrząśnij butelką MGP przed umieszczeniem jej w pojemniku na odczynniki. K. Załaduj odczynniki do przygotowywania próbek (WB, MGP, EB, SDS i LYS) do pojemników na odczynniki opatrzonych kodem kreskowym, stosując metodę zeskanuj, zeskanuj, włóż, umieść : Zeskanuj kod kreskowy butelki odczynnika. Zeskanuj kod kreskowy pojemnika na odczynniki. Włóż odczynnik do pojemnika. Umieść wypełniony pojemnik na odczynniki w przypisanej mu pozycji w nośniku na odczynniki. L. Pojemniki na odczynniki są dostępne w dwóch rozmiarach: 200 ml i 50 ml. Postępuj zgodnie ze wskazówkami kreatora konfiguracyjnego oprogramowania, dotyczącymi wyboru pojemnika na odczynniki odpowiednich rozmiarów. Kody kreskowe pojemnika na odczynniki muszą znajdować się po prawej stronie nośnika. UWAGA: Odczynniki do amplifikacji/detekcji (HPV MMX i HPV Mg/Mn), kontrole [HPV (+) C i ( ) C] oraz PK są ładowane bezpośrednio do nośnika na odczynniki i automatycznie skanowane przez aparat cobas x 480. UWAGA: Wszystkie odczynniki i pojemniki na odczynniki są opatrzone kodem kreskowym i są przeznaczone do jednokrotnego użycia. Oprogramowanie cobas 4800 umożliwia śledzenie użycia odczynników oraz pojemników na odczynniki i odrzucenie wcześniej używanych odczynników lub pojemników na odczynniki. Oprogramowanie weryfikuje także, czy do aparatu załadowano wystarczające ilości odczynników. UWAGA: Oprogramowanie cobas 4800 monitoruje datę ważności wszystkich odczynników. Odczynniki po upływie daty ważności nie zostaną dopuszczone do stosowania w systemie cobas M. Rozpocznij przygotowanie próbek, klikając przycisk Start Run. N. Po pomyślnym zakończeniu procesu przygotowania próbek kliknij przycisk ** Unload, aby wyładować nośnik na płytki. ** Stan przygotowania próbki można sprawdzić w tym momencie, przed kliknięciem przycisku Unload. Patrz podręcznik użytkownika systemu cobas cobas O. Aby uszczelnić płytkę z mikrodołkami, przenieść płytkę do analizatora cobas z 480 i rozpocząć cykl pracy amplifikacji i detekcji, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas UWAGA: System cobas 4800 ma wewnętrzny zegar, kontrolujący czas, jaki upływa od momentu dodania przygotowanych próbek do odczynnika Master Mix, będącego w użyciu. Amplifikację i detekcję należy rozpocząć jak najszybciej, jednak nie później niż 90 minut od zakończenia cyklu pracy aparatu cobas x 480. Na zakładce Workplace wyświetla się zegar odliczający czas. P. Po zakończeniu procesu amplifikacji i detekcji wyładuj płytkę z mikrodołkami z analizatora cobas z 480. Q. Aby przeglądać i akceptować poszczególne wyniki, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas PL 11 Doc Rev. 10.0

12 Przeprowadzanie przebiegu pracy Recovery Workflow UWAGA: Przebieg pracy Recovery jest dostępny jako opcja przywracania, w przypadku gdy pełny przebieg pracy nie może zostać zakończony z powodu okoliczności, na które użytkownik nie ma wpływu (np. wyłączenie zasilania podczas cyklu amplifikacji/detekcji). UWAGA: Tylko próbki, których przetwarzanie w aparacie cobas x 480 zakończyło się pomyślnie, mogą zostać poddane procesowi amplifikacji/detekcji z zastosowaniem cyklu pracy Recovery. Podczas cyklu pracy Recovery kontrola systemu dotycząca odczynników i innych produktów jest ograniczona. Podczas przebiegu pracy Recovery nie zachodzi śledzenie pozycji próbek użytkownik końcowy musi się upewnić, że bieżąca pozycja próbki w płytce z mikrodołkami odpowiada przypisanej jej pozycji w pliku harmonogramu pracy raportu układu płytki Recovery. Podczas przygotowywania płytki z mikrodołkami konieczne jest zachowanie maksymalnej ostrożności, aby zapewnić właściwe przygotowanie reakcji PCR oraz w celu uniknięcia zakażenia. UWAGA: Próbki przetworzone w aparacie cobas x 480 mają ograniczoną stabilność. Muszą one zostać poddane amplifikacji/detekcji w przebiegu pracy Recovery Workflow w ciągu 24 godzin, jeśli są przechowywane w temperaturze od 2 C do 30 C. UWAGA: Aby dokonać zmian w kodach kreskowych dodatnich i ujemnych kontroli, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas A. Rozpocznij cykl pracy Recovery, klikając przycisk New run. B. W oknie Test Selection wybierz Recovery, a następnie jako typ testu wybierz HPV. C. Wprowadź nazwę cyklu pracy lub pozostaw domyślną nazwę cyklu pracy, a następnie kliknij OK, aby kontynuować. D. Wybierz cykl pracy do odzyskania. E. Wprowadź nowy identyfikator MWP. F. Wprowadź identyfikatory odczynników Master Mix oraz Metal Ions dla wszystkich fiolek odczynników do amplifikacji/detekcji w zestawie. G. Rozpocznij cykl pracy Recovery, klikając przycisk New run. a. W przypadku zestawu 240 testów dodaj 240 µl odczynnika HPV Mg/Mn do jednej fiolki HPV MMX (fiolka 0,5 ml z zestawu 240 testów). b. W przypadku zestawu 960 testów dodaj 450 µl odczynnika HPV Mg/Mn do każdej z dwóch fiolek HPV MMX (fiolki 1,0 ml z zestawu 960 testów). UWAGA: Cykl pracy Recovery musi się rozpocząć w ciągu 90 minut od dodania odczynnika HPV Mg/Mn do HPV MMX. System nie kontroluje czasu, jaki upływa od momentu dodania przygotowanych próbek do roboczego odczynnika Master Mix, będącego w użyciu w przebiegu pracy Recovery. Użytkownik końcowy musi zapewnić, że amplifikacja i detekcja rozpoczęła się w wyznaczonym czasie. H. Dokładnie zmieszaj odczynnik roboczy Master Mix, ostrożnie odwracając fiolkę(-ki). Nie mieszaj roboczego odczynnika Master Mix w mieszadle wibracyjnym. I. Przenieś 25 µl odczynnika roboczego Master Mix do odpowiednich pozycji w płytce z mikrodołkami. J. Umieść płytkę do ekstrakcji cyklu pracy, który ma zostać powtórzony, na osobną płytkę magnetyczną. K. Ręcznie przenieś 25 µl eluatu z pozycji w płytce do ekstrakcji do odpowiednich pozycji w płytce z mikrodołkami. Upewnij się, że zostały zachowane właściwe pozycje (np. eluat w pozycji A1 płytki do ekstrakcji jest przeniesiony do pozycji A1 płytki z mikrodołkami). Upewnij się, że do płytki z mikrodołkami nie został przeniesiony odczynnik MGP. L. Aby uszczelnić płytkę z mikrodołkami, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas M. Odwiruj płytkę z mikrodołkami za pomocą bębna wirówki przez co najmniej 5 sekund przy wartości RCF wynoszącej N. Przenieś płytkę do analizatora cobas z 480 i rozpocznij cykl amplifikacji i detekcji. O. Po zakończeniu procesu amplifikacji i detekcji wyładuj płytkę z mikrodołkami z analizatora cobas z 480. P. Aby przeglądać i akceptować poszczególne wyniki, postępuj zgodnie z instrukcją opisaną w Podręczniku użytkownika systemu cobas PL 12 Doc Rev. 10.0

13 Interpretacja wyników UWAGA: Cały proces walidacji testu i cyklu pracy jest przeprowadzany przez oprogramowanie cobas UWAGA: Ważny cykl pracy może obejmować zarówno ważne, jak i nieważne wyniki próbek. W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w sposób przedstawiony w tabelach 1 i 2. Tabela 1 Interpretacja wyników testu cobas 4800 HPV na obecność DNA wirusa HPV cobas 4800 Raport wyniku i jego interpretacja HPV Test Żądany wynik HPV High Risk Panel : Dodatnie HPV wysokiego stopnia ryzyka POS HR HPV Wynik próbki jest dodatni dla DNA któregokolwiek typu lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego stopnia ryzyka: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Ujemne HPV wysokiego stopnia ryzyka* NEG HR HPV DNA HPV typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Nieważne HPV wysokiego ryzyka Invalid HR HPV Wyniki są nieważne. Oryginalna próbka nie powinna być poddawana testowi więcej niż dwa razy, aby otrzymać ważne wyniki. Jeżeli wyniki nadal są nieważne, należy pozyskać nową próbkę. Brak wyników dla próbki Failed Instrukcje dotyczące przeglądania znaczników cyklu pracy i zalecanych czynności można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas W celu otrzymania ważnego wyniku ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. Żądany wynik HPV High Risk Panel Plus Genotyping : Dodatnie inne HPV wysokiego stopnia ryzyka POS Other HR HPV Wynik próbki jest dodatni dla DNA któregokolwiek typu lub kombinacji następujących typów wirusa HPV wysokiego stopnia ryzyka: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Ujemne inne HPV wysokiego stopnia ryzyka* NEG Other HR HPV DNA HPV typu 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Nieważne inne HPV wysokiego ryzyka Wynik innego HPV wysokiego ryzyka jest nieważny. Oryginalna próbka nie powinna być poddawana testowi więcej Invalid Other HR HPV niż dwa razy, aby otrzymać ważne wyniki innych HPV wysokiego ryzyka. Jeżeli wyniki nadal są nieważne, należy pozyskać nową próbkę. Dodatnie HPV16 POS HPV16 W próbce wykryto obecność DNA HPV typu 16. Ujemne HPV16* NEG HPV16 DNA HPV typu 16 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Nieważne HPV16 Invalid HPV16 Wynik HPV16 jest nieważny. Oryginalna próbka nie powinna być poddawana testowi więcej niż dwa razy, aby otrzymać ważne wyniki HPV16. Jeżeli wyniki nadal są nieważne, należy pozyskać nową próbkę. Dodatnie HPV18 POS HPV18 W próbce wykryto obecność DNA HPV typu 18. Ujemne HPV18* NEG HPV18 DNA HPV typu 18 było niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. Nieważne HPV18 Invalid HPV18 Wynik HPV18 jest nieważny. Oryginalna próbka nie powinna być poddawana testowi więcej niż dwa razy, aby otrzymać ważne wyniki HPV18. Jeżeli wyniki nadal są nieważne, należy pozyskać nową próbkę. Brak wyników dla próbki Failed Instrukcje dotyczące przeglądania znaczników cyklu pracy i zalecanych czynności można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas W celu otrzymania ważnych wyników ponownie przeprowadź test oryginalnej próbki. * Wynik ujemny nie wyklucza obecności zakażenia wirusem HPV, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz obecności ilości DNA wystarczającej do detekcji PL 13 Doc Rev. 10.0

14 Tabela 2 Interpretacja wyników testu cobas 4800 HPV dla pacjentów z nieprawidłowościami cytologicznymi Wyniki Interpretacja NEG Other HR HPV*, NEG HPV16, NEG HPV18 POS Other HR HPV*, NEG HPV16, NEG HPV18 POS HPV16 i/lub POS HPV18 Bardzo małe prawdopodobieństwo dla CIN2. Zwiększone prawdopodobieństwo, że CIN2 zostanie wykryte podczas kolposkopii. Najwyższe prawdopodobieństwo, że CIN2 zostanie wykryte podczas kolposkopii 34, 35. * Inne DNA HR HPV obejmują następujące typy: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. UWAGA: Ujemne wyniki HPV nie powinny być powodem rezygnacji z kolposkopii u kobiet. UWAGA: Oprócz wyników wyszczególnionych w tabeli powyżej możliwe są także wyniki nieważne dla jednej lub wielu kombinacji. W razie otrzymania takich wyników, jak na przykład: Other HR HPV NEG, HPV16 POS, HPV18 Invalid Dodatnie i ujemne wyniki powinny być interpretowane w sposób przedstawiony w tabeli 1. W przypadku przedstawionego przykładu wyniki dla HPV typu 18 są nieważne. Oryginalna próbka nie powinna być poddawana testowi więcej niż dwa razy, aby otrzymać ważne wyniki. Jeżeli wyniki nadal są nieważne, należy pozyskać nową próbkę. UWAGA: Ujemne wyniki wskazują, że stężenia DNA HPV są niewykrywalne lub poniżej wcześniej ustawionego progu. UWAGA: Dodatnie wyniki testu wskazują na obecność któregokolwiek lub więcej typów wirusa, jednak ponieważ pacjentki są często współzakażone jego typami niskiego ryzyka, nie wyklucza to obecności typów niskiego ryzyka u pacjentek z zakażeniami mieszanymi. UWAGA: Wyniki tego testu powinny być interpretowane wyłącznie w połączeniu z informacjami pochodzącymi z oceny klinicznej pacjentki i jej historii choroby. KONTROLA JAKOŚCI Każdy cykl pracy obejmuje jeden zestaw kontroli dodatnich i ujemnych testu cobas 4800 HPV. W przypadku każdego cyklu pracy, aby przez oprogramowanie cobas 4800 zostały wyświetlone możliwe do odnotowania wyniki testu cobas 4800 HPV tego cyklu pracy, muszą zostać uzyskane ważne wyniki zarówno dla kontroli dodatniej, jak i ujemnej. Kontrola dodatnia Wynik kontroli HPV (+) musi być oznaczony jako Valid. Jeżeli wyniki kontroli HPV (+) są stale nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola ujemna Wynik kontroli ( ) musi być oznaczony jako Valid. Jeżeli wyniki kontroli ( ) są stale nieważne, skontaktuj się z miejscowym biurem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy przedsięwziąć wyjątkową ostrożność, używając odczynników oraz mieszanin do amplifikacji, aby zapobiec kontaminacji PL 14 Doc Rev. 10.0

15 OGRANICZENIA METODY 1. Test cobas 4800 HPV wykrywa DNA typów 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68 wysokiego ryzyka. Test ten nie wykrywa DNA wirusa HPV typów niskiego ryzyka (np. 6, 11, 42, 43, 44), gdyż takie testy nie mają wartości klinicznej Test cobas 4800 HPV do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 oraz 68 nie jest zalecany do weryfikacji podejrzeń molestowania seksualnego. 3. Wykonywanie testu cobas 4800 HPV nie zostało dostatecznie zbadane u pacjentów zaszczepionych przeciwko wirusowi HPV Częstość występowania zakażenia wirusem HPV w populacji może wpływać na skuteczność testu. Dodatnie wartości predykcyjne ulegają zmniejszeniu przy badaniu populacji z niską częstością zachorowań lub osób, u których nie występuje ryzyko zakażenia. 5. Zakażenie wirusem HPV nie jest wskaźnikiem wyniku cytologicznego HSIL ani CIN wysokiego stopnia, nie wskazuje również na rozwój CIN2-3 lub raka. U większości kobiet zakażonych jednym lub większą ilością typów wirusa HPV wysokiego ryzyka nie rozwinie się CIN2-3 ani rak. 6. Ujemny wynik testu wirusa HPV wysokiego ryzyka nie wyklucza możliwości wystąpienia wyniku cytologicznego HSIL lub CIN2-3 albo raka. 7. Do badań należy używać tylko określonych rodzajów próbek. Test cobas 4800 HPV został zatwierdzony wyłącznie do użycia z próbkami z szyjki macicy pobranymi do pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR, płynnego podłoża PreservCyt i płynu konserwującego SurePath. 8. Detekcja HPV wysokiego ryzyka zależy od liczby jego kopii obecnych w próbce, na którą wpływać mogą metody pobierania próbek, czynniki związane z pacjentem, faza zakażenia i obecność substancji wpływających na detekcję. 9. Test cobas 4800 HPV obejmuje amplifikację i detekcję beta-globiny w celu zróżnicowania próbek HPV-ujemnych od tych, które nie wykazują sygnału HPV z powodu niewystarczającej masy komórkowej w próbce. Wszystkie próbki HPV-ujemne muszą mieć ważny sygnał beta-globiny w uprzednio zdefiniowanym zakresie, aby mogły zostać określone jako ważne ujemne przez system cobas Wiarygodność wyników zależy od odpowiedniego pobrania, transportu, przechowywania i przygotowania próbek. Należy postępować zgodnie z procedurami opisanymi w tej ulotce dołączonej do opakowania, ulotce dołączonej do opakowania pożywki do przechowywania pobranych komórek cobas PCR oraz Podręczniku użytkownika systemu cobas Dodanie do odczynnika Master Mix cobas 4800 HPV enzymu AmpErase umożliwia selektywną amplifikację docelowego DNA; jednak aby uniknąć skażenia odczynników, konieczne jest stosowanie dobrej praktyki laboratoryjnej i dokładne przestrzeganie procedur wyszczególnionych w niniejszej instrukcji. 12. Tego produktu mogą używać wyłącznie osoby przeszkolone w zakresie technik PCR i używania systemu cobas Zatwierdzono użycie tego produktu tylko z aparatem cobas x 480 i analizatorem cobas z 480. Z tym produktem nie można stosować żadnych innych urządzeń do przygotowania próbek ani systemów do PCR. 14. Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu określenia różnic występujących pomiędzy nimi. 15. Nie oceniano również wpływu innych potencjalnych zmiennych, takich jak upławy, stosowanie tamponów, irygacje itd., ani zmiennych związanych z pobieraniem wymazu. 16. Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnych regionów DNA genomowego wirusa brodawczaka ludzkiego, z którym wiążą się primery i/lub sondy używane w teście cobas 4800 HPV, chociaż rzadkie, mogą spowodować niewykrycie obecności DNA wirusa. 17. Obecność inhibitorów PCR może prowadzić do uzyskiwania wyników fałszywie ujemnych lub nieważnych. 18. W próbkach z szyjki macicy często są obecne wykrywalne wzrokowo ilości krwi pełnej, widoczne jako różowe lub jasnobrązowe zabarwienie. Próbki te są przetwarzane w systemie cobas 4800 w zwykły sposób. Jeśli stężenie krwi pełnej przekracza 2% (ciemnoczerwone lub brązowe zabarwienie) w próbkach w podłożu cobas PCR Cell Collection Media, płynnym podłożu PreservCyt lub płynie konserwującym SurePath, bądź 4% w przypadku próbek w płynie konserwującym SurePath poddanych obróbce z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas, istnieje prawdopodobieństwo uzyskania fałszywie ujemnych wyników. Szczegółowe informacje zawierają wyniki dotyczące wpływu różnych czynników na wyniki testu. 19. Użycie dopochwowego środka nawilżającego Replens powiązano z fałszywie ujemnymi wynikami próbek w płynie konserwującym SurePath PL 15 Doc Rev. 10.0

16 CHARAKTERYSTYKA SKUTECZNOŚCI Porównanie z testem porównawczym HPV z oznaczeniem CE Czułość kliniczna i swoistość testu w wykrywaniu stanów chorobowych (³ CIN2) została określona dla testu cobas 4800 HPV oraz testu porównawczego HPV z oznaczeniem CE 38 w populacji kobiet w wieku co najmniej 21 lat z wynikami ASC-US badania cytologicznego określonymi w rutynowym badaniu przesiewowym w kierunku raka szyjki macicy. Wszystkie testy przeprowadzono z użyciem próbek z szyjki macicy w płynnej pożywce PreservCyt. W przypadku wszystkich 1578 pacjentek z początkowym wynikiem ASC-US badania cytologicznego wykonano kolposkopię i uzyskano ważne wyniki testów HPV oraz biopsji szyjki macicy. Stan zdrowia pacjentek został stwierdzony przez wykonanie panelu głównych badań patologicznych próbek z biopsji uzyskanych podczas zabiegu kolposkopii. W tabeli 3 podsumowano wyniki dla populacji z wynikiem ASC-US badania cytologicznego i wykazano, że skuteczność testu cobas 4800 HPV była porównywalna z testem referencyjnym. Tabela 3 Porównanie skuteczności testu cobas 4800 HPV i testu porównawczego HPV z oznaczeniem CE w wykrywaniu stanów ³ CIN2 i ³ CIN3 w populacji z wynikiem ASC-US Test cobas 4800 HPV Estymacja punktowa 95% CI CIN2 Test HPV z oznaczeniem CE Estymacja punktowa 95% CI Czułość (%) 90,0 (72/80) (81,5, 94,8) 87,2 (68/78) 1 (78,0, 92,9) Swoistość (%) 70,5 (1056/1498) (68,1, 72,7) 71,1 (1056/1485) 2 (68,8, 73,4) PPV (%) 14,0 (72/514) (12,8, 15,3) 13,7 (68/497) (12,4, 15,1) NPV (%) 99,2 (1056/1064) (98,6, 99,6) 99,1 (1056/1066) (98,3, 99,5) Częstość występowania (%) 5,1 (80/1578) (4,1, 6,3) 5,0 (78/1563) (4,0, 6,2) CIN3 Czułość (%) 93,5 (43/46) (82,5, 97,8) 91,3 (42/46) (79,7, 96,6) Swoistość (%) 69,3 (1053/1517) (66,9, 71,5) 70,0 (1062/1517) (67,7, 72,3) PPV (%) 8,4 (43/514) (7,6, 9,2) 8,5 (42/497) (7,6, 9,4) NPV (%) 99,7 (1061/1064) (99,2, 99,9) 99,6 (1062/1066) (99,0, 99,9) Częstość występowania (%) 2,9 (43/1578) (2,2, 3,9) 3,0 (46/1563) (2,2, 3,9) 1 Wyniki dla dwóch pacjentek z rozpoznaniem ³ CIN2 nie mogły zostać określone za pomocą testu porównawczego HPV z oznaczeniem CE z powodu niewystarczającej objętości próbki będącej wynikiem wielokrotnego wykonania testów. 2 Wyniki dla trzynastu pacjentek z rozpoznaniem < CIN2 nie mogły zostać określone za pomocą testu porównawczego HPV z oznaczeniem CE z powodu niewystarczającej objętości próbki będącej wynikiem wielokrotnego wykonania testów. Ryzyko wystąpienia raka szyjki macicy (³ CIN2) u kobiet w wieku ³ 30 lat z prawidłowymi wynikami badania cytologicznego jest 7,29 razy wyższe w przypadku otrzymania dodatniego wyniku testu cobas 4800 HPV na obecność wirusa HPV wysokiego ryzyka niż w przypadku ujemnego wyniku testu cobas 4800 HPV. Oceny względnego ryzyka i ich 95% przedziały ufności przedstawiono w tabeli 4. W przypadku kobiet w wieku 30 lat lub starszych test cobas 4800 HPV można zastosować do oceny obecności lub braku genotypów 16 i 18 wirusa HPV. Ryzyko wystąpienia raka szyjki macicy (³ CIN2) jest 13,71 razy wyższe w przypadku dodatniego wyniku testu cobas 4800 HPV dla wirusa HPV typu 16 i/lub 18 niż w przypadku ujemnego wyniku oraz 2,51 razy wyższe w przypadku dodatniego wyniku testu cobas 4800 HPV dla wirusa HPV typu 16 i/lub 18 w porównaniu z dodatnim wynikiem testu cobas 4800 HPV dla 12 pozostałych typów wysokiego ryzyka. W każdym przypadku, gdy dolna granica przedziału ufności 95% przekracza wartość 1, sugeruje to statystycznie wysokie ryzyko rozwoju raka szyjki macicy w przypadku uzyskania dodatniego wyniku testu HPV PL 16 Doc Rev. 10.0

17 Tabela 4 Względne ryzyko raka szyjki macicy (³ CIN2 w głównym badaniu patologicznym) u kobiet w wieku ³ 30 lat z wynikami badania cytologicznego w normie* Wynik HPV Ocena względnego ryzyka 95% CI* Porównanie dodatniego i ujemnego 7,29 (3,99, 22,11) 16+/18+ w por. do ujemnego 13,71 (7,31, 41,92) 16+/18+ w por. do 12 innych HR+ 2,51 (1,73, 3,61) Uwaga: Do komórki zerowej szacowanej liczby chorych pacjentek w każdej z 1000 prób bootstrap dodano 0,5 * 95% CI wynosi od 2,5 do 97,5 percentylowego przedziału ufności typu bootstrap na podstawie 1000 prób bootstrap Populacja NILM (³ 30 lat) ocena skuteczności W przypadku populacji z wynikiem NILM (³ 30 lat) szacunkowe wartości czułości i swoistości wraz z 95% przedziałami ufności dla dodatnich wyników HR HPV w porównaniu z ujemnymi wynikami HR HPV przedstawiono w tabeli 5 dla wyników nieskorygowanych. Nieskorygowane wyniki czułości i swoistości testu w wykrywaniu rozpoznania histologicznego ³ CIN2 wynosiły odpowiednio 83,2% (109/131) z 95% przedziałem ufności: od 75,9% do 88,6% i 60,4% (2492/4127) z 95% przedziałem ufności: od 58,9% do 61,9%. Nieskorygowane wyniki czułości i swoistości testu cobas HPV Test w wykrywaniu rozpoznania histologicznego ³ CIN3 wynosiły odpowiednio 90,0% (72/80) z 95% przedziałem ufności: od 81,5% do 94,8% i 60,0% (2506/4178) z 95% przedziałem ufności: od 58,5% do 61,5%. Tabela 5 Skuteczność testu cobas 4800 HPV w populacji z wynikiem NILM (³ 30 lat) (nieskorygowane wartości szacunkowe) Rozpoznanie CPR Skuteczność Wartość szacunkowa 95% CI ³ CIN2 Czułość (%) 83,2 (109/131) (75,9; 88,6) Swoistość (%) 60,4 (2492/4127) (58,9; 61,9) PPV (%) 6,3 (109/1744) (5,8; 6,8) NPV (%) 99,1 (2492/2514) (98,7; 99,4) Częstość występowania (%) 3,1 (131/4258) (2,6; 3,6) ³ CIN3 Czułość (%) 90,0 (72/80) (81,5; 94,8) Swoistość (%) 60,0 (2506/4178) (58,5; 61,5) PPV (%) 4,1 (72/1744) (3,8; 4,5) NPV (%) 99,7 (2506/2514) (99,4; 99,8) Częstość występowania (%) 1,9 (80/4258) (1,5; 2,3) Populacja ogólna (³ 25 lat) porównanie skuteczności testów HPV z badaniami cytologicznymi Skuteczność kliniczną testu cobas HPV i badania cytologicznego na podłożu płynnym (PreservCyt) określono w populacji kobiet w wieku 25 lat i starszych, niezależnie od wyniku badania cytologicznego (populacja ogólna). W populacji ogólnej (³ 25 lat) szacunkowe wyniki dotyczące czułości i swoistości testu cobas HPV Test w porównaniu z badaniem cytologicznym w wykrywaniu ³ CIN2 i ³ CIN3 przedstawiono 38 w Tabeli 6. Nieskorygowane wartości czułości testu cobas HPV i badania cytologicznego w przypadku wykrywania ³ CIN2 wynosiły odpowiednio 88,2% (380/431) z 95% przedziałem ufności 84,8 90,9% i 51,5% (222/431) z przedziałem ufności 46,8 56,2%. Nieskorygowane wartości czułości testu cobas HPV i badania cytologicznego w przypadku wykrywania ³ CIN3 wynosiły odpowiednio 92,0% (252/274) z 95% przedziałem ufności 88,1 94,6% i 53,3% (146/274) z przedziałem ufności 47,4 59,1%. Skorygowane pod kątem błędu weryfikacji wartości swoistości testu cobas HPV i badania cytologicznego w przypadku wykrywania ³ CIN2 wynosiły odpowiednio 90,5% (36 343/40 163) z przedziałem ufności 90,2 90,8% i 94,1% (37 811/40 163) z przedziałem ufności 93,9 94,4% PL 17 Doc Rev. 10.0

18 Tabela 6 Porównanie skuteczności testu cobas 4800 HPV i badania cytologicznego w przypadku wykrywania ³ CIN2 i ³ CIN3 w populacji ogólnej (³ 25 lat) CIN2 Czułość Swoistość PPV NPV CIN3 Czułość Swoistość PPV NPV Badanie cytologiczne Test cobas HPV % (n) 95% CI % (n) 95% CI 51,5 (222/431) 73,4 (5428/7392) 10,2 (222/2186) 96,3 (5428/5637) 53,3 (146/274) 73,0 (5509/7549) 6,7 (146/2186) 97,7 (5509/5637) (46,8 56,2) (72,4 74,4) ( ) (95,9 96,6) (47,4 59,1) (72,0 74,0) 88,2 (380/431) 57,8 (4270/7392) 10,9 (380/3502) 98,8 (4270/4321) 92,0 (252/274) 56,9 (4299/7549) (84,8 90,9) (56,6 58,9) (10,4 11 3) (98,5 99,1) (88,1 94,6) (55,8 58,1) (6,0 7,4) 7,2 (252/3502) (6,9 7,5) (97,4 98,0) 99,5 (4299/4321) (99,2 99,7) Granica wykrywalności Granica detekcji (LOD) genotypów wysokiego ryzyka HPV16, HPV18 i HPV31 wirusa HPV została określona dla testu cobas 4800 HPV. Granice detekcji (LOD) oszacowano z użyciem: 1) plazmidów HPV typu 31, HPV typu 16 i HPV typu 18 w tle poddanych pulowaniu HPVujemnych próbek pacjentów pobranych do płynnego podłoża PreservCyt i płynu konserwującego SurePath oraz 2) HPV linii komórkowych dodatnich dla SiHa (HPV16) i HeLa (HPV18) w płynnym podłożu PreservCyt i płynie konserwującym SurePath, zawierających tło HPV-ujemnej linii komórkowej (HCT-15). Plazmid oraz linie komórkowe zostały rozcieńczone do stężeń poniżej, powyżej oraz na przewidywanych poziomach granicy detekcji (LOD). Dla każdego z 3 zestawów odczynników, zarówno w płynnym podłożu PreservCyt, jak i płynie konserwującym SurePath, dla każdego plazmidu lub linii komórkowej przetestowano co najmniej 60 kopii. Wyniki dotyczące próbek w płynie konserwującym SurePath podawane są w po przeprowadzeniu obróbki z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas oraz bez niej. Granica detekcji (LOD) to granica zawartości DNA wirusa HPV w próbce, której wyniki testowania są co najmniej w 95% dodatnie. Tabele 7, 8 i 9 zawierają wyniki dla zestawu odczynników, wykazującego najbardziej konserwatywną (najwyższą) granicę detekcji (LOD) w analizie odpowiednio płynnego podłoża PreservCyt Solution i płynu konserwującego SurePath. Tabela 7 Poziomy granicy detekcji dla HPV typu 31, 16, 18 oraz linii komórkowych SiHa (HPV16) i HeLa (HPV18) w płynnym podłożu PreservCyt Typ HPV Miano (kopie lub komórki/ml) Liczba dodatnich/ przetestowanych % wyników dodatnich 95% przedział ufności Dolny Górny /60 100% 94% 100% /61 97% 89% 100% /60 82% 70% 90% /60 100% 94% 100% /60 100% 94% 100% /61 90% 80% 96% /60 100% 94% 100% /60 100% 94% 100% /61 69% 56% 80% SiHa (HPV 16) /66 100% 95% 100% SiHa (HPV 16) /65 98% 92% 100% SiHa (HPV 16) 50 57/60 95% 86% 99% HeLa (HPV 18) 80 60/60 100% 94% 100% HeLa (HPV 18) 40 60/60 100% 94% 100% HeLa (HPV 18) 20 56/60 93% 84% 98% PL 18 Doc Rev. 10.0

19 Tabela 8 Poziomy granicy detekcji dla HPV typu 31, 16, 18 oraz linii komórkowych SiHa (HPV16) i HeLa (HPV18) w płynie konserwującym SurePath Typ HPV Miano (kopie lub komórki/ml) Liczba dodatnich/ przetestowanych % wyników dodatnich 95% przedział ufności Dolny Górny /60 100% 94% 100% /60 95% 86% 99% /60 77% 64% 87% /60 100% 94% 100% /60 100% 94% 100% /60 85% 73% 93% 18 1,500 60/60 100% 94% 100% /60 100% 94% 100% /60 93% 84% 98% SiHa (HPV 16) /60 98% 91% 100% SiHa (HPV 16) 50 57/60 95% 86% 99% SiHa (HPV 16) 25 42/60 70% 57% 81% HeLa (HPV 18) 80 60/60 100% 94% 100% HeLa (HPV 18) 40 60/60 100% 94% 100% HeLa (HPV 18) 20 59/60 98% 91% 100% Tabela 9 Poziomy granicy wykrywalności wirusa HPV typu 31, 16, 18 oraz linii komórkowych SiHa (HPV 16) i HeLa (HPV 18) w płynie konserwującym SurePath po przeprowadzeniu obróbki z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas Typ HPV Miano (kopie lub komórki/ml) Liczba dodatnich/ przetestowanych % wyników dodatnich 95% przedział ufności Dolny Górny /60 100% 94% 100% /59 100% 94% 100% /60 90% 80% 96% /60 100% 94% 100% /60 98% 91% 100% /60 67% 53% 78% /60 100% 94% 100% /60 100% 94% 100% /59 93% 84% 98% SiHa (HPV 16) /60 100% 94% 100% SiHa (HPV 16) /60 100% 94% 100% SiHa (HPV 16) /60 92% 82% 97% HeLa (HPV 18) 80 60/60 100% 94% 100% HeLa (HPV 18) 40 59/60 98% 91% 100% HeLa (HPV 18) 20 43/60 72% 59% 83% PL 19 Doc Rev. 10.0

20 Weryfikacja reprezentatywności Aby dokonać weryfikacji, czy test cobas 4800 HPV jest zdolny do precyzyjnej detekcji wszystkich genotypów HPV wysokiego ryzyka, określono granicę detekcji (LOD) (tabele 10, 11 i 12) dla genotypów 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68. Czułość testu cobas 4800 HPV dla genotypów 16, 18 i 31 HPV została określona w badaniu granicy detekcji, opisanym wcześniej w tej ulotce dołączonej do opakowania. Ilościowo określone ilości plazmidu każdego z genotypów HPV zostały rozcieńczone do stężeń poniżej, powyżej oraz na przewidywanych poziomach granicy detekcji (LOD), zarówno w płynnym podłożu PreservCyt, jak i w płynie konserwującym SurePath, zawierającym HPV ujemne komórki HCT-15. Jedna seria odczynników została użyta do wytworzenia co najmniej 48 kopii dla każdego z poziomów dodatnich dla każdej z pożywek. W przypadku badania próbek w płynie konserwującym SurePath poddanych obróbce z użyciem buforu do przygotowywania próbek cobas (tabela 12) materiał tła został przygotowany z próbek pobranych z szyjki macicy do płynu konserwującego SurePath, które zostały przebadane w 24 powtórzeniach z użyciem dwóch serii odczynników. Dla każdego typu wirusa HPV zaraportowaną granicę (LOD) określono jako najniższe stężenie oznaczenia z 95-procentowym odsetkiem trafień wyników dodatnich oraz z co najmniej 95-procentowym odsetkiem trafień wszystkich wyższych stężeń. Tabela 10 Podsumowanie granicy detekcji genotypu wysokiego ryzyka w badaniu reprezentatywności genotypu HPV cobas 4800 HPV (płynne podłoże PreservCyt) Typ DNA HPV LOD (kopie/ml) Liczba dodatnich/ przetestowanych Odsetek trafień 95% przedział ufności Dolny Górny /48 96% 86% 99% /48 100% 93% 100% /48 100% 93% 100% /48 96% 86% 99% /48 96% 86% 99% /48 100% 93% 100% /48 100% 93% 100% /48 98% 89% 100% /48 96% 86% 99% /48 100% 93% 100% /48 100% 93% 100% Tabela 11 Podsumowanie granicy detekcji genotypu wysokiego ryzyka w badaniu reprezentatywności genotypu HPV cobas 4800 HPV (płyn konserwujący SurePath) Typ DNA HPV LOD (kopie/ml) Liczba dodatnich/ Odsetek 95% przedział ufności przetestowanych trafień Dolny Górny /49 96% 93% 100% /48 100% 93% 100% /53 100% 93% 100% /49 100% 93% 100% /48 98% 89% 100% /51 100% 93% 100% /50 100% 93% 100% /49 100% 93% 100% /48 96% 86% 99% /48 98% 89% 100% /48 100% 93% 100% PL 20 Doc Rev. 10.0