44 IZOLACJA GENOMOWEGO DNA Z DROŻDŻY PIEKARNICZYCH SACCHAROMYCES CEREVISIAE Z WYKORZYSTANIEM ELEKTROFOREZY W ŻELU AGAROZOWYM W CELU WIZUALIZACJI WYNIKÓW Autorzy: Sylwia Czyjt, Gabriela Jasińska, Katarzyna Kloc, Małgorzata Piela, Radosław Zawół, Maciej Kluz Opiekun: mgr Maciej Kluz SKN Technologów Żywności Ferment Sekcja Biotechnologii i Mikrobiologii Uniwersytet Rzeszowski, Wydział Biologiczno-Rolniczy e-mail: m.kluz@univ.rzeszow.pl, sylwia_czyjt@op.pl, radekr1@vp.pl, k_kloc@wp.pl, m_piela@wp.pl Słowa kluczowe: elektroforeza, izolacja, Saccharomyces cerevisiae, DNA Wstęp Kto z nas nie widział, jak rośnie ciasto, czy nie pił piwa lub wina? To produkty wytwarzane przy udziale drożdży. Ale przecież jest to tylko jeden z wielu organizmów związanych z człowiekiem od zarania cywilizacji. Dlaczego więc akurat drożdże stały się tym pierwszym organizmem eukariotycznym, którego genom poddano tak intensywnym badaniom? Drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae), jako odrębny gatunek opisano w roku 1883. Ten prosty, jednokomórkowy grzyb zaliczany do workowców jest organizmem "przyjaznym" człowiekowi nie tylko ze względu na swą użyteczność kulinarną; nie jest również zakaźny, a więc praca z nim nie pociąga za sobą ryzyka zachorowania. Eksperymentowanie z drożdżami nie nastręcza również problemów etycznych. Przynajmniej takich, z jakimi borykają się badacze prowadzący doświadczenia na zwierzętach. Podobnie jak Escherichia coli wśród bakterii, tak drożdże wśród organizmów eukariotycznych są szeroko wykorzystywanym modelowym obiektem badań. Drożdże pod względem budowy komórki, jak i przebiegu szlaków metabolicznych, w dużej mierze przypominają organizmy wielokomórkowe z człowiekiem włącznie. Model to tym bardziej atrakcyjny, że 75 % jego genomu zajmują geny, a tylko 25 % to sekwencje niekodujące. U człowieka sytuacja jest odmienna - większość, bo aż 95 % genomu, to niekodujące "wypełnienie", którego rola ciągle jest mało zrozumiała, a geny stanowią pozostałe 5 %. Oznacza to w uproszczeniu, że znalezienie nowego genu u drożdży wymaga około piętnastokrotnie mniejszego nakładu pracy niż u człowieka [3,4]. Od pierwszego opisania gatunku do lat osiemdziesiątych naszego stulecia zidentyfikowano ponad tysiąc genów drożdżowych rozmieszczonych na 16 chromosomach. Drożdże stały się jednym z najlepiej poznanych organizmów żywych. Jednak, mimo wiedzy i doświadczenia kilku tysięcy naukowców pracujących na całym świecie nad drożdżami, tempo odkrywania nowych genów wyraźnie słabło. W takiej właśnie sytuacji przystąpiono do
45 realizacji projektu sekwencjonowania całego drożdżowego genomu, czyli systematycznego ustalania jego sekwencji nukleotydowej [5]. Międzynarodowa współpraca 600 naukowców sponad 100 laboratoriów doprowadziła do tego, że 24 kwietnia 1996 roku w sieci Internet udostępniona została pełna sekwencja nukleotydowa genomu drożdży piekarniczych. Tym samym weszły one do historii genetyki jako pierwszy organizm eukariotyczny, którego genom został w całości odczytany. Wstępna analiza komputerowa genomu ujawniła, oprócz tysiąca wcześniej opisanych genów drożdżowych, prawie 5000 nowych. Nie wiemy jeszcze, czy wszystkie one obecnie funkcjonują, czy też są tylko "niemymi" świadkami ewolucji. Blisko 3000 genów wykazuje istotny stopień podobieństwa do genów uprzednio odkrytych w innych organizmach. Z tego około 1/3 jest podobnych do genów ludzkich kodujących białka biorące udział w tak podstawowych procesach jak replikacja i naprawa DNA, synteza białek oraz transport przez błony. Dodatkowo w tej grupie znajdują się geny niezwykle interesujące dla lekarzy, gdyż mutacje w ich ludzkich odpowiednikach wywołują wiele chorób nowotworowych oraz zaburzeń układu nerwowego i kostnego. Tak znaczne podobieństwo do genów człowieka oraz łatwość prowadzenia badań w komórkach drożdżowych być może uczynią z tych grzybów atrakcyjny model do badania mechanizmów zmian nowotworowych [4]. Wraz z rozwojem wiedzy o budowie materii pojawiła się potrzeba rozdzielania cząsteczek wykazujących zróżnicowane właściwości. Opracowano szereg metod, opierających się na wykorzystaniu różnych zjawisk fizycznych, w celu separacji makrocząsteczek ze względu na ich cechy. Spośród tych metod najbardziej popularnymi technikami stały się techniki elektroforetyczne. Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym. Prędkość przemieszczania się naładowanej elektrycznie makrocząsteczki zależy od jej ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu środowiska. W elektroforezie żelowej DNA ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, uformowany w płytkę długości kilkunastu do kilkudziesięciu centymetrów. Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienia w żelu- studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości, dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki a po włączeniu zasilania migruje do żelu, jako wąski prążek. Żel agarozowy zanurzony jest w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki biegną elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne, pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze)
46 cząsteczki oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Do żelu dodajemy substancję barwiącą DNA bromek etydyny [2]. Bromek etydyny jest to organiczny związek chemiczny interkalujący w DNA. Pod wpływem promieniowania UV fluoryzuje w kolorze różowo-pomarańczowym. Intensywność fluorescencji wzrasta około 20x po przyłączeniu do DNA, pozwalając tym samym na obrazowanie prążków DNA w żelu. Jest to silny mutagen o działaniu kancerogennym i teratogennym [2]. Elektroforeza powszechnie stosowana jest w takich dziedzinach jak: biochemia białek i kwasów nukleinowych, biologia molekularna, farmakologia, medycyna sądowa, weterynaria, diagnostyka medyczna oraz kontrola jakości żywienia. Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku, których otrzymuje się DNA biologicznie aktywny, chemicznie stabilny oraz wolny od RNA i białek. Jednakże ze względu na wielkość i wrażliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego izolacja w formie niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom. Opracowanie procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy na temat jego chemicznej stabilności iwarunków w jakich znajduje się w swoim naturalnym środowisku (komórka) [1]. Materiał i Metody Wirówka Eppendorf 12 14 000 obr./min.; Zestaw do elektroforezy poziomej BIO-RAD, Transiluminator UV firmy UVP Do izolacji DNA użyto trzy rodzaje drożdży piekarniczych pochodzące od różnych producentów. Odczynniki: 0,8 % żel agarozowy: (0,4g agarozy na 50 ml TAE 1x) bufor TAE 1x 50 ml: (4,84 g Tris-Base; 2 ml 0,5 M EDTA; 1,142 ml 99% lodowy kwas octowy; ph 8, woda) bromek etydyny: 3 µl na 50 ml bufor obciążający 6x: (błękit bromofenolowy; 10% SDS; 0,5 M EDTA; glicerol) bufor TE: (1 M Tris HCl ph 8; 0,5 M EDTA ph 8; woda) 96 % etanol Roztwór I: skład na 2 ml: (40 µl Triton X-100; 250 µl 10 % SDS; 40 µl 5 M NaCl; 25 µl 1 M Tris o ph 8; 4 µl 0,5 M EDTA) [1] Izolacja DNA z drożdży piekarniczych 1. Przygotowano wodny roztwór komórek drożdżowych zawieszony w 10 ml wody dejonizowanej 2. Zawiesinę drożdży rozlano po 1,5 ml do probówek typu Epperndorf i wirowano 10 min przy prędkości 4000 rpm
47 3. Następnie zlano supernatant 4. Do osadu komórek drożdżowych dodano 200 µl roztworu I, 200 µl mieszaniny fenolchloroform i 0,3 g kulek szklanych, całość worteksowano przez 2 min. 5. Dodano 200 µl TE buforu, następnie wirowano przez 5 min przy prędkości 13 200 obrotów/min. 6. Po wirowaniu supernatant przeniesiono przy użyciu pipety do nowych eppendorfów i dodano po 1 ml 96 % etanolu 7. Mieszaninę wirowano przez 2 min przy prędkości 13200 rpm., zlano supernatant dodano 400 µl TE buforu, oraz RNA-zę w stężeniu 10 mg/ml 8. Po dodaniu RNA-zy, roztwór inkubowano przez 5 min. w temp 37 C, dodano 18 µl 5 M octanu amonu i 1 ml 96 % etanolu 9. Mieszaninę wirowano przez 10 min przy prędkości 13200 rpm. 10. Otrzymany osad DNA suszono przez 15 min w temp 37 C 11. Po wysuszeniu DNA zawieszono w 50 µl wody dejonizowanej [1] Rozdział elektroforetyczny wyizolowanego DNA 1. Przygotowano 0,8 % żel agarozowy i umieszczono w aparacie do elektroforezy poziomej 2. Do studzienek w żelu naniesiono po 2 µl wyizolowanego DNA zmieszanego z 5 µl buforu do nanoszenia próbek 3. Rozdział DNA przeprowadzono przy stałym napięciu 80 V przez 45 min. 4. Po przeprowadzonej elektroforezie żel umieszczono w transiluminatorze i obserwowano wyniki po naświetleniu promieniami UV [1] Wyniki Zastosowanie metody wg protokołu Ambergsa pozwoliło na wyizolowanie DNA, a następnie jego wizualizację w żelu jak na rys.1. Genomowe DNA Rys. 1 Genomowe DNA Saccharomyces cerevisiae po wybarwieniu bromkiem etydyny w żelu agarozowym
Wnioski 1. W wyniku zastosowania wyżej opisanej metody udało się wyizolować genomowe DNA drożdży piekarniczych (Saccharomyces cerevisiae) 2. Rozdział elektroforetyczny przeprowadzony w żelu agarozowym potwierdził obecność wyizolowanego DNA 3. Bromek etydyny zawarty w żelu interkalował nici DNA dzięki czemu po umieszczeniu żelu w transiluminatorze i naświetleniu go promieniami UV obserwowano silnie świecące pomarańczowo-żółte prążki w żelu 4. Metoda ta z powodzeniem może być wykorzystywana do szybkiej izolacji genomowego drożdżowego DNA 5. Genom drożdżowy ma wielkość ok. 12 mln par zasad dlatego podczas zwykłej elektroforezy w żelu agarozowym nie jesteśmy w stanie odróżnić genomu 3 rodzajów drożdży pochodzących od różnych producentów, dlatego widoczne są one w jednej lini. Do rozdzielenia takich genomów potrzebne byłoby przeprowadzenie elektroforezy pulsacyjnej Literatura 1. Amberg David C., Burke Daniel J., Strathern Jeffrey N. 2007. Isolation of Plasmid DNA from Yeast Cells: A Ten-Minute Preparation 2. Brown T. A. 2001. Genomy. Wyd. PWN. Warszawa. 3. Chmiel A. 2001. Biotechnologia. Wyd. PWN. Warszawa. 4. Skała J. 1997. Drożdże w komputerze. Wiedza i Życie, 1. 5. Drożdże jako organizm modelowy. Genetyka z inżynierią genetyczną. 2005. Skrypt Wydział Biologii UW 48 ISOLATION DNA FROM YEAST CELLS SACCHAROMYCES CEREVISIAE WITH USING ELECTROPHORESIS TO VISUALISATION RESULTS Summary The method utilized the molecular characteristics of covalently closed circular deoxyribonucleic acid (DNA) that is released from cells under conditions that denature chromosomal DNA by using alkaline sodium dodecyl sulfate (ph 12.6) at elevated temperatures. Proteins and cell debris were removed by extraction with phenol-chloroform. Under these conditions chromosomal DNA concentrations were reduced or eliminated. The clarified extract was used directly for electrophoretic analysis. These procedures also permitted the selective isolation of plasmid DNA that can be used directly in nick translation, restriction endonuclease analysis, transformation, and DNA cloning experiments. Key words: electrophoresis, isolation, Saccharomyces cerevisiae, DNA