KONCEPCJA BIOTECHNOLOGICZNA WYBÓR METODY SYNTEZY. Dominik Jańczewski

KONCEPCJA BIOTECHNOLOGICZNA WYBÓR METODY SYNTEZY Dominik Jańczewski

PLAN WYKŁADU Dobór organizmu, szlaki metaboliczne, ochrona patentowa Genetyczne modyfikacje szczepów Problemy projektowe na różnych etapach procesu biosynteza wobec wyodrębniania produktu Przewaga konkurencyjna metod biotechnologicznych Wybór sposobu syntezy porównanie metod biochemicznych i chemicznych

BIOTECHNOLOGIA typowe produkty Alkohole (etanol, butanol, glicerol) Kwasy organiczne (octowy, cytrynowy, mlekowy, glukonowy) Witaminy Hormony steroidowe Ketony (aceton) Aminokwasy Antybiotyki Proteiny Największy wolumen produkcji - biopaliwa Największa wartość dodana - substancje czynne (API)

BIOTECHNOLOGIA W. Bednarski, J. Fiedurka, Podstawy Biotechnologii Przemysłowej, WNT, 2007

STRATEGIA PROJEKTOWA biosynteza i biotransformacja Dobór systemu biokatalitycznego Biosynteza Izolacja produktu

DOBÓR ORGANIZMÓW jak organizm może produkować naszą substancję Otrzymać produkt z prostych substancji odżywczych. Przeprowadzić biotransformację złożonego półproduktu, prowadząc wieloetapową transformację. Przeprowadzić prostą transformację organiczną - np. selektywnie zredukować grupę funkcyjną. Bezpośredni metabolit, poszukiwanie odpowiednich szczepów, modyfikacja genetyczna organizmów Wybór organizmu o opisanych zdolnościach do prowadzenia pewnego typu transformacji - np. saccharomyces cerevisiae - zdolności redukujące wielu grup funkcyjnych

DOBÓR ORGANIZMÓW poszukiwanie nowych szczepów Szczep występujący w naturze (screening), dobry wybór gdy związek został wyizolowany z mikroorganizmów (np. pencylina) Komercyjne kolekcje organizmów - The World Federation for Culture Collections - dostępne 2.5 miliona organizmów. Zakup licencji biotechnologicznej Idealny organizm: Niepatogenny Nie wytwarzający toksyn Stabilny genom (rzadkie mutacje) wikicommons

DOBÓR ORGANIZMÓW selekcja naturalna Organizmy występujące w nietypowych środowiskach: wysokie zasolenie, wysoka temperatura, duże stężenie zanieczyszczeń np. ropy naftowa czy metale - Indukcja dla nietypowych szlaków metabolicznych Thermus aquaticus wikicommons

DOBÓR ORGANIZMÓW dobór hodowlany Ekspozycja kolekcji bakterii na czynnik selekcjonujący, inhibitor, antybiotyk. Czynniki selektywnie wpływające na różne grupy bakterii: temperatura, ph, potencjał redox metabolit Amylazy Antybiotyki Lipazy Proteazy metoda podłoże agarowe ze skrobią, selekcja kolonii po barwieniu jodkiem potasu podłoże z testowymi organizmami - zahamowanie wzrostu podłoże z dodatkiem oleju, selekcja po wytrąceniu soli wapniowych kwasów tłuszczowych Podłoże agarowe z żelatyna - optyczna detekcja zmian W. Bednarski, J. Fiedurka, Podstawy Biotechnologii Przemysłowej, WNT, 2007

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu, mutageneza Zmiana materiału genetycznego pod wpływem mutagenu Losowa mutacja Selekcja na podstawie fenotypu mutagen Hydroksyloamina Kwas azotowy Promieniowanie UV Promieniowanie jonizujące efekt Reakcja z cytozyną / tranzycja AT = GC dezaminacja zasad / tranzycje, delecje, transwersje dimeryzacja pirymidyn, hydratacja C i U / tranzycie, delecje jonizacja zasad / tranzycje

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu, rekombinacja genetyczna Transfer fragmentu genu pomiędzy zbliżonymi organizmami, Hybrydyzacja - krzyżowanie szczepów, często stosowane z mutagenezą. Mutageneza - szczególnie sekwencyjna może zwiększać produktywność ale pogarszać inne pożądane cechy organizmu. Poprzez hybrydyzację możemy poprawić: produktywność, szybkość namnażania, wrażliwość na składniki podłoża i warunki natleniania, tworzenie produktów ubocznych, właściwości filtracyjne hodowli itp. ok 1% bakterii w sposób naturalny wymienia swoje DNA z otoczeniem

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu, metody inżynierii genetycznej Identyfikacja i izolacja genu odpowiedzialnego za interesujący nas proces komórkowy lub metabolit. Transfer materiału genetycznego do innego organizmu (GMO). Praktycznie brak barier międzygatunkowych Idealne rozwiązanie gdy naszym celem produkcyjnym jest produkt naturalnie wytwarzany przez organizm - proteina, naturalny antybiotyk, kwasy nukleinowe. IUPAC definition Process of inserting new genetic information into existing cells in order to modify a specific organism for the purpose of changing its characteristics.

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu Hemofilia - choroby genetyczne związane z obniżoną krzepliwością krwi. Drobne urazy mogą powodować poważne krwotoki. Hemofilia typu A - najpopularniejsza 1/10 000 urodzeń męskich - brak czynnika VII (produkowany przez wątrobę i komórki śródbłonka) Hemofilia typu B - 1 / 35 000 urodzeń męskich - brak czynnika IX

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu Odkryta przez lekarzy arabskich w 10 wieku i powiązana z dziedzicznością. Królowa Wiktoria rozniosła chorobę do domów panujących w Hiszpanii Niemczech i Rosji. Alexei Nikolaevich Romanow. Recesywne uszkodzenie (A i B) w chromosomie X Kiedyś kobieta tylko nosicielem ale nie choruje. Kiedyś chorowali jedynie chłopcy. Spontaniczna mutacja odpowiedzialna za 30% przypadków.

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu Średnia spodziewana długość życia przed 1960-11 lat. Od lat 60 dostępne produkty izolowane i oczyszczane z osocza krwi np. Monoclate-P (CSL Behring). Pacjentom chorym na ostrą hemofilię podaje się czynnik dożylnie. Spodziewana długość życia wydłużyła się do 50-60 lat (około 10 lat krócej niż średnia) wikicommons Lata 80 - problem, większość pacjentów umiera na powikłania związane z zakażeniami HIV i żółtaczką wszczepienną. Duży problem z oczyszczaniem produktu.

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu 1984 - sklonowanie genów odpowiedzialnych za syntezę czynnika VII 1992 - pierwszy komercyjnie dostępny czynnik VII, produkcja przy użyciu kultur komórkowych ssaków (BHK baby hamster kidney cells). Obecnie różne linie komórkowe i organizmy np.: (Leishmania tarentolae pasożyt jaszczurek) Obecnie modyfikowane czynniki VIIa np. NovoSeven (Novo Nordisk) 2011 pierwsze próby z terapią genową - modyfikacja komórek wątroby - efekt utrzymuje się przez kilka lat - terapie eksperymentalne, brak zaaprobowanych produktów.

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu, metody inżynierii genetycznej Identyfikacja genu - odnaleźć odpowiednią sekwencję w organizmie donora, którą możemy wyizolować. Izolacja genu - enzymy restrykcyjne wycinają interesujący nas fragment DNA używając markerów w łańcuchu kwasu nukleinowego. Oczyszczanie materiału - strącanie, ekstrakcja, elektroforeza i techniki chromatograficzne Namnażanie materiału - techniki PCR Gdy znamy interesującą nas sekwencję - materiał można syntetyzować sztucznie

Kary B. Mullis (Nobel 1993) DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu, metody inżynierii genetycznej - PCR Technika powielania (samo replikacji DNA). Potrzebujemy: (1) wzorzec DNA, (2) mieszankę nukleotydów (substraty), (3) startery (primery), (4) termo stabilną polimerazę DNA (enzym syntezujący) wikicommons Metoda autokatalityczna - bardzo łatwo powielić zanieczyszczenie

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu, metody inżynierii genetycznej Dobór gospodarza - dobór organizmu który będzie produkował Julian K-C. Ma, Pascal M. W. Drake & Paul Christou Nature Reviews Genetics 4, 794-805

DOBÓR ORGANIZMÓW modyfikacja genomu Wprowadzenie materiału genetycznego do komórek produkujących (dla roślin i organizmów niższych dowolne komórki), dla zwierząt komórki macierzyste.

DOBÓR ORGANIZMÓW prawo własności intelektualnej Problem - względnie łatwo skopiować organizm produkcyjny, często to organizm stanowi o przewadze konkurencyjnej. Rośliny - Plant Patent Act (1930) - ochrona patentowa nowych szczepów roślin 20-30 lat ochrony, nie chroni przed wykorzystaniem nasion z plonu. Substancje występujące naturalnie - można patentować po odpowiedniej izolacji - typowa ochrona 20 lat Geny - można chronić wyizolowany gen jego strukturę chemiczną, proces izolacji lub syntezy i zastosowanie (bądź kombinację tych opcji). Tylko do sekwencji o znanej funkcji.

DOBÓR ORGANIZMÓW prawo własności intelektualnej Wen Zhou, Anna Maurer The Patent Landscape of Genetically Modified Organisms

DOBÓR ORGANIZMÓW prawo własności intelektualnej Glifosat, składnik herbicydu Roundup Monsanto s Roundup Ready soybeans dopuszczone w 1996 (US Patent 5,352,605 and RE39,247). Gen odporności na Glifosfat z przeniesiony z Agrobacterium tumefaciens. Ochrona wygasła odpowiednio w 2011 i w 2014. 80% uprawy soi jest modyfikowana genetycznie Genetic use restriction technology (GURT) - nasiona wydają tylko jedno pokolenie użytecznych roślin.

FERMENTACJA opis biofizyczny wzrostu Typowe fazy fermentacji okresowej Metabolit pierwotny (primary metabolite) Metabolit wtórny (seconadary metabolite) wikkicommons - Michał Komorniczak

FERMENTACJA opis biofizyczny wzrostu Metabolity pierwotne - podstawowe produkty komórkowe powstające w fazie szybkiego wzrostu. Typowo są związane z normalnym wzrostem, rozwojem i reprodukcja organizmu. Zazwyczaj mają określoną funkcję w fizjologii komórki. (np.: etanol, kwas mlekowy, aminokwasy). Mogą być produkowane w wysokich stężeniach. Metabolity wtórne, nie są bezpośrednio związane z fizjologią komórki i ich brak nie powoduje natychmiastowej śmierci. Często są związane z mechanizmami obronnymi komórek, są produkowane w mniejszych ilościach. Wykorzystywane w technikach biosyntetycznych jako źródło złożonych produktów

FERMENTACJA opis biofizyczny wzrostu - typy procesów Hodowle w podłożach ciekłych (submerged culture, liquid phase), również jako hodowla powierzchniowa. Łatwiejsza przy powiększaniu skali - typowe rozwiązanie przy wielkotonażowej produkcji (np. fermentacja mlekowa, przemysł spożywczy i oczyszczanie ścieków) - największe reaktory - od skali laboratoryjnej do kilku tysięcy metrów sześciennych PETROGREEN Co. LTD Thaïland 200 000 L/d Hodowle w podłożach stałych (solid state fermentation), szczególnie do grzybów strzępkowych, technologicznie bardziej wymagająca i trudniejsza przy powiększaniu skali.

FERMENTACJA sposoby hodowli - typy hodowli Hodowla okresowa - typowy układ produkcyjny, załadowanie pożywki, sterylizacja, zaszczepienie materiału posiewowego, namnażanie organizmów. Hodowla okresowa z ciągłym dozowaniem (hodowla półciągła) - dozowanie substratów - szczególnie gdy mogą mieć hamujący wpływ na wzrost, neutralizowanie produktu np.; alkalizacja kwasu mlekowego. Możliwość sterowania ze sprzężeniem zwrotnym (np. kontrola ph.) Hodowla ciągła - stałe stężenie produktu w strumieniu wychodzącym. Dobre rozwiązanie dla organizmów szybko rosnących np. odpowiedni do otrzymywania dużej masy komórkowej bądź metabolitów pierwotnych. Problem zakażeń i wypierania szczepów produkcyjnych przez szczepy niepożądane. Hodowla ciągła z recyrkulacją biomasy - utrzymywanie stałej biomasy przy wolniejszym wzroście

FERMENTACJA sposoby hodowli - bioreaktory Bioreaktory do hodowli wgłębnej - hodowla w podłożach ciekłych. Podtypy: do hodowli tlenowych i beztlenowych; mieszanie mechaniczne, gazem lub cieczą Reaktory membranowe - separacja biomasy od przestrzeni odbierania produktu (problem zarastania membrany i nagromadzenia komórek nieaktywnych) stosowane zarówno w procesach mikrobiologicznych jak i enzymatycznych Bioreaktory do hodowli w podłożu stałym - komory półkowe z kontrolowana atmosferą Bioreaktory z unieruchomionym materiałem biologicznym - metody sorpcyjne, zamykanie w siatce polimeru, metody agregacji

FERMENTACJA sposoby hodowli - bioreaktory Unieruchamianie materiału biologicznego Sorpcja: różne nośniki o dużej powierzchni właściwej: szkło porowate, węgiel drzewny, wióry drewniane, tlenek glinu, bawełna, polimery. Materiały porowate - optymalna wielkość porów: bakterie - 5 x wielkość, drożdże - 4 x wielkość, grzyby strzępkowe - 16 x zarodnik. Problem desorpcji Zamykanie w siatce polimeru - unieruchamianie komórek i enzymów w siatce naturalnych bądź syntetycznych żeli. Problemem jest spadek aktywności na skutek unieruchomienia, oraz opory dyfuzyjne. (komórki są bardziej odporne na unieruchomienie) Przyczyny spadku aktywności: dezaktywacja enzymów pod wpływem monomeru, związanie enzymu w konfiguracji ograniczającej aktywność (ukryte centra aktywne), dezaktywacja komórek na skutek uszkodzeń mechanicznych.

FERMENTACJA typy bioreaktorów Najpopularniejsze reaktory - typowe reaktory zbiornikowe z mieszaniem mechanicznym - stosowane są w hodowlach ciekłych Turbiny Rushonta - płaskie łopatki Rozmieszczone na wielu poziomach duże rozmiary reaktora Ważne! uszczelnienie reaktora aby zapewnić jałowość procesu

FERMENTACJA wpływ pożywki Skład pożywki jest podstawowym sposobem wpływu na rozwój mikroorganizmów Kontrola nadprodukcji metabolitów Kierunek metabolizmu - np. Asperigillus Niger (produkcja antybiotyków) może produkować różne produkty w zależności od modyfikacji podłoża. Proste pożywki (dla tanich produktów) - mleko, serwatka, skrobia, odpady przemysłu spożywczego Przemysł farmaceutyczny - bardzie zaawansowane pożywki, często chronione tajemnicą technologiczną (większa wartość dodana produktu) Idealny pożywka: Maksymalizuje wydajność produktu Zwiększa szybkość produkcji Minimalizuje produkty uboczne Niska cena Minimalizacja problemów projektowych (napowietrzanie, mieszanie, oczyszczanie produktu, odpady)

FERMENTACJA sterylizacja Czystość mikrobiologiczna - podstawa sukcesu hodowlanego: Obce szczepy mogą wypierać kulturę produkcyjną Zanieczyszczenie końcowego produktu Rozkład produktu biosyntezy (metabolizm) Infekcja fagami - liza szczepów produkcyjnych Zmniejszenie produkcyjności hodowli wikicommons

FERMENTACJA sterylizacja Używamy czystej (zdrowej) kultury do inicjowania procesu Sterylizujemy pożywki i wszystkich składników dodawanych do bioreaktora Sterylizacja urządzeń i utrzymywanie aseptycznych warunków w trakcie procesu Sposoby sterylizacji (i) separacja organizmów, mikrofiltracjia (ii) zabicie organizmów Procesy termiczne (pasteryzacja) Naświetlanie promieniowaniem elektromagnetycznym (UV) lub jonizującym Procesy chemiczne (dodatek substancji chemicznych np.: antybiotyków)

IZOLACJA PRODUKTU Gdzie jest nasz produkt - czy pozostaje w komórce (typowe dla złożonych produktów), czy jest wydzielany do roztworu pożywki (produkty o wysokim stężeniu). Rzadko kiedy możemy użyć jednej metody separacji - typowo jest to sekwencja operacji.

IZOLACJA PRODUKTU Izolacja acylazy penicylinowej - enzym hydrolizujący naturlną pencylinę - wykorzystywany do syntezy semi-syntetycznych antybiotyków (proces wykorzystuje immobilizowany enzym.) Filtracja Dezintegracja komórek Wirowanie Wytrącanie Rozpuszczanie Chromatografia Dializa, ultrafiltracja Wytrącanie Krystalizacja

IZOLACJA PRODUKTU dezintegracja ściany komórkowej Gdy produkt jest w niskim stężeniu i jest uwięziony w komórce Krok I - dezintegracja ściany komórkowej, duże różnice w strukturze ściany komórkowej pomiędzy organizmami. Bakterie - peptoglikan + białka + liposacharydy, fosfolipidy, gram (+) 15-50nm, gram (-) 2-10 nm, duża odporność mechaniczna. Grzyby - chityna. Komórki roślinne - głównie celuloza. Komórki zwierzęce - brak sztywnej ściany komórkowej, dodatkowa otoczka z węglowodanów, stosunkowo łatwe do zniszczenia.

IZOLACJA PRODUKTU dezintegracja ściany komórkowej Metoda mechaniczna agresywność Koszt homogenizacja rozrywanie - mieszanie średnia niski mielenie naprężenia i zderzenia średnia niski ultarsonifikacja kawitacja wysoka wysoki ciśnieniowa gwałtowna zmiana ciśnienia wysoka niski Metody Chemiczne szok osmotyczny rozerwanie - różnica stężeń niska niski trawienie rozkład enzymami niska wysoki trawienie ługami hydroliza estrów wysoka niski roztwarzanie rozkład detergentami niska średni rozpuszczanie Rozpuszczalniki organiczne średnia niski

IZOLACJA PRODUKTU techniki filtracyjne Doskonała wstępna metoda gdy produkt występuje wyłącznie wewnątrz komórki bądź wyłącznie w pożywce. Zatężony produkt w postaci placka filtracyjnego Wodny roztwór produktu - do dalszego zatężania Typowe operacje Wirowanie Filtracja Mikrofiltarcja (ultra, nano) Sedymentacja Operacje wspomagające Flokulacja

IZOLACJA PRODUKTU techniki filtracyjne Wirowanie Separacja pod wpływem siły odśrodkowej, możliwość frakcjonowania mieszanin produktów np. białek Tryb pracy, ciągły, półokresowy, okresowy Proces powszechnie używany w przemyśle biotechnologicznym (np. wirowanie osadu po fermentacji kwasu mlekowego) i spożywczym (np. cukrowniczym)

IZOLACJA PRODUKTU techniki filtracyjne Mikrofiltracja - filtracja zawiesin o rozmiarze cząstek od 20 nm do 10 µm, Typowe ciśnienie pomiędzy 0.02-0.5 MPa. Możliwość doboru frakcji filtrowanej Mikrofiltarcja - separacja organizmów (bakterie grzyby,sterylizacja) Ultrafiltarcja - separacja wirusów, białek, polisacharydów. fumatech bwt gmbh Nanofiltarcja, odwrócona osmoza (membrany - separacja jonów - membrana posiada powinowactwo do jednego składnika)

IZOLACJA PRODUKTU techniki filtracyjne Diafiltracja - odmywanie składników małocząsteczkowych. Separacja związków małocząsteczkowych od produktu (białek, makromolekuł). IVT Network

IZOLACJA PRODUKTU techniki membranowe Membrany - selektywne z uwagi na rozmiar lub z uwagi na charakter filtrowanego medium (np. jonoselektywne) Dializa - separacja z użyciem membrany - siłą napędową jest różnica stężeń (osmoza). Można odmywać roztwory po obu stronach membrany Perwaporacja - destylacja z użyciem selektywnej membrany - np. (destylacja etanolu)

IZOLACJA PRODUKTU techniki ekstrakcyjne Analogicznie do rozwiązań technologii organicznych. Ograniczenia - stosowana jako metoda przy wydziałaniu antybiotyków. Problem - denaturacja produktów pod wpływem rozpuszczalników organicznych - np. większość białek potrzebuje środowiska wodnego aby zachować swoją strukturę. Rozwiązanie - ekstrakcja pomiędzy dwoma fazami wodnymi - dobra rozpuszczalność, duże współczynniki dyfuzji, niska lepkość. Ekstrakcja wspomagana przez wirowanie (szczególnie białka emulgujące) Ekstrakcja nadkrytyczna - metoda technologicznie bardzo czysta (CO 2, Etan)

IZOLACJA PRODUKTU techniki chromatograficzne Chromatografia - rozdział jednorodnych mieszanin - odziaływanie fazy ruchomej z fazą nieruchomą. Rozdział - zróżnicowane powinowactwo do fazy stałej. Właściwości umożliwiające separację: polarności związków (LC, HPLC) masa molekularnej (GPC, SEC) ładunek (chromatografia jonowymienna) Powinowactwo chemiczne (immunoafinity)

BIOTECHNOLOGIA vs METODY CHEMICZNE Metody Chemiczne Synteza chemiczna: małe ograniczenia co do warunków syntezy, większy zakres temperatur, Metody Biotechnologiczne Synteza: zazwyczaj łagodne warunki reakcji, małe zanieczyszczenie środowiska (roztwory wodne) Wydzielanie produktu: klasyczne operacje jednostkowe: krystalizacja, destylacja. Wydzielenie produktu: izolacja z roztworów o dużym rozcieńczeniu

BIOTECHNOLOGIA kryteria doboru ścieżki procesowej 80% sukcesu leży po stronie odpowiedniego szczepu Kiedy mamy wydajny szczep produkujący pożądany produkt z opłacalną wydajnością opłaca się produkować nawet małe nieskomplikowane molekuły (kwas cytrynowy, kwas mlekowy, etanol) Nawet jeżeli mamy szczep produkujący pożądaną substancję ważne jest zwiększenie wydajności szczepu np: dzikie szczepy wydzielają do 1g pencyliny w m 3, modyfikowane szczepy są w stanie produkować do 50 kg/m 3 Gdy nie mamy odpowiedniego szczepu - wysokie nieprzewidywalne koszty modyfikacji organizmów i pozyskania organizmu do konkretnej transformacji chemicznej. Należy rozważyć zakup szczepu. Jeżeli produkt nie jest typowym metabolitem trzeba zrobić/pozyskać odpowiedni organizm. Zazwyczaj opłacalne tylko dla produkcji w dużej skali bądź o wysokiej wartości dodanej z uwagi na duże koszty i niepewność badań.

BIOTECHNOLOGIA kryteria doboru ścieżki procesowej Inne czynniki: Gdy są problemy z uzyskaniem steroizomerów klasycznymi metodami. Metody fermentacyjne, nie ma problemu racemicznych produktów - synteza w większości przypadków jest sterospecyficzna. Gdy mamy szczególnie skomplikowaną strukturę nieopłacalną do otrzymania w sposób syntetyczny, wieloetapowa synteza, np: struktury z dużą liczbą centrów chiralnych. Wpływ regulacji prawnych - wymóg surowców bioodnawialnych np. biopaliwa Ostateczna decyzja - zawsze kalkulacja kosztów W pewnych sytuacjach koszty dla obu metod syntezy będą zbliżone bądź zależne od lokalnych uwarunkowań, fluktuacji cen surowców, różne koszty robocizny itp.

BIOTECHNOLOGIA vs METODY CHEMICZNE koszty Metody Chemiczne Synteza: koszty procesowe zależne od warunków reakcji, mogą być zarówno po stronie surowców jak i energii. Względnie niskie koszty operacji jednostkowych, ale często wiele etapów syntezy. Wydzielenie klasyczne, zazwyczaj duża zawartość produktu w produkcie surowym Koszty środowiskowe - odpady Metody Biotechnologiczne Synteza: zazwyczaj łagodne warunki reakcji, małe zanieczyszczenie środowiska, niskie temperatury, małe zużycie energii, Długie czasy bio-syntezy, duże rozcieńczenia, niska wydajność z jednostki objętości aparatów Wydzielenie - często kłopotliwe typowo wymaga zatężania produktu surowego. W układach z fermentorami periodycznymi kłopotliwe oddzielenie biomasy od roztworu produktu