Badania naukowe nad genetycznie uwarunkowanymi czynnikami powodującymi otyłość Wyodrębnij swoje DNA Warsztaty eksperymentalne PROTOKÓŁ POSTĘPOWANIA
Wprowadzenie Częstość występowania otyłości na całym świecie wzrasta. Lekarze i naukowcy są zaniepokojeni zagrożeniem dla zdrowia, jakie niesie nadwaga i otyłość. Z tego powodu próbują zrozumieć, co tak naprawdę powoduje otyłość, by móc zaprojektować nowe strategie zapobiegania temu schorzeniu i jego leczenia. W niektórych przypadkach otyłość może wywołać cukrzycę typu 2. Cukrzyca to choroba, która powoduje wzrost poziomu glukozy we krwi. Osoby z nadwagą mają więcej komórek tkanki tłuszczowej w ciele, co utrudnia prawidłowe wykorzystanie insuliny przez organizm. Insulina to hormon, który umożliwia komórkom wątroby, mięśni i tkanki tłuszczowej pobieranie glukozy z krwi. Co więcej powoduje że glukoza jest magazynowana w wątrobie i w mięśniach jako glikogen i uniemożliwia wykorzystywanie tłuszczu jako źródła energii. Podstawowe informacje o otyłości i nadwadze Od 1980 roku liczba osób otyłych na całym świecie wzrosła ponad dwukrotnie. W 2008 roku 1,5 miliarda osób od 20 roku życia miało nadwagę. 65% ludności świata żyje w krajach, w których nadwaga i otyłość należą do najważniejszych przyczyn zgonów. W 2010 roku około 43 milionów dzieci poniżej 5 roku życia miało nadwagę (dane z ONZ, marzec 2011). Kiedy jest mowa o predyspozycji do otyłości i cukrzycy typu 2, istotnym czynnikiem jest występowanie tych chorób w rodzinie. Ryzyko wystąpienia otyłości lub cukrzycy typu 2 znacznie wzrasta, jeżeli mamy w rodzinie osoby otyłe i cierpiące na te schorzenia. 2
Badania naukowe nad genetycznie uwarunkowanymi czynnikami powodującymi otyłość Aby przeanalizować potencjalne ryzyko związane z dziedzicznymi czynnikami wywołującymi cukrzycę typu 2, naukowcy opieraja swoje badania na DNA. Badają próbki DNA pobrane od osób otyłych i osób chorych na cukrzycę, a następnie porównują je z próbkami uzyskanymi od osoby zdrowej, aby odnaleźć różnice. tłuszczowej. DNA szczura jest sekwencjonowane, aby poznać kolejność ułożenia nukleotydów. Tym sposobem, odkryto gen któremu nadano nazwę DOR (z ang. Diabetes and Obesity Regulated; odpowiedzialny za cukrzycę i otyłość), który zachowuje się w odmienny sposób u szczurów z otyłością i cukrzycą niż u szczurów normalnych (jego ekspresja ma mniejsze nasilenie). Aby dokonać sekwencjonowania tych genów, naukowcy muszą najpierw wyodrębnić DNA. Badania te są najpierw prowadzone na szczurach. Próbka DNA jest ekstrahowana z komórek mięśniowych i tkanki Chromatyda Telomer Komórka Centromer Jądro Telomer Histony Pary zasad DNA (podwójna helisa) 3
Co to jest DNA? DNA, czyli kwas deoksyrybonukleinowy, to chemiczny związek organiczny. Pełni on rolę nośnika informacji genetycznej, która jest niezbędna do funkcjonowania i rozwoju każdego żywego organizmu z wyjątkiem niektórych wirusów. Gdzie można znaleźć DNA? DNA jest obecne w każdym żywym organizmie. U bakterii DNA znajduje się w cytoplazmie, a u bardziej złożonych organizmów - takich jak rośliny, zwierzęta i inne organizmy wielokomórkowe - jest zamknięte w jądrze komórkowym. DNA jest upakowane w chromosomach i zawiera kod genetyczny, zawierający instrukcje niezbędne do rozwoju i życia organizmu. Ta instrukcja to geny, które przechowują zakodowane informacje i są odpowiedzialne za ich przekazywanie następnym pokoleniom. Z czego składa się DNA? DNA jest cząsteczką składającą się z kombinacji powtórzeń trzech typów cząsteczek: zasady azotowej, reszty kwasu fosforowego i cukru - pentozy. Każda jednostka składająca się z tych trzech cząsteczek to monomer, a ponieważ DNA posiada wiele powtórzonych monomerów, jest nazywany polimerem. Każdy monomer jest złożony z nukleotydu. Nukleotydy zawierają różne zasady (oznaczane literami A, C, G i T), których uporządkowanie tworzy rodzaj kodu kreskowego. Tymina Adenina koniec 5 oligonukleotydu koniec 3 oligonukleotydu Fosforan Deoksyrybozafosforan kręgosłup Deoksyryboza (pentoza) koniec 3 oligonukleotydu Guanina Cytozyna koniec 5 oligonukleotydu 4
Cele Naszym celem jest wyodrębnienie DNA z naszych własnych komórek w szybki i łatwy sposób. Czy zastanawiałeś się kiedyś, w jaki sposób policja wyodrębnia DNA z próbek, które zostały pobrane na miejscu przestępstwa? W jaki sposób naukowcy wyodrębniają DNA z komórek i izolują je od lipidów, białek, węglowodanów i soli? Metoda 1 Pobieranie próbki Pierwszy krok stanowi pobranie komórek z których będziemy ekstrahować DNA. Komórki te można w bardzo łatwy sposób uzyskać poprzez pobranie wymazu z jamy ustnej. rozluźniona, a inne cząstki organiczne w naszej próbce także zostaną rozłożone. Jednym z nich jest enzym o nazwie DNaza, który przecina DNA. 3. Neutralizacja ładunku w DNA: do procesu tego używa się soli o wszechstronnym zastosowaniu: octan sodu (NaAc). Dodatnio naładowane cząsteczki Na+ wiążą się z grupami fosforanowymi w DNA, neutralizując ich silny ładunek ujemny. 2 Uwolnienie zawartości komórek Od razu możemy zacząć przetwarzanie naszej próbki w następujący sposób: 1 Liza:ten proces powoduje rozerwanie błony komórkowej i jądrowej. Błony ulegają rozerwaniu pod wpływem detergentów, co powoduje uwolnienie DNA do roztworu. 2. Rozluźnienie struktury DNA: użyjemy proteinazy K, enzymu który spowoduje rozłożenie białek połączonych z DNA i utrzymującym jego upakowanie. Kiedy proteinaza K zareaguje, struktura DNA zostanie 3 Wytrącanie DNA Ostatnim zabiegiem jest wytrącenie DNA, dzięki któremu to co niewidoczne, staje się widoczne. Używamy w tym celu etanolu. DNA jest rozpuszczalne w wodzie, ale po dodaniu etanolu DNA wytrąca się. Po dodaniu etanolu zaczynają się pojawiać białe pasma w roztworze. Jest to nasz DNA. Przed dodaniem etanolu Po dodaniu etanolu Wytrącony DNA 5
Potrzebny sprzęt i materiały Instrumenty i urządzenia laboratoryjne Mikropipeta o pojemności od 20 do 200 μl Mikropipeta o pojemności od 1 do 5 ml Timer Materiały jednorazowego użytku Wymazówka do pobrania wymazu z jamy ustnej Plastikowe pipety Pasteura Końcówki do mikropipet Końcówki do mikropipet o większej pojemności Probówka typu Falcon o pojemności 15 ml Marker permanentny Rękawiczki, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne 6
Odczynniki i rozpuszczalniki Octan sodu Proteinaza K Roztwór proteinazy K -20ºC Roztwór do lizy, złożony z soli i detergentów Roztwór octanu sodu Zimny etanol (przechowuj w zamrażarce w temp. -20ºC) 7
Procedura A Ekstrakcja komórek nabłonka Pierwszym krokiem jest zawsze uzyskanie dobrej próbki. Uzyskamy ją przez pobranie wymazu z jamy ustnej. Znajduje się tam mnóstwo obumarłych, łatwych do pobrania komórek, które zawierają dużo DNA. 1 Przygotuj probówkę typu Falcon z 1ml roztworu do lizy. Nie zamykaj probówki, aby ułatwić sobie następne kroki. 2 Pobieraj wymaz z jamy ustnej przez co najmniej 2 minuty, przeciągając wymazówkę po wewnętrznej stronie policzków i wierzchu języka. Tym sposobem uzyskasz wystarczającą ilość komórek nabłonka. Zanurz wymazówkę w probówce typu Falcon z roztworem do lizy i lekko zamieszaj. 1 ml roztworu do lizy Wyjmij wymazówkę z probówki i natychmiast ją wyrzuć (ważne jest, aby nie wkładać jej ponownie do ust). 3 Zassij policzki, aby ułatwić przejście komórek nabłonka z jamy ustnej do śliny. Pobierz próbkę śliny za pomocą pipety Pasteura i dodaj całą zawartość do probówki z pierwszą próbką. 4 Szczelnie zamknij probówkę zatyczką i wymieszaj zawartość, obracając ją kilkakrotnie spodem do góry. Im więcej śliny, tym więcej DNA! 8
B Uwolnienie zawartości komórek 1 Dodaj 20 µl proteinazy K, by przeciąć białka: oprzyj końcówkę pipety o ściankę probówki i pozwól, by proteinaza do niej spłynęła. 2 Szczelnie zamknij probówkę zatyczką i wymieszaj zawartość, obracając ją kilkakrotnie spodem do góry. Pozostaw próbkę do inkubacji przez 10 min. C Wytrącanie DNA 1 Odczytaj przybliżoną objętość (V) pobranej próbki ze skali na probówce. Wynik wpisz tutaj: V= ml 9
2 Do próbki dodaj jedną dziesiątą objętości (V/10) rozpuszczonego octanu sodu. Jeśli na przykład pierwotna objętość próbki wynosiła 1 ml, musisz dodać 100 µl octanu sodu: 1 ml=1000 µl 1000 µl/10=100 µl do dodania. Tu wpisz swoje obliczenia: Szczelnie zamknij probówkę zatyczką i mocno nią wstrząśnij w pozycji pionowej. 3 4 Dodaj trzykrotność początkowej objętości (Vx3) zimnego etanolu. Jeśli na przykład początkowa objętość próbki wynosiła 1 ml, musisz dodać 3 ml etanolu: 1 ml x 3 = 3 ml etanolu Powoli odwracaj probówkę dnem do góry, aby wymieszać zawartość. Twoje DNA pojawi się w postaci białawej zawiesiny. Tu wpisz swoje obliczenia: Wytrącone DNA 10
Wyniki i wnioski 1 Co zobaczyłeś na końcu eksperymentu? Co spowodowało ten efekt? Dlaczego? 2- Co by się stało, gdybyś do ostatniego etapu wytrącania użył zimnej wody zamiast etanolu? 3- Co Twoim zdaniem wywołałoby pominięcie pierwszego etapu, lizy? 4- Dlaczego istotne jest dodanie proteinazy K? Narysuj ilustrację prezentującą proces, który Twoim zdaniem zaszedł po dodaniu proteinazy K. 11
5. Który z dodanych składników zneutralizował ładunki? Dlaczego ten etap jest istotny? 6. Czy uważasz, że ten schemat postępowania byłby skuteczny, gdyby jako próbki użyto włosa? A gdyby użyto komórek roślinnych? 7. Istnieje podobny sposób ekstrakcji DNA, w którym wykorzystuje się słoną wodę, płyn do naczyń i etanol. Porównaj te składniki z tymi, których użyto w sposobie zaprezentowanym w naszym doświadczeniu. 12
Załącznik 1 Środki ostrożności Przygotuj się teoretycznie Zapoznaj się ze środkami bezpieczeństwa zamontowanymi w laboratorium lub pomieszczeniu dostosowanym do przeprowadzenia eksperymentu (gaśnice, prysznic lub wanna, wyjścia awaryjne, etc.). Uważnie przeczytaj instrukcję przed rozpoczęciem eksperymentu. Nie zapomnij przeczytać etykiet bezpieczeństwa umieszczonych na odczynnikach i urządzeniach. Załóż odpowiednią odzież Rękawiczki, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne Zasady ogólne W laboratorium lub miejscu przystosowanym do przeprowadzenia eksperymentu surowo zabronione jest palenie, jedzenie i picie. Eksperyment przeprowadzaj bez pośpiechu i w sposób uporządkowany, zachowując czystość. Jeżeli dojdzie do rozlania jakiegokolwiek płynu, należy natychmiast zetrzeć plamę. Zawsze utrzymuj czystość i porządek w miejscu, w którym wykonujesz eksperyment. Zabrania się używania sprzętu i urządzeń dostępnych w miejscu wykonywania doświadczenia bez znajomości zasad ich obsługi. Przed opuszczeniem laboratorium umyj ręce. one różną temperaturę -nie jesteś w stanie określić czy są one gorące, czy zimne po samym wyglądzie. Nie wolno używać pękniętych przedmiotów szklanych. Produkty chemiczne Nie wolno używać butelki z odczynnikiem chemicznym, na której nie ma etykiety lub odpowiedniej identyfikacji. Nie wolno wąchać, smakować ani dotykać produktów chemicznych. Nie wolno wciągać cieczy do pipety ustami. Podczas pracy z substancjami toksycznymi lub żrącymi należy używać rękawic i często myć ręce. Po wniknięciu tych substancji do oczu należy natychmiast wypłukać oczy dużą ilością wody. Nie należy umieszczać pojemników z odczynnikami w pobliżu ognia. Nie należy podgrzewać cieczy łatwopalnych. Przenosząc naczynia, należy je podtrzymywać od dołu, a nie chwytać od góry. Pozbywanie się odpadów Niezużytych resztek substancji stałych i płynnych należy pozbywać się umieszczając je w specjalnie przeznaczonych do tego pojemnikach. W razie wątpliwości należy zasięgnąć rady nauczyciela. Nie wolno wrzucać substancji stałych do zlewu. Pamiętaj W razie wypadku natychmiast powiadom swojego nauczyciela. Postępowanie ze szkłem Używając przedmiotów ze szkła, należy zwróć szczególną uwagę na ochronę rąk i pamiętać o tym że mogą mieć SPECJALNE ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA DOTYCZĄCE TYCH WARSZTATÓW Laurylosiarczan sodu (SDS): toksyczny w wypadku spożycia, kontaktu ze skórą lub drogami oddechowymi. Zasada TRIS (Tris-Base): toksyczny w wypadku spożycia, kontaktu ze skórą lub drogami oddechowymi. Ma właściwości podrażniające. Chlorowodór (HCl): toksyczny w wypadku spożycia, kontaktu ze skórą lub drogami oddechowymi. Posiada właściwości podrażniające i żrące. Octan sodu: toksyczny w wypadku spożycia, kontaktu ze skórą lub drogami oddechowymi. Proteinaza K: toksyczna w wypadku spożycia, kontaktu ze skórą lub drogami oddechowymi. Etanol: łatwopalny 13
Załącznik 2 Procedura przygotowania roztworów Przepis na roztwór do lizy (w związku z toksycznością niektórych stężonych składników, zaleca się by roztwór ten był przygotowywany wcześniej przez nauczyciela. Załóż maskę ochronną przed przygotowywaniem roztworu. Po rozcieńczeniu składników maska nie jest już konieczna). Aby uzyskać 50 ml: - NaCl = 0,292 g - SDS = 5 ml 10% SDS - TRIS-HCl = 2,5 ml ph 8 Przepis na octan sodu Aby uzyskać 40 ml: - 9,84 g octanu sodu. Dodawaj HCl, aż do uzyskania ph 5,2. Przepis na proteinazę K - 100 μg/ml (przechowuj w stanie zamrożonym) Załącznik 3 Dodatkowe informacje przydatne do kupna odczynników i niezbędnych materiałów NAZWA NR.IDENTYFIKACYJNY PRODUCENT NaCl 71381 Fluka-Sigma SDS 71725 Fluka-Sigma Tris-Base 93350 Fluka-Sigma HCl 320331 Sigma-Aldrich NaAc S2889-250G Sigma-Aldrich Proteinaza K P6556-100mg Sigma Etanol 141086.1214 Panreac Wymazówka Sanilabo 14
Bądź na bieżąco z Xplore Health! Naukowcy, którzy opracowywali ten opis: Lorena Valverde z Uniwersytetu w Barcelonie OPRACOWANY PRZEZ FINANSOWANY PRZEZ Niniejsza publikacja jest objęta dokumentem licencji Creative Commons Attribution- NonCommercial-NoDerivs 3.0 w wersji Unported. Aby zobaczyć kopię licencji, odwiedź stronę: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ 15