Jakość wyników specjacyjnego oznaczania pierwiastków techniką HPLC-ICP-MS

Jakość wyników specjacyjnego oznaczania pierwiastków techniką HPLC-ICP-MS Danuta Barałkiewicz, Izabela Komorowicz, Barbara Pikosz, Magdalena Belter Pracownia Analizy Spektroskopowej Pierwiastków Wydział Chemii UAM Praca częściowo finansowana w ramach projektu badawczego: MNiSzW N N204 140439,,Nowe procedury analityczne jednoczesnego oznaczania form specjacyjnych chromu i arsenu w wodzie metodą HPLC-ICP-MS

Podejście analityczne AAS ICP OES DETEKCJA: ICP MS Elektrochromatografia HR ICP MS Elektroforeza kapilarna ROZDZIELANIE: IDENTYFIKACJA: HPLC - żelowa - anionowymienna - kationowymienna - w układzie faz odwróconych GC ESI MS/MS NMR MALDI

Wysokosprawna chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie - HPLC-ICP-MS Gaz reakcyjny Plazma Możliwości: wysoka czułość niskie wartości granicy wykrywalności Analizator Detektor mas Soczewki skupiające DRC komora DRC liniowość w zakresie kilku rzędów wielkości 40 Ar 35 Cl + + NH 3 NH 3+ + 40 Ar 35 Cl metoda definitywna

Przygotowanie próbek do analizy Pobranie próbki Zamrożenie próbki bezpośrednio po pobraniu Rozmrożenie próbki bezpośrednio przed analizą Analiza próbki z zastosowaniem metody HPLC-ICP-MS Analiza specjacyjna Cr: rozcieńczenie próbki fazą ruchomą (tworzenie kompleksu [Cr-EDTA] - ) Analiza specjacyjna As Przesączenie przez filtr strzykawkowy o średnicy porów 0,2 µm

Analiza specjacyjna chromu RPIPC-ICP-MS Aby przeprowadzić analizę specjacyjną chromu w jednej próbce, potrzeba: 50µL próbki; 5,25 ml eluentu oraz dodatkowo raz dziennie 30 ml eleuentu na kondycjonowanie kolumny Cr-EDTA - Cr 2 O 7 2- G. Walkowiak, K. Sęk, D. Barałkiewicz, Analityka, 2, 32-34, 2010

Cr Procedura analityczna As przygotowanie wzorców i roztworów roboczych przygotowanie roztworów odpowiednich form specjacyjnych arsenu przygotowanie fazy ruchomej przygotowanie fazy ruchomej rozcieńczenie próbek fazą ruchomą (tworzenie kompleksu [Cr-EDTA] - ) kondycjonowanie kolumny fazą ruchomą (t = 30 min) kondycjonowanie fazą ruchomą kolumny chromatograficznej ( 30 min) rozdzielanie oraz ilościowe oznaczanie Cr(III) i Cr(VI) metodą HPLC-ICP-MS kondycjonowanie kolumny po analizach mieszaniną MeOH/H 2 O w stosunku 15/85 (t = 15 min) przygotowanie próbek do analizy rozdzielanie chromatograficzne AsB, As(III), As(V), MMA i DMA (czas analizy od 3-10 min.) kondycjonowanie kolumny po analizach ( 30 min w układzie H 2 O/MeOH w stosunku 95/5)

Opracowanie procedur analitycznych optymalizacja parametrów rozdzielania Procedura analityczna oznaczania: 1) As(III) i As(V) 2) MMA i DMA 3) As(III), As(V), MMA i DMA 4) AsB, As(III), As(V), MMA i DMA 5) Cr(III) i Cr(VI) Optymalizowane czynniki i parametry: (a) Czas retencji [min] 7 6 5 4 3 2 1 AsB As(III) DMA MMA As(V) 8,4 8,6 8,8 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 ph skład fazy ruchomej stężenie fazy ruchomej ph fazy ruchomej temperatura rozdzielania prędkość przepływu fazy ruchomej objętość dozowanej próbki 1,6 (b) 2,51,4 1,2 2 1 1,5 0,8 1 0,6 Czas retencji RSD [%] [min] 0,50,4 RSD dla AsB RSD dla As(III) RSD dla DMA RSD dla MMA RSD dla As(V) 00,2 8,4 0 8,6 8,8 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 0 1 2 3 4 5 ph Stężenie MeOH [%] Cr(VI) Cr(III) Szybkość tworzenia kompleksu [Cr-EDTA] -

Opracowanie procedur analitycznych optymalizacja detektora ICP-MS Optymalizowane czynniki i parametry: moc generatora plazmy natężenie przepływu strumienia gazu plazmowego natężenie przepływu strumienia gazu pomocniczego natężenie przepływu strumienia gazu rozpylającego napięcie na soczewkach ogniskujących jony natężenie przepływu strumienia gazu reakcyjnego (NH 3 ) parametry Rpq i Rpa Intensywność Ce, C eo [cps] Intensywność [cps] 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0,8 0,85 0,9 0,95 1 1,05 1,1 1,15 1,2 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 Natężenie przepływu strumienia gazu rozpylającego [L min -1 ] Ce CeO CeO/Ce 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 Moc generatora plazmy [W] intensywność sygnału jonów Cr [cps] RSD [%] 5 0 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 25 20 15 10 Stosunek intensywności Ceo/Ce x RSD [%]

Warunki optymalne rozdzielania chromatograficznego dla form specjacyjnych arsenu i chromu Tabela. Warunki rozdzielenia chromatograficznego dla opracowanych procedur analitycznych. Kolumna Zoptymalizowane parametry procedur analitycznych As(III), As(V), MMA, DMA, AsB anionowymienna, PRP-X100 Cr(III), Cr(VI) Perkin Elmer C8 (3,3 cm, 3 µm) Intensywność [cps] AsB 1,73 As(III) 2,06 DMA 2,42 MMA 4,19 As(V) 6,26 Rodzaj i stężenie fazy ruchomej 10 mm (NH 4 ) 2 HPO 4 + 10 mm NH 4 NO 3 0,6 mm EDTA + 0,8 mm TBAH Czas [min] Elucja izokratyczna izokratyczna ph 9,2 6,9 Cr(III) 1,42 Cr(VI) 1,92 Natężenie przepływu fazy ruchomej [ml min -1 ] 1,0 1,2 Temperatura [ C] 16; 22-24; 30 25 Objętość dozowanej próbki [μl] 75 50 Czas analizy [min] 7,0 3,0

ILOŚCIOWE Walidacja procedury analitycznej Walidacja jest potwierdzeniem, przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego stosowania PARAMETRY ISO/IEC 17025:2005 JAKOŚCIOWE POWTARZALNOŚĆ PRECYZJA PRECYZJA POŚREDNIA ODTWARZALNOŚĆ SPECYFICZNOŚĆ/ SELEKTYWNOŚĆ DOKŁADNOŚĆ POPRAWNOŚĆ GRANICA WYKRYWALNOŚCI CECHY WYNIKU POMIARU GRANICA OZNACZALNOŚCI LINIOWOŚĆ ZAKRES POMIAROWY SPÓJNOŚĆ POMIAROWA NIEPEWNOŚĆ POMIARU

Intensywność [cps] As 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 Cr AsB As(III) DMA MMA As(V) Charakterystyka krzywych kalibracyjnych R² = 0,9997 R 2 = 0,9998 R 2 = 0,9999 R 2 = 0,9998 R 2 = 0,9998 0 2 4 6 8 10 Stężenie As [µg L -1 ] Intensywność [cps] 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 y [Cr(VI)] = 16028,9805x - 495,6040 r 2 = 0,9999 y [Cr(III)] = 15 145,0922x + 394,5148 r 2 = 0,9999 0 2 4 6 8 10 Stężenie Cr [µg L -1 ]

Precyzja Tabela 2. Precyzja wyznaczona dla wartości stężeń form specjacyjnych arsenu i chromu (10 niezależnych pomiarów) w próbkach wody z dodatkiem wzorca. s RSD CV [%] As(III) 2,09 0,020 0,0096 0,96 As(V) 4,49 0,033 0,0073 0,73 As 1) MMA 1,96 0,031 0,016 1,6 DMA 2,02 0,016 0,0079 0,79 AsB 1,97 0,028 0,014 1,4 Cr 2) Cr(III) 1,98 0,029 0,0149 1,5 Cr(VI) 3,04 0,048 0,0157 1,6 1) Próbka zawierająca As(III) i As(V) o stężeniu równym odpowiednio 0,19 µg L -1 i 2,6 µg L -1 została wzbogacona roztworem wzorcowym zawierającym wszystkie formy specjacyjne arsenu o stężeniu 2 µg L -1. 2) Próbka zawierająca Cr(VI) o stężeniu 1,03 µg L -1 została wzbogacona roztworem wzorcowym zawierającym Cr(III) i Cr(VI) o stężeniu 2 µg L -1.

Granica wykrywalności to stężenie analitu dla którego odpowiedź urządzenia pomiarowego jest znacząco różnią od sygnału pochodzącego od próbki ślepej lub szumów tła

Granica wykrywalności, granica oznaczalności Tabela. Wartości granic wykrywalności [µg L -1 ] oraz granic oznaczalności [µg L -1 ] uzyskanych dla form specjacyjnych chromu i arsenu przy użyciu trzech różnych metod. As Cr As(III) As(V) MMA DMA AsB Cr(III) Cr(VI) Stosunek S/N Metoda regresji liniowej Metoda eksperymentalna LOD 1,0 0,21 0,053 LOQ 3,0 0,63 0,18 LOD 1,0 0,22 0,045 LOQ 3,0 0,66 0,15 LOD 1,0 0,19 0,066 LOQ 3,0 0,57 0,22 LOD 0,5 0,20 0,11 LOQ 1,5 0,60 0,37 LOD 0,5 0,16 0,095 LOQ 1,5 0,48 0,32 LOD 0,3 0,10 0,094 LOQ 0,9 0,30 0,28 LOD 0,3 0,11 0,10 LOQ 0,9 0,33 0,30

Charakterystyka procedur analitycznych rozdzielania i oznaczania form specjacyjnych arsenu i chromu w wodzie techniką HPLC-ICP-MS Parametry procedury analitycznej Wynik pomiaru AsB As(III) DMA MMA As(V) Cr(III) Cr(VI) Czas retencji [min] 1,73 2,06 2,42 4,19 6,26 1,42 1,92 Selektywność 1,3 1,1 5,1 4,6 3,2 Granica wykrywalności* [µg L -1 ] Granica oznaczalności [µg L -1 ] Współczynnik korelacji krzywej kalibracyjnej Zakres krzywej kalibracyjnej [µg L -1 ] Precyzja/czas retencji [%, CV] Precyzja/stężenie [%, CV] 0,053 0,045 0,066 0,11 0,095 0,094 0,10 0,18 0,15 0,22 0,37 0,32 0,28 0,30 0,9997 0,9998 0,9999 0,9998 0,9998 0,9999 0,9999 0,1-10 0,1-10 0,1-10 0,1-10 0,1-10 0,3-10 0,3-10 0,53 0,56 0,68 0,69 0,21 0,67 0,23 2,4 2,01 1,6 0,23 1,56 1,49 1,57 *wartości LOD wyznaczone przy użyciu metody eksperymentalnej

Cechy wyniku pomiaru spójność pomiarowa Tabela 4. Wyniki oznaczania form specjacyjnych arsenu w próbkach wody oraz wartości odzysku uzyskane metodą dodatku wzorca (n=3). Woda1 (przeznaczona do spożycia przez ludzi) Woda2 (woda powierzchniowa) Materiał badawczy As(III) 0,121 ± 0,012 < LOD 0,416 ± 0,040 20,2 ± 1,9** As(V) 0,433 ± 0,017 37,7 ± 1,5* 1,181 ± 0,047 1,813 ± 0,073 Próbka MMA < LOD < LOD 0,281 ± 0,026 < LOD rzeczywista DMA < LOD < LOD < LOD < LOD AsB < LOD < LOD < LOD < LOD As(III) 0,340 ± 0,033 18,4 ± 1,8 1,48 ± 0,14 42 ± 4 As(V) 0,690 ± 0,028 58,4 ± 2,3 2,234 ± 0,089 22,44 ± 0,90 Próbka MMA 0,262 ± 0,024 18,7 ± 1,7 1,26 ± 0,16 19,5 ± 1,8 wzbogacona A DMA 0,262 ± AsB 0,019 97 % 19,5 104 ± 1,4 1,014 ± 0,075 19,6 ± 1,5 AsB 0,251 ± %, 0,034 As(III) 21,3 88 ± % 2,9 109 0,97 ± 0,13 20,8 ± 2,8 As(III) 88 97 107 109 %, DMA 98 % 104 %, As(V) 104 96 105 103 Odzysk [%] MMA MMA 98 % 104 % 104 101 98 98 DMA As(V) 96 % 105%, 104 101 101 98 AsB 100 99 97 104 A Dodatek wzorca wszystkich form specjacyjnych arsenu [μg L -1 ] Woda 1: C wz = 0,25; Woda 2: C wz = 20; Ściek: C wz = 1; Śnieg: C wz = 20 * Próbka 100-krotnie rozcieńczona ** Próbka 4-krotnie rozcieńczona Ścieki Śnieg

Spójność pomiarowa Tabela 3. Wyniki oznaczania form specjacyjnych chromu w próbkach wody oraz wartości odzysku uzyskane metodą dodatku wzorca (n=3). Próbka rzeczywista Próbka wzbogacona B Odzysk [%] Cr(III) Cr(VI) Cr(III) Cr(VI) Cr(III) Cr(VI) Materiał badawczy Woda1 A Woda2 A Woda3 A Woda4 A 0,197 ±0,015 0,135 ± 0,011 < LOD < LOD 0,297 ±0,024 0,552 ±0,044 0,578±0,046 1,032 ±0,082 2,47 ±0,19 2,29 ±0,18 2,05 ±0,16 1,99 ±0,16 2,16 ±0,17 2,67 ±0,21 2,58 ± 0,20 3,05 ±0,24 113,4 107,7 102,7 99,5 93,3 106,1 100,1 100,9 A Materiał badawczy stanowiły próbki wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi, pobrane z czterech miejscowości położonych w zachodniej i północno-zachodniej części Polski B Dodatek wzorca, C wz = 2,0 μg L -1 Cr(III) i Cr(VI)

Podejścia do wyznaczania niepewności pomiaru bottom-up tzw. modelowanie, niepewność wyznaczana jest w sposób jak najbardziej szczegółowy, ten sposób szacowania niepewności szczególnie odnosi się do poszczególnych wyników pomiarów, podejście to wymaga sporo czasu i wysiłku fitness-for-purpose" - podejście opiera się na definicji jednego parametru, który może być wyrażony algebraicznie, podejście to opisuje związek pomiędzy niepewnością i zawartością analitu, sposób jest znacznie łatwiejszy i mniej czasochłonny niż podejście bottom-up szacowanie niepewności na podstawie walidacji - metody te bazują na precyzji, poprawności i rzetelności single-laboratory validation - niepewność wyniku pomiaru uzyskanego przy wykorzystaniu danej procedury analitycznej w jednym laboratorium inter-laboratory validation - niepewność wyniku pomiaru uzyskanego stosując tą samą procedurę w różnych laboratoriach podejści top-down i robustness-based niepewność wyznaczana jest na podstawie precyzji lub odporności, wykorzystuje się dane uzyskane z badań międzylaboratoryjnych P. Konieczka, J. Namieśnik, Quality assurance and quality control in the analytical chemical laboratory, CRC Press, Taylor & Francis Group, 2009

Cechy wyniku pomiaru niepewność pomiaru Diagram Ishikawy identyfikacja źródeł niepewności WZORCOWANIE objętość wzorców masa wzorca POMIAR warunki ICP-MS ODZYSK Szacowanie niepewności według podejścia bottom-up (zgodnie z GUM) rozcieńczenia wzorca czystość wzorców powierzchnia piku powtarzalność powtarzalność temperatura powtarzalność objętość temperatura powierzchnia sygnału analitycznego masa wzorca ph fazy ruchomej STĘŻENIE As(III), As(V), DMA, MMA, AsB [μg L -1 ] objętość fazy ruchomej PRÓBKA czystość wzorców FAZA RUCHOMA Równanie modelowe C = C a wz I p I V wz p f rozc f odz

Cechy wyniku pomiaru niepewność pomiaru 33% 5% 13% 33% AsB 14% MMA 25% 24% 28% 7% 13% DMA 7,4% 22% 31% 6% As(III) 11% 16% 32% 31% 9,6% As(V) 9,2% 4,0% 18% 29% 14% 1% 19% 34% 6% 19% 30% u( powt pom ) u(c wz )/ C wz u(c buf )/C buf u(r) u(kal.)

Cechy wyniku pomiaru niepewność pomiaru Diagram Ishikawy identyfikacja źródeł niepewności V k I kalibr. roz.. kalibr. kalibr. T V p III V 0 V p III 4 V p III 1 V p III 5 V p III 2 V p III 6 V T p III 3 T V f. r. V p III 7 V p II kalibr. STĘŻENIE Cr(VI) WSZYSTKICH ROZT. WZ.; (C wz ) V p III V p I kalibr. T kalibr. liniowość T P czułość M Cr Szacowanie niepewności według podejścia bottom-up (zgodnie z GUM) V k II WSPÓŁCZYNNIK KIERUNKOWY KRZYWEJ; a V k III poprawność metody rozdzielczość selektywność rozdzielanie detekcja chromat. integracja sygnałów chromat. POWIERZCHNIA SYGNAŁU ANALIT. Cr(VI) W PRÓBCE; (I p ) powt. sączenia próbki powt. wskazań instrumentu pomiarowego POWIERZCHNIA SYGNAŁU ANALIT. Cr(VI) WSZYSTKICH ROZT. WZ.; (I wz ) powt. przygotowania roztworów wzorcowych powt. wskazań instrumentu pomiarowego STĘŻENIE Cr(VI) [μg L -1 ]; (C a ) Równanie modelowe

Cechy wyniku pomiaru niepewność pomiaru Cr(III) 1) Cr(VI) 2) 9% 18% 43% 15% 3,6% 8,7% 18% Podejście bottom-up 66% 10% 21% Cr(III) Cr(VI) 38% 7,8% 7,9% 36% Podejście single-laboratory validation 62% 64% 1) Próbka wzbogacona C wzb Cr(III) = 1,99 µg L -1 2) Próbka rzeczywista C rz Cr(VI) = 1,03 µg L -1

WYDZIAŁ CHEMII W październiku 2012 na Wydziale Chemii UAM odbędzie się II edycja Studiów Podyplomowych "Analityka Chemiczna", których program obejmuje ważne zagadnienia z zakresu nowoczesnej analizy chemicznej. Więcej informacji o programie Studiów Podyplomowych Analityka Chemiczna można uzyskać na stronie internetowej: http://www.staff.amu.edu.pl/~depchem/podyplom Osoby zainteresowane prosimy o kontakt. Informacji udzielają: Prof. dr hab. Danuta Barałkiewicz dr Anetta Hanć (Kierownik Studiów) (Informacje i zgłoszenia) e-mail: danutaba@amu.edu.pl e-mail: anettak@amu.edu.pl tel. (61) 8291270 tel. (61) 8291398

WYDZIAŁ CHEMII Tematyka zajęć: Metrologia chemiczna w praktyce Problemy metodyczne technik spektrometrii atomowej: F-AAS, F-AES, HG-AAS, CV-AAS, ET-AAS Zaawansowane metody spektroskopowe: ICP-MS; ICP-OES System do specjacji: HPLC-ICP-MS, system do analizy próbek stałych: LA- ICP-MS Metody chromatograficzne: GC, HPLC Podstawowe i zaawansowane metody statystyczne Wykorzystanie metod chemometrycznych do wizualizacji zbioru danych

Oszacowanie wzrokowe Metoda regresji liniowej Metody wyznaczania LOD Wyznaczenie LOD na podstawie oznaczeń dla próbek ślepych Metoda graficzna Obliczenia na podstawie S/N

Wyznaczenie LOD na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych lub próbek ślepych z dodatkiem analitu y a sygnał analityczny odpowiadający wartości LOD y 0 średni sygnał analityczny uzyskany dla próbki ślepej s y0 odchylenie standardowe dla próbki ślepej k współczynnik, którego wartość jest zależna od zastosowanego poziomu ufności x śr wartość średnia wyrażona w jednostce stężenia lub ilości odchylenie standardowe dla próbki z niewielką ilością analitu, blisko spodziewanej wartości LOD M. D. Fernández-Ramos & L. Cuadros-Rodríguez & E. Arroyo-Guerrero & L. F. Capitán-Vallvey An IUPAC-based approach to estimate the detection limit in co-extraction-based optical sensors for anions with sigmoidal response calibration curves, Anal Bioanal Chem (2011) 401:2881 2889

Obliczenie LOD na podstawie S/N Wyznaczenie wartości stosunku sygnału do szumu dla próbki ślepej (jeśli jest to możliwe) lub próbki z niewielką zawartością analitu. S/N między 3:1 a 2:1 jest powszechnie uznawany za dopuszczalne oszacowanie wartości LOD. W przypadku metod chromatograficznych: Rysunek 1. Graficzne przedstawienie parametrów h oraz H z 1-α wartość odczytana z tablicy rozkładu normalnego dla określonego poziomu istotności α h noise - ½ h R współczynnik odpowiedzi (stężenie/wysokość sygnału analitycznego) International Conference on Harmonisarion of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), Validation of analitycalprocedures: text and methodology Q2 (R1), 2005 European Pharmacopoeia R. Boque, Y.V. Heyden, The Limit of Detection, LC GC Europe, 2009

Metoda regresji liniowej b współczynnik kierunkowy krzywej kalibracyjnej, s odchylenie standardowe. Odchylenie standardowe można obliczyć na trzy sposoby: odchylenie standardowe uzyskane dla próbek ślepych s, resztkowe odchylenie standardowe krzywej kalibracyjnej s xy, odchylenie standardowe wyrazu wolnego krzywej kalibracyjnej s a y i wartość wyznaczona doświadczalnie, Y i wartość obliczona na podstawie równania regresji, n liczba niezależnych oznaczeń, na podstawie których wykonano krzywą kalibracyjną x i zawartość oznaczanego analitu P. Konieczka, J. Namieśnik, Quality Assurance nad Quality Control in the Analitycal Chemical Laboratory. A practical Approach, Taylor & Francis Group, Bocca Raton 2009 International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, ICH Q2(R1) 2005