Dako DuoCISH. Nr kat. SK108. Wydanie 2.

Dako DuoCISH Nr kat. SK108 Wydanie 2. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 testów. Do uŝytku ręcznego lub zautomatyzowanego w aparatach Dako Autostainer. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 1/16

Spis treści Strona Przeznaczenie... 3 Streszczenie... 3 Zasady procedury... 3 Odczynniki... 4 Dostarczane materiały... 4 Materiały wymagane, ale niedostarczane... 4 Środki ostroŝności... 5 Przechowywanie... 6 Procedura FISH poprzedzająca Dako DuoCISH... 6 INSTRUKCJA UśYCIA... 6 A. Przygotowanie odczynników... 6 A.1 Bufor płuczący... 6 A.2 Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu... 7 A.3 Roztwór chromogenu o niebieskim zabarwieniu... 7 A.4 Barwienie kontrastowe... 7 B. Procedura wykonania odczynu... 7 B.1 Uwagi dotyczące procedury wykonania odczynu metodą ręczną... 7 B.2 Protokół ręcznego wykonania odczynu... 8 B.3 Uwagi dotyczące procedury wykonania odczynu metodą zautomatyzowaną (Dako Autostainer)... 9 B.4 Protokół zautomatyzowanego barwienia... 9 Kontrola jakości... 10 Stosowanie mikroskopu jasnego pola... 11 Interpretacja odczynu... 11 Wskazówki dotyczące zliczania sygnałów dla testu amplifikacji genu... 11 Wskazówki dotyczące zliczania sygnałów dla testu translokacji sygnałów rozszczepionych... 12 Ograniczenia... 12 Rozwiązywanie problemów... 12 Objaśnienie symboli... 16 (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 2/16

Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Dako DuoCISH przeznaczony jest do dwubarwnej wizualizacji chromogenicznej sygnałów otrzymanych przy pomocy sond Dako Texas Red- i FITC-labeled FISH przeznaczonych do detekcji amplifikacji, delecji i translokacji genu. Dako DuoCISH wytwarza czerwone i niebieskie sygnały chromogeniczne na tym samym skrawku tkankowym do oceny przy uŝyciu mikroskopii jasnego pola. Zestaw przeznaczony jest do uŝytku ręcznego lub zautomatyzowanego w aparatach Dako Autostainer. Streszczenie Dako DuoCISH jest zoptymalizowany do dwubarwnej wizualizacji chromogenicznej sygnałów otrzymanych przy pomocy sond Dako Texas Red- i FITC-labeled FISH przeznaczonych do detekcji amplifikacji, delecji i translokacji genu. Dako DuoCISH wytwarza kontrastujące i dobrze zrównowaŝone czerwone i niebieskie sygnały chromogeniczne na tym samym skrawku tkankowym, które są identyfikowane przy uŝyciu mikroskopii jasnego pola przy małym powiększeniu, a zliczane przy duŝym powiększeniu. Dako DuoCISH zawiera wszystkie najwaŝniejsze odczynniki, tj. odczynnik blokujący peroksydazę, CISH Antibody Mix, czerwone i niebieskie chromogeny i bufory substratu, niezbędne do przeprowadzenia 20 wizualizacji odpowiadających 20 analizom Dako FISH. MoŜliwe jest ręczne i zautomatyzowane wykonanie procedury przy uŝyciu aparatów Dako Autostainer. Zasady procedury Dako DuoCISH zawiera podstawowe odczynniki wymagane do wykonania dwuetapowej procedury barwienia immunohistochemicznego w celu wykrycia sond Dako Texas-Redi FITC-labeled FISH. Ostatni etap w procedurze FISH jest pomijany. W zamian, preparaty tkankowe są zanurzane w buforze płuczącym Dako. W pierwszym etapie procedury Dako DuoCISH następuje blokada endogennej peroksydazy przy uŝyciu gotowego do uŝycia odczynnika blokującego Peroxidase Block, po której następuje inkubacja przy pomocy gotowej do uŝycia mieszaniny CISH Antibody Mix, składającącej się z anti-fitc skoniugowanego z peroksydazą chrzanową (HRP) i z anti-texas Red skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną (AP). W dalszej fazie, następuje inkubacja preparatów tkankowych z czerwonym roztworem chromogenu (Red Chromogen), a następnie inkubacja z roztworem Blue Chromogen. Po dodaniu chromogenów następuje reakcja enzymatyczna, której wynikiem jest powstanie widocznych czerwonych i niebieskich produktów końcowych, zlokalizowanych w miejscu występowania antygenu (sondy FISH). Zatem, czerwone sygnały fluorescencyjne są zamieniane na czerwone, chromogeniczne sygnały, a zielone sygnały fluorescencyjne są zamieniane na niebieskie, chromogeniczne sygnały. W następnej fazie wykonywane jest barwienie kontrastowe i preparaty nakrywane są szkiełkiem nakrywkowym. Wyniki reakcji ocenia się przy uŝyciu mikroskopu jasnego pola. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 3/16

Odczynniki Dostarczane materiały Materiały opisane poniŝej wystarczają na 20 testów. Obliczając liczbę testów przyjęto, Ŝe zuŝycie odczynnika wynosi 200 µl na kaŝdy preparat. Zestaw zawiera materiały wystarczające na 10 serii odczynów. Fiolka 1 1 x 6 ml Fiolka 2 1 x 6 ml Fiolka 3 1 x 10,5 ml Fiolka 4 1 x 7 ml Fiolka 5 1 x 110 µl Fiolka 6 1 x 550 µl odczynnik blokujący peroksydazę Gotowy do uŝycia 3% nadtlenek wodoru zawierający 15 mmol/l azydku sodu (NaN 3 ). CISH Antibody Mix Gotowa do uŝycia Mieszanina przeciwciała przeciwko fluoresceinie, skoniugowanego z peroksydazą chrzanową i przeciwciała przeciwko Texas Red, skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną; Dostarczana w 50 mmol/l buforu Tris ze stabilizatorem, konserwantem, ph 7,5. Bufor do czerwonego chromogenu Roztwór buforowy do rozcieńczania Red Chromogen. Bufor do niebieskiego chromogenu Roztwór buforowy do rozcieńczania Blue Chromogen. Czerwony chromogen Do rozcieńczenia w Red Substrate Buffer (Fiolka 3). Niebieski chromogen Do rozcieńczenia w Blue Substrate Buffer (Fiolka 4). Materiały wymagane, ale niedostarczane Dako Wash Buffer, Nr kat. S3006 Dako Hematoxylin, Nr kat. S3301 Środki do zatapiania trwałego (niebędące na bazie alkoholu i ksylenu) (np. Tissue-Mount produkcji Sakura) Wodne środki do zatapiania (np. Aquatex produkcji Merck lub EMD Chemicals (USA)) Mikroskop jasnego pola Szkiełka nakrywkowe Woda destylowana lub dejonizowana Chusteczka niepozostawiającą nitek Do dodatkowych materiałów wymaganych do barwienia metodą ręczną zaliczane są: Komora nawilŝająca Naczynia lub łaźnia do barwienia minutnik (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 4/16

Dodatkowe materiały wymagane do barwienia metodą automatyczną w urządzeniach Dako Autostainer/Autostainer Plus to: Fiolki Autostainer Reagent Vials (Nr kat. S3425) Dodatkowe materiały wymagane do barwienia metodą automatyczną w aparatach Dako Autostainer Plus Link to: Butelki na odczynniki, User-Fillable: 12 ml (Nr kat. SK201) lub 5 ml (Nr kat. SK200) Środki ostroŝności 1. Do stosowania w diagnostyce in vitro. 2. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 3. Opisywany produkt zawiera azydek sodu (NaN3), silnie toksyczny w czystej postaci. StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 4. Fiolka 5: Odczynnik zawiera Fast Red KL Salt i jest oznakowany jako: Toksyczny R45 MoŜe wywoływać raka. S35 Niniejszy materiał wraz z opakowaniem musi być usuwany z zachowaniem zasad bezpieczeństwa. S45 JeŜeli dojdzie do wypadku lub jeŝeli UŜytkownik źle się poczuje, naleŝy niezwłocznie zasięgnąć porady lekarza jeŝeli to moŝliwe, naleŝy pokazać etykietę. S53 Unikać kontaktu przed uŝyciem zapoznać się z instrukcją. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkownicy muszą być dokładnie przeszkoleni w zakresie prawidłowej procedury postępowania, niebezpiecznych właściwości produktu i niezbędnych środków ostroŝności (zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej 94/33/WE). 5. Fiolka 6: Odczynnik zawiera 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihydro-3,3-dimetylo-1-(4-sulfobutylo)- 2H-indolo-2-ylideno]-1-propenylo]-3,3-dimetylo-1-(4-sulfobutylo)-3H-indolium, ter trifluorooctan. Uwaga: Produkt zawiera substancję, która nie została jeszcze w pełni przetestowana. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkownicy muszą być dokładnie przeszkoleni w zakresie prawidłowej procedury postępowania, niebezpiecznych właściwości produktu i niezbędnych środków ostroŝności (zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej 94/33/WE). 6. Na Ŝądanie UŜytkowników dostępna jest karta charakterystyki substancji niebezpiecznej. 7. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 8. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 9. Niewykorzystany roztwór naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. 10. Odczynniki Dako DuoCISH mają optymalne rozcieńczenia. Dalsze rozcieńczanie moŝe wpłynąć negatywnie na ich działanie. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 5/16

11. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod moŝe powodować błędne wyniki badania. 12. NaleŜy zminimalizować ryzyko zakaŝenia mikrobiologicznego odczynników, Ŝeby uniknąć błędnych wyników. 13. Przed przygotowaniem roztworu Blue Chromogen, naleŝy starannie wymieszać zawartość fiolki 6 (Blue Chromogen), aby uzyskać równomierne rozcieńczenie chromogenu. 14. Zaleca się postępowanie zgodnie ze standardową procedurą konserwacji i serwisowania aparatu Dako Autostainer. 15. Osoby cierpiące na zaburzenia rozpoznawania barwy czerwonej/niebieskiej powinny zachować ostroŝność przy ocenianiu próbek. Przechowywanie Odczynniki przechowywać w zaciemnionym pomieszczeniu w temp. 2 8 C. Nie z amraŝać. Jeśli odczynniki przechowywane są w warunkach odbiegających od podanych na specyfikacji, uŝytkownik musi zweryfikować ich działanie. Nie stosować zestawu po upływie daty waŝności podanej na pudełku. W przypadku wystawienia na działanie ciepła, jakość chromogenów i buforów substratu moŝe ulec pogorszeniu. Nie naleŝy pozostawiać tych odczynników w temperaturze pokojowej. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Z tego względu, waŝne jest, aby w analizowanym preparacie uwzględniać prawidłowe komórki. W przypadku otrzymania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z Dako DuoCISH, naleŝy się skontaktować z naszym działem technicznym. Procedura FISH poprzedzająca Dako DuoCISH Dako DuoCISH jest stosowany do skrawków tkankowych barwionych z zastosowaniem sond Dako FISH. Zaleca się, by UŜytkownicy zapoznali się z odpowiednią procedurą/instrukcją Dako FISH. W celu wykonania Dako DuoCISH, ostatni etap w procedurze barwienia Dako FISH (odwodnienie, suszenie na powietrzu, oraz zatapianie szkiełek ze środkami Fluorescence Mounting Media) jest pomijany, a preparaty tkankowe są zamiast tego zanurzane w rozcieńczonym buforze Dako Wash Buffer (Nr kat. S3006); prosimy zapoznać się z rozdziałem INSTRUKCJA UśYCIA, A.1 Wash Buffer. INSTRUKCJA UśYCIA A. Przygotowanie odczynników Przed przystąpieniem do barwienia naleŝy przygotować następujące odczynniki: Przed wykonaniem odczynu, wszystkie odczynniki (za wyjątkiem czerwonego chromogenu, fiolka 5) naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). A.1 Bufor płuczący Dako Wash Buffer 10x (Nr kat.3006) naleŝy rozcieńczyć w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. NieuŜywany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do uŝycia. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 6/16

A.2 Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu Przed pobraniem porcji odczynnika Red Chromogen z fiolki 5, naleŝy postukać w nią kilka razy lub wymieszać roztwór i krótko zwirować. Przygotować wystarczającą ilość Roztworu chromogenu o czerwonym zabarwieniu, przynajmniej 1 ml odczynnika. Sposób przygotowania 1,01 ml roztworu Red Chromogen Solution: Przenieść 1 ml Red Chromogen Buffer z fiolki 3 do odpowiedniej pustej fiolki. Dodać 10 µl odczynnika Red Chromogen z fiolki 5. Starannie wymieszać. Uwaga: Przygotowany roztwór Red Chromogen Solution powinien zostać zuŝyty w ciągu 20 minut. Aby uzyskać moŝliwie jak najlepsze wyniki, roztwór Red Chromogen Solution naleŝy przygotować bezpośrednio przed uŝyciem. A.3 Roztwór chromogenu o niebieskim zabarwieniu Przed pobraniem porcji odczynnika Blue Chromogen z fiolki 6, naleŝy go dokładnie wymieszać, np. stosując mieszadło wirowe vortex przez 10 sekund, i krótko odwirować celem usunięcia płynu z pokrywki. Niezwłocznie przystąpić do przygotowywania roztworu odczynnika Blue Chromogen. Przygotować wystarczającą na całą serię ilość roztworu Blue Chromogen. PoniŜsza procedura pozwala uzyskać 1,07 ml roztworu Blue Chromogen: Dla otrzymania 1,075 ml roztworu Blue Chromogen, przenieść 1 ml roztworu Blue Substrate Buffer z fiolki 4 do odpowiedniej pustej fiolki. Dodać 75 µl dokładnie wymieszanego Blue Chromogen z fiolki 6. Starannie wymieszać. Jeśli potrzebna jest mniejsza objętość roztworu Blue Chromogen, proporcjonalnie zmniejszyć ilość stosowanych składników, np. 0,2 ml roztworu Blue Chromogen przygotowywać dodając 15 µl starannie wymieszanego odczynnika Blue Chromogen z fiolki 6 do 200 µl roztworu Blue Substrate Buffer z fiolki 4. Uwaga: Zaleca się przygotowywać roztwór Blue Chromogen przynajmniej 30 minut przed uŝyciem. Roztwór Blue Chromogen naleŝy zuŝyć w przeciągu 8 dni (przy przechowywaniu w 2-8 ºC w ciemności). A.4 Barwienie kontrastowe Dako Hematoxylin (Nr kat.s3301) naleŝy rozcieńczyć w stosunku 1:5 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. Niewykorzystana rozcieńczona hematoksylina moŝe być przechowywana w temperaturze pokojowej (20 25 C) przez jeden dzień. W celu uzyskania informacji o barwieniu metodą ręczną, przejść do etapu B.1 Procedura ręcznego wykonywania odczynu. W celu uzyskania informacji o barwieniu zautomatyzowanym, przejść do etapu B.3 Zautomatyzowane wykonywanie odczynu. B. Procedura wykonania odczynu B.1 Uwagi dotyczące procedury wykonania odczynu metodą ręczną Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŝnie przeczytać podane instrukcje i zapoznać się ze wszystkimi elementami zestawu (patrz rozdział Środki ostroŝności). Przed uŝyciem, wszystkie odczynniki (za wyjątkiem czerwonego chromogenu, fiolka 5) naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Wszystkie procedury inkubacji naleŝy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (20 25 C). Podczas wykonywania barwienia nie moŝna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone skrawki tkankowe mogą dawać silniejszy nieswoisty odczyn. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 7/16

B.2 Protokół ręcznego wykonania odczynu Wykonanie w temperaturze pokojowej (20 25 C) Etap 1: Płukanie Zamiast wykonywania ostatniego etapu w barwieniu Dako FISH (odwodnienie, suszenie na powietrzu i zatapianie szkiełek ze środkami Fluorescence Mounting Media) szkiełka do barwienia CISH są zanurzane w rozcieńczonym Buforem płuczącym (prosimy zapoznać się z A.1 Bufor płuczący) przez 3 minuty. Etap 2: Odczynnik blokujący peroksydazę Strząsnąć nadmiar buforu. Przy uŝyciu chusteczki niepozostawiającej nitek, starannie przetrzeć szkiełko wokół preparatu, aby usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze zawierającym materiał. Zakryć preparat przy pomocy 200 µl odczynnika blokującego peroksydazę. Inkubować przez 5 (±1) minut. Zanurzyć w rozcieńczonym Buforem płuczący przez 3 minuty. Jednokrotnie powtórzyć czynność w świeŝym Buforem płuczący. Etap 3: CISH Antibody Mix Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Zakryć preparat przy pomocy 200 µl CISH Antibody Mix. Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŝacza. Zanurzyć w rozcieńczonym Buforem płuczącym przez 3 minuty. Jednokrotnie powtórzyć czynność w świeŝym Buforem płuczącym. Etap 4: Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu (przygotować bezpośrednio przed uŝyciem) Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Zakryć preparat przy pomocy 200 µl roztworu Red Chromogen. Inkubować przez 10 minut w komorze nawilŝacza. Zanurzyć w rozcieńczonym Buforem płuczącym na 3 minuty. Jednokrotnie powtórzyć czynność w świeŝym Buforem płuczącym. Etap 5: Roztwór chromogenu o niebieskim zabarwieniu (przygotować 30 minut przed uŝyciem) Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Zakryć preparat przy pomocy 200 µl Roztworu chromogenu o niebieskim zabarwieniu. Inkubować przez 10 minut w komorze nawilŝacza. Zanurzyć w rozcieńczonym Buforem płuczącym na 3 minuty. Jednokrotnie powtórzyć czynność w świeŝym Buforem płuczącym. Etap 6: Barwienie kontrastowe Zanurzyć szkiełka w hematoksylinie (Dako Hematoxylin (Nr kat. S3301) rozcieńczenie 1:5) na 5 minut. Przepłukać w Bufor płuczący i umieścić skrawki tkankowe w świeŝym Buforze płuczącym na minimum 5 minut aŝ do uzyskania niebieskiego zabarwienia kontrastowego hematoksyliną. Dokładnie przemyć wodą destylowaną lub dejonizowaną. Wysuszyć skrawki na powietrzu lub przez 30 minut w temp. 37 C w Dako Hybridizer. Przed zatapianiem, odczekać aŝ temperatura skrawków spadnie do temperatury pokojowej. Etap 7: Zatapianie preparatu Po całkowitym wysuszeniu preparatów tkankowych na powietrzu, naleŝy nakryć je środkami do zatapiania trwałego (niebędącymi na bazie alkoholu i ksylenu), bądź wodnymi środkami do zatapiania. Do trwałego zatapiania zastosować np. Tissue-Mount produkcji Sakura. Zalecane wodne środki do zatapiania to np. Aquatex produkcji Merck lub EMD Chemicals (USA). (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 8/16

Uwaga: NaleŜy unikać poddawania preparatów działaniu alkoholu lub ksylenu przed zatapianiem. Mogłoby to zmniejszyć czułość odczynu i doprowadzić do zmniejszenia skuteczności barwienia. B.3 Uwagi dotyczące procedury wykonania odczynu metodą zautomatyzowaną (Dako Autostainer) Wszystkie procedury inkubacji naleŝy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (20 25 C). Zamiast wykonania ostatniego etapu w barwieniu Dako FISH (odwadnianie, suszenie na powietrzu oraz zatapianie szkiełek ze środkiem Fluorescence Mounting Media), szkiełka do metody Dako DuoCISH umieszcza się na aparacie Autostainer. Przed wykonaniem zautomatyzowanego barwienia na aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus naleŝy przygotować odczynniki (Patrz Przygotowanie odczynników), z Fiolki 1 (odczynnik blokujący peroksydazę) i z Fiolki 2 (Antibody Mix) w fiolkach Dako Autostainer Reagent Vials (Nr kat. S3425). Maksymalna liczba preparatów w jednej serii wynosi 30, ze względu na stabilność przygotowanego roztworu chromogenu o czerwonym zabarwieniu. Przed wykonaniem zautomatyzowanego barwienia na aparatach Autostainer Plus Link naleŝy przygotować odczynniki (Patrz Przygotowanie odczynników) w butelkach Dako Reagent Bottles, User-Fillable (12 ml: Nr kat. SK201, 5 ml: Nr kat. SK200). Odczynniki dostarczone w zestawie wystarczają na 20 testów w 6-7 osobnych seriach. Jeśli 20 preparatów jest obrabianych w jednej serii, stosować 12 ml butelki User-Fillable (SK201). Fiolki 1 i 2 zawierają gotowe odczynniki, w ilości wystarczającej na 20 preparatów. NaleŜy zwrócić uwagę na niekompatybilność z innymi protokołami w danej serii na urządzeniu Autostainer ze względu na stabilność przygotowanego roztworu chromogenu o czerwonym zabarwieniu. B.4 Protokół zautomatyzowanego barwienia Załadować szkiełka na Dako Autostainer Nie dopuszczać do wysuszania skrawków tkankowych przy załadowaniu szkiełek na Dako Autostainer oraz podczas procedury wykonania odczynu. Wysuszone skrawki tkankowe mogą mogą dawać silniejszy nieswoisty odczyn. Jeśli program szablonowy (patrz Rysunek 1) nie jest dostępny w uŝywanym aparacie Dako Autostainer, naleŝy skontaktować się z działem technicznym firmy Dako. Protokół automatycznego barwienia Przeprowadzić konfigurację przy uŝyciu Autoprogramów, a następnie uruchomić program Dako DuoCISH. Etap 1: Umieścić fiolki z odczynnikami (z wyjątkiem fiolki z roztworem chromogenu o czerwonym zabarwieniu Solution) w statywie na odczynniki Dako Autostainer zgodnie z generowaną przez oprogramowanie mapą odczynników. Etap 2: Załadować szkiełka ze skrawkami na aparat Dako Autostainer zgodnie z mapą szkiełek generowaną przez oprogramowanie. Etap 3: Rozpocząć serię odczynów. W przypadku barwienia na aparatach Autostainer Plus Link wybrać Przedmuch powietrzem w celu zakończenia. Etap 4: Po etapie 6 (patrz Rysunek 2) aparat Dako Autostainer zatrzyma się. Wówczas naleŝy przygotować fiolkę z roztworem chromogenu o czerwonym zabarwieniu (Patrz Przygotowanie odczynników) i umieścić ją w statywie na odczynniki Dako Autostainer zgodnie z generowaną przez oprogramowanie mapą odczynników. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 9/16

Etap 5: Po zakończeniu programu wyjąć szkiełka z Dako Autostainer. Rysunek 1. Ogólny program dla aparatów Dako Autostainer 1. Bufor płuczący, spłukanie 2. odczynnik blokujący peroksydazę, 200 µl, 5 minut 3. Bufor płuczący, spłukanie 4. CISH Antibody Mix, 200 µl, 30 minut 5. Bufor płuczący, spłukanie 6. Bufor płuczący, spłukanie 7. Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu, 200 µl, 10 minut 8. Bufor płuczący, spłukanie 9. Bufor płuczący, spłukanie 10. Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu, 200 µl, 10 minut 11. Bufor płuczący, spłukanie 12. Bufor płuczący, spłukanie 13. Rozcieńczona hematoksylina, 200 µl, 5 minut 14. Bufor płuczący, spłukanie 15. Bufor płuczący, 200 µl, 5 minut 16. Woda dejonizowana, spłukanie 17. Woda dejonizowana, spłukanie 18. Przedmuch powietrza* * W aparatach Dako Autostainer Plus Link wybrać Przedmuch powietrza jako zakończenie. Etap 6: Zatapianie preparatu Po całkowitym wysuszeniu preparatów tkankowych na powietrzu (np. 30 minut przy 37 C na Dako Hybridizer), naleŝy nakryć je środkami do zatapiania trwałego (niebędącymi na bazie alkoholu i ksylenu), bądź wodnymi środkami do zatapiania. Do trwałego zatapiania zastosować np. Tissue-Mount produkcji Sakura. Do wodnego zatapiania zastosować np. Aquatex produkcji Merck lub EMD Chemicals (USA). Uwaga: NaleŜy unikać poddawania preparatów działaniu alkoholu lub ksylenu przed zatapianiem. Mogłoby to zmniejszyć czułość odczynu i doprowadzić do zmniejszenia skuteczności barwienia. Kontrola jakości 1. Sygnały powinny być czytelne, wyrównane pod względem intensywności i rozmiaru punktów, łatwe do wyróŝnienia i oceny. 2. Komórki prawidłowe pozwalają na wewnętrzną kontrolę serii odczynów. Prawidłowe komórki powinny dawać 1-2 wyraźnie widoczne niebieskie i 1-2 wyraźnie widoczne czerwone sygnały, wyrównane pod względem intensywności i rozmiaru punktów. Dystrybucja sygnałów uzaleŝniona będzie od stosowanej sondy. Prosimy zapoznać się z ulotką załączoną do opakowania sondy w celu uzyskania dalszych informacji. W razie pocięcia tkanki, w niektórych komórkach prawidłowych liczba sygnałów będzie niŝsza od przewidzianych 2 sygnałów dla kaŝdego koloru. Brak sygnałów w komórkach tkanki prawidłowej wskazuje na nieprawidłowy przebieg testu w takiej sytuacji wyniki naleŝy uznać za niewaŝne. Ocena numeryczna komórek prawidłowych powinna dać wynik odpowiadający przewidzianej wartości. 3. Ocena morfologii jąder nie powinna wykazywać Ŝadnych nieprawidłowości. DuŜa liczba komórek pustych i ogólnie zaburzona morfologia jąder wskazuje na nadmierne wytrawienie preparatu, prowadzące do utraty lub rozproszenia sygnałów. Wyników z takich preparatów nie naleŝy brać pod uwagę. 4. RóŜnice w metodach utrwalania, przetwarzania i zatapiania tkanek, stosowanych w laboratorium UŜytkownika, mogą powodować istotne róŝnice wyników, wymagające rutynowej oceny kontroli wewnętrznych. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 10/16

Stosowanie mikroskopu jasnego pola Stosowanie obiektywu mikroskopu o odpowiedniej jakości i powiększeniu umoŝliwi ocenę preparatów. Wyregulować natęŝenie światła w celu łatwej separacji barwy niebieskiej i czerwonej. Zmieniać ostrość, aby móc zauwaŝyć wszystkie sygnały w poszczególnych jądrach. Interpretacja odczynu Próbki powinny być oceniane według wytycznych załączonych do sondy FISH stosowanej z zestawem Dako DuoCISH. PoniewaŜ jednak sygnały CISH są nieco szersze od odpowiadających im sygnałów FISH, naleŝy wziąć pod uwagę następujące zasady: Dla testów amplifikacji genu Jeśli wydaje się, Ŝe sygnał posiada więcej ośrodków pochodzenia, i skutkiem tego jego kształt znacznie odbiega od okrągłego punktu, naleŝy zliczyć go jako dwa sygnały (prosimy zapoznać się z zamieszczonymi niŝej wskazówkami dotyczącymi zliczania sygnałów) W jądrach o wysokim poziomie amplifikacji genu, czerwone sygnały mogą znajdować się bardzo blisko siebie, tworząc skupisko sygnałów. W takich przypadkach nie jest moŝliwe zliczenie czerwonych sygnałów i naleŝy przeprowadzić oszacowanie. Szczególną uwagę naleŝy zwrócić na sygnały niebieskie, poniewaŝ skupiska czerwonych sygnałów mogą pokrywać sygnały niebieskie, uniemoŝliwiając ich dostrzeŝenie. W razie wątpliwości nie naleŝy uwzględniać tych jąder w ocenie Dla testów translokacji sygnałów rozszczepionych Rozszczepienie widoczne jest, gdy niebieskie i czerwone sygnały są wyraźnie oddzielone. Nakładanie się niebieskich i czerwonych sygnałów wskazuje na kolokalizację (brak rozszczepienia) W razie wątpliwości nie naleŝy uwzględniać tych jąder w ocenie Wskazówki dotyczące zliczania sygnałów dla testu amplifikacji genu 1 Nie liczyć. Jądra komórkowe nakładają się na siebie, nie wszystkie obszary jądra są widoczne. 2 Zliczyć jako 3 sygnały niebieskie i 12 sygnałów czerwonych (oszacowanie skupiska). 3 Zliczyć jako 2 sygnały niebieskie i 1 sygnał czerwony. Sygnały, które wydają się posiadać więcej niŝ jeden ośrodek pochodzenia, powinny być zliczone jako dwa sygnały. 4 Nie zliczać (jądro nadmiernie wytrawione). 5 Zliczyć jako 2 sygnały niebieskie i 5 sygnałów czerwonych. Sygnały, które wydają się posiadać więcej niŝ jeden ośrodek pochodzenia, powinny być zliczone jako dwa sygnały. 6 Zliczyć jako 1 sygnał niebieski i 5 sygnałów czerwonych. 7 Zliczyć jako 3 sygnały niebieskie (1 niebieski sygnał nieostry) i 3 sygnały czerwone. 8 Skupisko sygnałów czerwonych, zakrywających sygnały niebieskie. Przejść do wyŝszego poziomu powiększenia, aby potwierdzić ewentualną obecność niebieskich sygnałów. W razie wątpliwości nie zliczać. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 11/16

Wskazówki dotyczące zliczania sygnałów dla testu translokacji sygnałów rozszczepionych 1 Nie brać pod uwagę. Jądra komórkowe nakładają się na siebie, nie wszystkie obszary jądra są widoczne. 2 Ocenić jako dwa zestawy kolokalizowanych sygnałów (translokacja - komórka o odczynie ujemnym). 3 Nie oceniać (jądro nadmiernie wytrawione). 4 Ocenić jako jeden zestaw kolokalizowanych sygnałów i jeden zestaw rozszczepionych sygnałów (translokacja - komórka o odczynie dodatnim) Ograniczenia 1. Dako DuoCISH jest stosowany do skrawków tkankowych barwionych z zastosowaniem Dako FISH. UŜytkownicy powinni w związku z tym zapoznać się z procedurą postępowania i z instrukcją Dako FISH. 2. Dako DuoCISH to wieloetapowa procedura wymagająca przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, w przygotowywaniu preparatu CISH i w interpretacji wyników barwienia. 3. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać prawidłową interpretację wyników. 4. Nie wolno zastępować odczynników związkami o innych oznaczeniach partii lub odczynnikami innych producentów. 5. Procedura barwienia powinna być przeprowadzana w temperaturze otoczenia wynoszącej 20 25 C. 6. Nie prowadzono weryfikacji stosowania Dako DuoCISH do uŝycia z zestawami Dako pharmdx FISH. Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak lub słabe sygnały 1a. Zestaw naraŝony był na działanie wysokich temperatur podczas transportu lub przechowywania 1b. Fiolka 1 i fiolka 2 wystawione były na działanie światła 1c. Odczynniki nie są uŝywane we właściwej kolejności. 1a. Sprawdzić warunki przechowywania. NaleŜy upewnić się, Ŝe element mroŝący był zimny przy odbiorze wysyłki. NaleŜy upewnić się, Ŝe zestaw był przechowywany w maksymalnej temp. 2 8 C. 1b. Upewnić się, Ŝe fiolka 1 i fiolka 2 były rzechowywane w zaciemnionym miejscu. 1c. Przejrzeć zastosowane odczynniki. 1d. Błąd programowania. Odczynniki nie są (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 12/16

2. Obszary pozbawione sygnału uŝywane we właściwej kolejności 1e. Niedostateczna ilość odczynnika w fiolce. 1f. Nieodpowiednie czasy inkubacji 1g. Niewystarczające wymieszanie Niebieskiego chromogenu (fiolka 6) przed przygotowaniem Roztworu chromogenu o niebieskim zabarwieniu 1h. Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu i/lub Roztwór chromogenu o niebieskim zabarwieniu nie są uŝywane we wskazanym czasie 1i. Ustawienia mikroskopu nie są optymalne dla oceny CISH - Nieodpowiednia lampa - WyŜsze powiększenie (obiektyw x60 lub x100 ) - Przy ocenie sond translokacyjnych zmienić na obiektywy olejowe x40 bądź x60. 2a. Za mała objętość odczynnika 2b. Nabranie pęcherzy powietrza podczas zatapiania 1d. Skontrolować tabelę programowania w celu weryfikacji, czy seria odczynów została prawidłowo zaprogramowana. 1e. Upewnić się, Ŝe wystarczająca ilość odczynnika jest załadowana do fiolek odczynnika przed rozpoczynaniem procesu. Zapoznać się z mapą odczynników, aby uzyskać informacje o wymaganych objętościach. 1f. Przejrzeć wskazówki dotyczące procedury barwienia. 1g. Dokładnie mieszać Niebieski chromogen z fiolki 6 przez 10 sekund, i krótko odwirować, celem usunięcia płynu z pokrywki. 1h. Przygotowany Roztwór chromogenu o czerwonym zabarwieniu naleŝy wykorzystać w ciągu 20 minut. Przygotowany Roztwór chromogenu o niebieskim zabarwieniu naleŝy zuŝyć w przeciągu 8 dni (pod warunkiem przechowywania w temperaturze 2-8 ºC, w ciemności). 1i. Wypróbować inne ustawienia mikroskopu. W razie wątpliwości, prosimy skontaktować się z lokalnym dostawcą mikroskopu. 2a. NaleŜy upewnić się, Ŝe objętość odczynnika jest wystarczająca, aby pokryć obszar tkanki. 2b. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza. W razie ich występowania, naleŝy przejść ze środków do trwałego zatapiania (nie na bazie alkoholu/ nie na bazie ksylenu) na wodne środki do zatapiania. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 13/16

3. Nadmierne wybarwienie tła preparatów 4. Nadmiernie silny odczyn swoisty 3a. Preparaty nie są odpowiednio przemywane. 3b. Wysychanie skrawków podczas ręcznego wykonywania odczynu. 3c. Wysychanie skrawków podczas zautomatyzowanego wykonywania odczynu. 3d. Wysychanie skrawków podczas załadowywania Autostainer 4a. Zbyt długie czasy inkubacji odczynników. 4b. UŜyto niewłaściwego roztworu płuczącego. 3a. Stosować świeŝy Bufor płuczący. Upewnić się, Ŝe Autostainer został odpowiednio przygotowany do barwienia serii. Upewnić się, Ŝe dostępny jest odpowiedni bufor dla całego procesu. 3b. Stosować komorę nawilŝającą. Przecierać tylko trzy do czterech preparatów za jednym razem przed nakładaniem odczynnika. 3c. Sprawdzić, czy nałoŝono właściwą ilość odczynnika w preparatach. Upewnić się, Ŝe podczas pracy aparatu Autostainer pokrywa była zamknięta, a aparat nie był naraŝony na działanie nadmiernego ciepła. 3d. Upewnić się, Ŝe skrawki pozostaną nawilŝone buforem przy umieszczaniu w aparacie i przed rozpoczęciem barwienia. 4a. Przejrzeć wskazówki procedury wykonania odczynu. 4b. Stosować tylko Bufor płuczący zalecany dla zestawu. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 14/16

5. Zaburzona morfologia tkanki 6. Barwienie kontrastowe hematoksyliną utrudnia dostrzeŝenie swoistych sygnałów Dako DuoCISH 7. Nadmierne wybarwienie tła przy uŝyciu sond translokacyjnych FISH 5. Tkanka nadmiernie wytrawiona 5. Skrócić czas inkubacji w pepsynie w procedurze barwienia Dako FISH. Dla tkanki utrwalonej w obojętnej, zbuforowanej formalinie (24 godziny) i zatopionej w parafinie, 2 minuty inkubacji w pepsynie przez 37 C stanowią dobry punkt wyjścia. Pomiędzy morfologią tkanki a intensywnością/ jakością sygnału istnieje równowaga, której uŝytkownik powinien być świadomy przy przygotowywaniu gradientu pepsyny w procedurze FISH, jako Ŝe zarówno zbyt małe jak i zbyt duŝe wytrawienie preparatów tkankowych wpływa na intensywność/jakość sygnału. 6a. Barwienie kontrastowe hematoksyliną zbyt silne 7a. Niewystarczające głębokie płukanie w procedurze FISH 6a. Dalsze rozcieńczenie hematoksyliny. 7a. Dodatkowe głębokie płukanie w procedurze FISH. PrzedłuŜyć czas trwania głębokiego płukania, np. z 10 na 20 minut. 7b. Zbyt silne wybarwienie Niebieskim chromogenem 7b. Bardziej rozcieńczyć Roztwór chromogenu o niebieskim zabarwieniu, np. pobrać 37,5 µl chromogenu i 1 ml roztworu buforowego do rozcieńczania. Ponadto, moŝna pominąć barwienie kontrastowe dla poprawy równowagi pomiędzy intensywnością sygnału i wybarwieniem tła. Uwaga: Jeśli problemu nie daje się przypisać Ŝadnej z powyŝszych przyczyn, bądź jeśli zalecane postępowanie jest nieskuteczne, naleŝy się skontaktować z działem technicznym firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 15/16

Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania Numer serii Toxic (Trucizna) Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Przechowywać w ciemnym miejscu Data waŝności Sprawdzić w instrukcji stosowania Zawartość wystarcza na <n> testów Producent Wyprodukowane przez Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 www.dako.com (115912-002) SK108/PL/ULH 20090810 s. 16/16