WĘGLWDANY I. Wprowadzenie teoretyczne ukry, sacharydy, są związkami pochodzenia naturalnego; odgrywają one, podobnie jak białka, olbrzymią rolę w procesach biologicznych. Najbardziej ogólny podział cukrów przewiduje wyodrębnienie dwóch klas związków: 1. ukry właściwe węglowodany, 2. Związki cukropodobne substancje pektynowe, hemicelulozy, gumy roślinne itp. Zwyczajowa nazwa węglowodany jest w powszechnym użyciu; z nazwą wiąże się skład chemiczny, który w większości przypadków daje się wyrazić ogólnym wzorem n ( 2 ) m. Aby zaliczyć dany związek do węglowodanów należy brać pod uwagę jego właściwości chemiczne i fizjologiczne. gólnie można powiedzieć, że węglowodany są to polihydroksyaldehydy i polihydroksyketony, lub substancje dające po hydrolizie te związki. Węglowodany obejmują bardzo liczną klasę związków o różnych właściwościach. Należą tu związki drobno- i wielkocząsteczkowe, dobrze rozpuszczalne jak i praktycznie nie rozpuszczalne w wodzie, o smaku słodkim i bez smaku, hydrolizujące i nie hydrolizujące. Tę dużą klasę związków dzielimy zasadniczo na trzy typy: 1. Monosacharydy (jednocukry, cukry proste), które nie ulegają hydrolizie do prostszych cząsteczek; odpowiadają z reguły wzorowi n 2n n, gdzie n = 2, 3, 4,... 10; 2. ligosacharydy (wielocukry proste), czyli pochodne monosacharydów, zawierające wiązanie eterowe (acetalowe); w skład jednej cząsteczki oligosacharydu może wchodzić od 2 do 9 cząsteczek monosacharydów; 3. Polisacharydy (wielocukry złożone), makrocząsteczki o budowie podobnej do oligosacharydów; w wyniku hydrolizy dają wielką liczbę cząsteczek monosacharydów. Monosacharydy Monosacharydy (jednocukry) są to polihydroksyaldehydy lub polihydroksyketony, w których grupa karbonylowa występuje głównie w postaci wewnętrznych hemiacetali. Tworzą formy pierścieniowe. 2 2 2 glukoza fruktoza α,d(+)glukopiranoza β,d(-)fruktofuranoza 1
Ze względu na budowę ich pierścienia traktowane są jako pochodne piranu lub furanu. W roztworach wodnych cukry występują głównie w formie pierścieniowej, ale zawsze w równowadze z nieznaczną ilością formy łańcuchowej, dzięki której wykazują własności redukujące w środowisku alkalicznym oraz kondensują jak aldehydy i ketony z fenylohydrazyną, hydroksyloaminą itp. Monosacharydy dzielimy w zależności od: a. Liczby atomów węgla w cząsteczce na: triozy, tetrozy, pentozy, heksozy, itd.; b. becności grupy funkcyjnej na: aldozy posiadające grupę aldehydową, ketozy zawierające grupę ketonową. Najważniejsze znaczenie z monosacharydów mają pentozy i heksozy. Tabela XI. Przykłady monosacharydów. Pentozy ( 5 10 5 ) eksozy ( 6 12 6 ) aldoza ketoza aldoza ketoza arabinoza ksyloza liksoza ryboza rybuloza ksyluloza glukoza mannoza galaktoza fruktoza sorboza ligosacharydy ligosacharydydami nazywamy wielocukry proste, zbudowane z niewielkiej liczby cukrów prostych (monosacharydów), połączonych wiązaniami glikozydowymi. Najprostszymi, a jednocześnie najważniejszymi i najbardziej rozpowszechnionymi oligosacharydami są dwucukry, które w wyniku hydrolizy (kwasowej lub enzymatycznej), dają jednocukry i to najczęściej heksozy. W skład dwucukrów mogą wchodzić dwie identyczne lub różne reszty jednocukrów. Jednocukry wchodzące w skład dwucukrów mają budowę cykliczną i łączą się między sobą za pomocą wiązania -glikozydowego α lub β, a więc w ten sposób, że atom wodoru hemiacetalowej grupy wodorotlenowej (glikozydowej) jest substytuowany resztą drugiej cząsteczki cukru: 2
6 11 5 6 11 5 2 Wiązanie glikozydowe jest wiązaniem typu eterowego, powstającym przez wydzielenie cząsteczki wody. W dwucukrach redukujących cząsteczka wody wydziela się z dwóch grup, z których jedna jest grupą glikozydową. W dwucukrach nieredukujących cząsteczka wody wydziela się z dwóch grup glikozydowych (obie są zablokowane). becność lub brak w cząsteczce dwucukru glikozydowej hemiacetalowej grupy, silnie wpływa na właściwości dwucukrów. Dwucukier posiadający jedno wiązanie hemiacetalowe daje typowe reakcje jednocukrów, a mianowicie: a. redukuje odczynniki Tollensa, Fehlinga i Benedicta; b. daje oksymy, hydrazony i osazony; c. ulega mutarotacji. Dwucukry o powyższych właściwościach nazywamy dwucukrami redukującymi. Dwucukry posiadające wiązanie acetalowe, powstałe przez eliminację cząsteczki 2 z obydwu hydroksyli hemiacetalowych nie dają typowych reakcji jednocukrów; są to dwucukry nieredukujące. 2 reszta redukująca dwucukier redukujący 2 reszta nieredukująca 3
2 2 dwucukier nieredukujący Najbardziej znanymi dwucukrami redukującymi są maltoza i laktoza. Przedstawicielem dwucukrów nieredukujących jest sacharoza. Zbudowana jest z α-d-glukopiranozy i β-dfruktofuranozy. Tabela XII. Przykłady dwucukrów. Nazwa dwucukru Sacharoza Maltoza Laktoza Produkty hydrolizy D-glukoza i D-fruktoza Dwie cząsteczki D-glukozy D-glukoza i D-galaktoza Polisacharydy Polisacharydy są glikozydami, których cząsteczki utworzone są z setek lub tysięcy reszt węglowodanowych, połączonych ze sobą poprzez atomy tlenu grup hemiacetalowych. Najważniejszymi polisacharydami są: 1. skrobia pochodzenia wyłącznie roślinnego, 2. glikogen pochodzenia wyłącznie zwierzęcego, 3. celuloza. harakterystyczną reakcją odróżniającą od siebie wymienione polisacharydy jest reakcja z jodem. Skrobia barwi się na niebiesko, glikogen na brunatno-czerwono, celuloza na żółto. Skrobia jest podstawowym składnikiem świata roślinnego. Granulki skrobi, różniące się rozmiarami, są charakterystyczne dla roślin, z których pochodzą; zbudowane są z dwóch warstw: a. zewnętrznej a m y l o p e k t y n y nierozpuszczalnej w wodzie; b. wewnętrznej a m y l o z y rozpuszczalnej w wodzie. 4
Produktami hydrolizy kwasowej skrobi są w początkowym etapie różne dekstryny o coraz niższym ciężarze cząsteczkowym. W dalszej kolejności uzyskuje się maltozę, a w końcu glukozę. skrobia 2 amylodekstryny 2 erytrodekstryny 2 achrodekstryny 2 maltoza 2 glukoza II. zęść praktyczna 1. Próba Molischa z α-naftolem. Wykonanie: Do około 1 cm 3 1% roztworu galaktozy dodać 2 krople alkoholowego roztworu α-naftolu, dobrze wymieszać i podwarstwić około 1 cm 3 stęż. 2 S 4. Po około 3 minutach, na granicy warstw, powstaje czerwono-fioletowy pierścień. zęsto, poniżej pierścienia, pojawia się krążek zielony, który pochodzi od zanieczyszczeń α-naftolu. 2. Próba Seliwanowa na ketozy. Wyjaśnienie: Ketozy w obecności stężonego kwasu solnego dają reakcję barwną z rezorcyną. Próbę uważa się za dodatnią jedynie wtedy, gdy zabarwienie występuje przed upływem 45 sekund. Przy dłuższym ogrzewaniu, odczyn ten wypada również dodatnio z sacharozą i inuliną, które pod wpływem zawartego w odczynniku kwasu solnego ulegają hydrolizie do fruktozy. Wykonanie: Do około 0.5 cm 3 odczynnika Seliwanowa (0.05% roztwór rezorcyny w kwasie solnym rozcieńczonym wodą destylowaną w stosunku 1 : 2) dodać 0.5-1 cm 3 5% roztworu fruktozy, zmieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej dokładnie 45 sekund, po czym oziębić. W obecności ketoz próba barwi się na czerwono, zaś przy dużych ich stężeniach powstaje osad. 3. Próba Biala na pentozy. Wyjaśnienie: Zasada próby oparta jest również na zachowaniu się cukru wobec stęż. kwasów, a modyfikacja polega na wprowadzeniu do reakcji Fel 3. Próba ta jest podstawą ilościowego, kolorymetrycznego oznaczania pentoz (metoda Mejbaum-Katzenelenbogen) np. w kwasach nukleinowych. 5
Wykonanie: Do około 1 cm 3 odczynnika Biala (roztwór orcyny w stęż. kwasie solnym z dodatkiem Fel 3 ) dodać 0.5 cm 3 1% roztworu ksylozy i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Po 45 sekundach roztwór zabarwia się na zielono. 4. Próby redukcyjne. a. Redukcja heksacyjanożelazianu(iii) potasu. Wyjaśnienie: eksacyjanożelazian(iii) pod wpływem cukru redukującego ulega redukcji do heksacyjanożelazianu(ii). Redukcja ta jest podstawą oznaczania cukru we krwi metodą agedorna i Jensena oraz w moczu metodą van Slyke a. becnie metody te nie są stosowane w analityce medycznej. Wykonanie: Do 2 cm 3 1% zasadowego roztworu heksacyjanożelazianu(iii) potasu dodać 2 cm 3 roztworu 10% glukozy (cukru redukującego) i 1 kroplę 2 M Na, ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Żółta barwa heksacyjanożelazianu(iii) znika. b. Próba Fehlinga. Wyjaśnienie: Liczne próby na cukry oparte są na redukcji dwuwartościowego jonu miedziowego do jednowartościowego jonu miedziawego, są to próby: Trommera, Fehlinga, ainesa, Benedicta i Barfoeda. W próbie Fehlinga po zmieszaniu odczynników Fehling I i Fehling II (I us 4 5 2 w rozcieńczonym 2 S 4, II roztwór winianu sodowopotasowego i Na) powstaje zasadowy roztwór kompleksu wodorotlenku miedzi z winianem, co zapobiega wytrącaniu się u() 2 i maskowaniu końcowego produktu reakcji, czerwonego u 2. Kompleks posiada strukturę trójwodnego winianu miedziowego, z sześciokrotnie skoordynowanym kationem u ++. Dodany cukier redukujący ulega utlenieniu oddając elektrony, które przyjmowane są przez u ++. W wyniku tego kompleks wodorotlenku miedzi z winianem rozpada się, u 2+ redukuje się do u + i po ogrzaniu wytrąca się w postaci osadu tlenku miedziawego (u 2 ). Wykonanie: Zmieszać po 1 cm 3 roztworów Fehlinga I i II, ogrzać do wrzenia (celem sprawdzenia czy nie wystąpi redukcja własna odczynnika), po czym dodać 7 kropli 10% glukozy i ponownie ogrzać. Pojawia się osad o barwie od żółtej do czerwonej, co zależy od stanu rozproszenia powstającego tlenku miedziawego. c. Próba Trommera. Fe(N) 6 3 + Fe(N) 6 Wyjaśnienie: Należy pamiętać, ze w próbie tej rolę solubilizatorów wodorotlenku miedziowego spełnia sam cukier (zamiast winianu sodowo-potasowego, kwasu cytrynowego lub glicerolu) i dlatego błędem jest dodawanie zbyt dużej ilości siarczanu miedziowego, gdyż e 4 6
nadmiar wytworzonego u() 2 po ogrzaniu przejdzie w czarny u i zamaskuje reakcję. W przypadku, gdy dodano zbyt dużo us 4 i wytrącający się wodorotlenek miedzi nie rozpuszcza się, należy osad odsączyć, po czym dopiero ogrzać próbę. Wykonanie: Do 1 cm 3 10% roztworu glukozy dodać 1 cm 3 roztworu 2 M Na, po czym kroplami roztwór siarczanu miedziowego dopóty, dopóki strącający się wodorotlenek miedziowy jeszcze się rozpuszcza przy wytrząsaniu płynu. Podgrzać górną część płynu do wrzenia. Powstaje żółto-pomarańczowy lub czerwony osad tlenku miedziawego. 5. dróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących. Próba Barfoeda w modyfikacji Tauber-Kleinera. Wyjaśnienie: Dwucukry redukujące dają dodatni wynik reakcji dopiero po dłuższym ogrzewaniu, gdy ulegną hydrolizie do cukrów prostych. Próba jest stosowana w diagnostyce cukromoczu dla odróżnienia redukcji pochodzącej od glukozy lub od laktozy. Wykonanie: Do dwóch probówek odmierzyć po 1 cm 3 odczynnika Barfoeda (roztwór octanu miedzi i kwasu mlekowego), po czym do pierwszej dodać 1 cm 3 roztworu 10% glukozy, do drugiej 1 cm 3 5% laktozy, zmieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej dokładnie 15 minut. sad tlenku miedziawego pojawia się tylko w probówce zawierającej glukozę. Następnie probówki umieścić w łaźni wrzącej i ogrzewać przez następne 15 minut. sad tlenku miedziawego pojawia się również w probówce zawierającej laktozę. 6. Właściwości skrobi. Wyjaśnienie: harakterystyczną reakcją dla wielocukrowców zbudowanych z cząsteczek glukozy jest zabarwienie z jodem. Amyloza daje niebieskie zabarwienie, amylopektyna fioletowe, a glikogen brunatno-czerwone. Niebieska barwa jest charakterystyczna dla długich spiralnie skręconych nici, bez bocznych odgałęzień. W miarę skracania się łańcucha wzmaga się zabarwienie czerwone. Produkty degradacji skrobi (dekstryny) o długich łańcuchach barwią się na niebiesko-fioletowo (amylodekstryny), o średniej długości barwią się na czerwono (erytrodekstryny), a krótkie łańcuchy nie zmieniają barwy jodu (achrodekstryny). W miarę postępu hydrolizy ilość wolnych grup aldehydowych w dekstrynach wzrasta. ząsteczki skrobi w kleiku skrobiowym są otoczone płaszczem wodnym. Dodanie substancji wiążących wodę (siarczan amonu) powoduje strącanie się skrobi z roztworu. Skrobia jest źle rozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych. Amyloza z niektórymi rozpuszczalnikami (1-butanol) tworzy trudno rozpuszczalne związki inkluzyjne. 7
Wykonanie: a. dczyn z jodem: Do 1 cm 3 1% kleiku skrobiowego dodać kroplę odczynnika Lugola. Występuje niebieskie zabarwienie znikające po krótkim ogrzaniu i zjawiające się ponownie po oziębieniu. b. Wytrącanie skrobi z roztworu alkoholem etylowym: do 2 cm 3 1 % kleiku skrobiowego wlać podwójną objętość alkoholu etylowego. Strąca się osad skrobi. 8