Streszczenie Celem niniejszej pracy badawczej było dokonanie analizy aktywności proteolitycznej soków z Ananas comosus oraz Actinidia deliciosa cv. Hayward oraz wpływu temperatur na aktywność enzymatyczną zawartych w nich proteaz, bromelainy owocowej i aktynidyny, znajdujących się odpowiednio w soku z Ananas comosus oraz z Actinidia deliciosa cv. Hayward, a także porównanie temperatur, w jakich zachodzi ich inaktywacja termiczna. Jako materiału do trawienia enzymami, zawartymi w wymienionych sokach, wybrałem spożywczą żelatynę wieprzową. Przeznaczone do badań owoce, dziewięć A. deliciosa i trzy A. comosus, zostały kupione dzień przed rozpoczęciem badań. Badania laboratoryjne przeprowadziłem w laboratorium Katedry Biologii Molekularnej i Komórkowej na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii UG GUMed w Gdańsku. Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały, że: 1. Aktynidyna w soku z A. deliciosa, niepoddanym żadnej obróbce termicznej, a także po inkubacji w temperaturze 40 C, trwającej odpowiednio 2,5 i 5 minut oraz w temperaturze 50 C, trwającej 2,5 minuty, wykazuje wyższe tempo trawienia żelatyny niż bromelaina w soku z A. comosus. 2. Inaktywacja termiczna enzymów, zawartych w sokach z A. comosus i A. deliciosa, zależy zarówno od temperatury inkubacji jak i czasu jej trwania. 3. Proteazy zawarte w soku A. comosus wykazują większą odporność na wysoką temperaturę niż te zawarte w soku A. deliciosa po pięciominutowej inkubacji traciły one aktywność w przedziałach temperatur odpowiednio w próbce z A. comosus: 74 76 C i z A. delciosa: 66-68 C. 4. W przypadku inkubacji trwającej dwie i pół minuty temperatura inaktywacji zawartych w nich enzymów wynosi dla obu soków powyżej 90 C. Wstęp Proteazami, jakie znajdowały się w sokach, były bromelaina owocowa (EC 3.4.22.33), obecna w A. comosus oraz aktynidyna (EC 3.4.22.14), która znajduje się w A. deliciosa. Oba te enzymy należą do grupy proteaz cysteinowych, czyli zdolnych do hydrolizy wiązania peptydowego w łańcuchu polipeptydowym za aminokwasem cysteiną. Bromelaina owocowa pochodzi z owocostanu A. comosus i jest białkiem o masie 23 kda. Oprócz niej w łodydze tej rośliny występują także inne protezy: ananaina (EC 3.4.22.31), komosaina i bromelaina łodygowa (EC 3.4.22.32), która od badanej przeze mnie bromelainy owocowej odróżnia się masą wynoszącą 23,8 kda, obecnością łańcucha cukrowego oraz wartością punktu izoelektrycznego (powyżej 10 w przypadku łodygowej oraz 4,6 w przypadku owocowej). Bromelainą nazywamy także ekstrakt z niedojrzałych owocostanów A. comosus, w którego skład wchodzą wymienione wcześniej enzymy. Znalazł on zastosowanie w medycynie, w której używany jest do leczenia m. in. stanów zapalnych i chorób związanych z krzepnięciem krwi. [2] Aktynidyna natomiast jest proteazą pochodzącą z owoców A. deliciosa i A. chinensis oraz ich mieszańców. To enzym o masie około 30kDa i punkcie izoelektrycznym leżącym w przedziale 3,5 4. Jest ona jednym z białek, które wywołuje reakcję alergiczną na owoce A. chinensis i A. deliciosa. [3, 4, 5] Dzięki zdolnościom do trawienia włókien kolagenowych zarówno bromelaina jak i aktynidyna używane są jako zmiękczacze do mięsa. Trawienie białek, będących materiałem zapasowym w nasionach, aktywacja proenzymów i degradacja nieprawidłowych białek to funkcje, jaką pełnią wymienione protezy, a także inne proteazy cysteinowe pochodzenia roślinnego, jak na przykład papaina (EC 3.4.22.2) i ficyna (EC 3.4.22.3). [1, 4] Moje badania, mające na celu porównanie aktywności proteaz w sokach z obu owoców oraz temperatury ich inaktywacji termicznej wykazały, że różnią się one pod
względem aktywności proteolitycznej oraz temperatury, w jakiej zachodzi ich inaktywacja termiczna. Materiały i metody W doświadczeniach wykorzystano dziewięć owoców A. deliciosa oraz trzy owocostany A. comosus. Owoce A. deliciosa pochodziły z jednej dostawy od jednego producenta - ZESPRI International Limited, dzięki czemu wszystkie były w bardzo podobnym stopniu dojrzałe. Z kolei niemożliwym było kupno trzech owocostanów A. comosus, z jednego źródła i mających podobny stopień dojrzałości, dlatego też zostały kupione od trzech różnych producentów, lecz w podobnym stopniu dojrzałe. Gatunki te zostały wybrane ze względu na ich dużą dostępność w sklepach w porównaniu z innymi owocami, zawierającymi proteazy cysteinowe. Sok z A. comosus uzyskiwany był po zmiksowaniu fragmentu owocostanu w kształcie klina, wyciętego z całej jego długości o masie ok. 100g i przeciśniętego przez warstwę ręcznika papierowego i warstwę gazy. Z kolei homogenat A. deliciosa o masie 95 do 100g przeciśnięto przez warstwę papierowego ręcznika i trzy warstwy gazy. Soki były wyciskane codziennie rano na trzy do czterech godzin przed rozpoczęciem badań. W laboratorium, aby pozbyć się znajdujących się w soku resztek owoców, był on wirowany przez 10 minut w 5000rpm i w temperaturze 22 C, co pozwoliło uzyskać klarowny supernatant, pozbawiony dużych elementów komórkowych. Następnie rozlewany był on w ilości 1,5 ml do probówek Eppendorfa. Probówki były potem inkubowane przez czas dwóch i pół lub pięciu minut przy 300 rpm w temperaturach, które znajdują się na wykresach w części Wyniki. Próbki kontrolne nie były poddawane żadnej obróbce termicznej. Galareta, którą przygotowano z użyciem wody destylowanej do określenia tempa trawienia, to 1% roztwór żelatyny spożywczej wieprzowej firmy Dr. Oetker. Został on wylany do probówek o d=12mm, po czym odstawiony na noc do lodówki, gdzie przebywał w temperaturze 4 C. Trawienie żelatyny enzymami, zawartymi w sokach badanych owoców, odbywało się w temperaturze 22 C. Aby określić szybkość trawienia żelatyny przez enzymy proteolityczne na powierzchnię stężałej galarety pipetą pasteurowską wylewano po 1,5ml soku, po czym zaznaczano granicę sok/galareta na probówce. Po godzinie Porównanie nieodwirowanego soku z A. comosus (po prawej) z sokiem poddanym wirowaniu (po lewej). Fot. Autora sprawdzano linijką różnicę między pierwotnym a obecnym położeniem granicy sok/galareta. W przypadku, gdy po godzinie niewidoczne były jakiekolwiek zmiany poziomu granicy sok/galareta, odczekiwano dodatkową godzinę, po której ponownie sprawdzano jej położenie. Po tym czasie brak jakichkolwiek zmian uznawany był za równoznaczny z denaturacją enzymu. Następnie, przy pomocy różnicy poziomu granicy sok/galareta(wyrażonej w milimetrach), obliczano masę strawionej żelatyny. Do wszystkich obliczeń przyjęto π=3,1415, obliczenia wykonywane były w programie MS Excel. Dodatkowo, jako błąd pomiaru przyjęto 0,5 mm, który, po przeliczeniu na masę żelatyny, został uwzględniony, w formie słupków błędu, na wykresach w części Wyniki.
Wyniki Wykres 1 Wykres 2 Jak wynika z powyższych wykresów wraz ze wzrostem temperatury inkubacji soków z obu owoców spada prędkość, z jaką zawarte w nich proteazy trawią żelatynę. Po inkubacji, trwającej 5 minut, jako temperaturę inaktywacji proteaz zawartych w sokach można wyznaczyć przedział 70 80 C dla A. comosus i 60 70 C dla A. deliciosa. W przypadku inkubacji, trwającej 2,5 minuty, temperatura ta dla obu owoców wynosi ponad 90 C. Warto zauważyć, że w temperaturach 22 40 C i 22 50 C - odpowiednio dla wykresu 1 i 2 - prędkość trawienia prawie się nie zmienia. Na uwagę zasługuje fakt, że choć sok
z A. deliciosa początkowo wykazuje większą aktywność enzymatyczną w porównaniu z sokiem z A. comosus, to w wyższych temperaturach spada ona gwałtowniej. Następne dwa wykresy obrazują szczegółowiej zależność spadku aktywności enzymatycznej od temperatury, której przedziały wyznaczone zostały na podstawie doświadczenia zilustrowanego wykresem 1. Wykres 3 Wykres 4 Powyższe wykresy obrazują przybliżoną temperaturę inaktywacji proteaz zawartych w użytych sokach. Jak z nich wynika, są to, przy inkubacji trwającej 5 minut, przedziały temperatur 74 76 C dla A. comosus i 66 68 C dla A. deliciosa, przy czym w przypadku tego drugiego temperatura może być nieznacznie niższa (mniej niż 1 C).
Dyskusja Uzyskane przeze mnie wyniki pokazują, że stopień inaktywacji termicznej badanych enzymów proteolitycznych zależy zarówno od temperatury jaki i czasu inkubacji. Wraz ze wzrostem temperatury rośnie także stopień inaktywacji enzymów, zawartych w sokach z A. comosus i A. deliciosa. Na wykresach, znajdujących się w części Wyniki, odzwierciedlone jest to poprzez mniejszą prędkość trawienia żelatyny w odpowiednich temperaturach. Taki sam wpływ na aktywność badanych enzymów ma długość inkubacji. Wraz z jej wzrostem spada aktywność proteaz, zawartych w sokach, a będących przedmiotami moich badań. W przypadku soków niepoddanych żadnej obróbce termicznej, a także tych inkubowanych w niższych temperaturach (patrz: wykresy 1 i 2), aktywność proteolityczna soku z A. deliciosa jest większa niż soku z A. comosus. Następnie, w przypadku soku z A. deliciosa, gwałtownie spada i utrzymuje się na poziomie niższym niż w przypadku soku z A. comosus ( co ilustrują wykresy 1 i 2). Głównym wynikiem moich badań są temperatury, w jakich protezy, zawarte w sokach z A. deliciosa i A. comosus, ulegają, na skutek denaturacji, inaktywacji termicznej. Pierwsza seria Struktura aktynidyny (źródło: http://en.wikipedia.org/wiki/file:actin idain_1aec.png ; grafika zamieszczona na zasadach domeny publicznej) doświadczeń (ilustrowana przez wykres 1) umożliwiła określenie przybliżonego zakresu temperatur, w jakich zachodzi denaturacja badanych enzymów przy inkubacji trwającej 5 minut. Dla soku z A. comosus przedział ten przyjął wartości od 70 do 80 C, a dla soku z A. deliciosa - 60 do 70 C. Kolejna seria doświadczeń posłużyła do wyznaczenia dokładniejszych zakresów temperatur, w jakich dochodzi do inaktywacji termicznej proteaz, zawartych w badanych sokach (ilustrują to wykresy 3 i 4). Odniosłem się do wyników z serii ilustrowanej przez wykres 1. Jak pokazały doświadczenia, temperatura, w której, przy pięciominutowej inkubacji, zachodzi całkowita inaktywacja termiczna proteaz zawartych w soku z A. comosus, leży w przedziale od 74 do 76 C. Z kolei przy takim samym czasie trwania inkubacji proteazy w soku z A. deliciosa uległy denaturacji w temperaturach mieszczących się w przedziale od 66 do 68 C. Temperatura ta może jednak być nieznacznie niższa. Przypuszczenie to oparte jest na wykresie 4, na którym, przy temperaturze 66 C, pasek błędu dotyka osi x wykresu, co może oznaczać, że inaktywacja enzymów w badanym soku zaszła w niższej, lecz nie więcej niż o 2 C temperaturze. Przypuszczenie to oparte jest na przyjętym przeze mnie błędzie pomiaru (patrz: Materiały i metody ), a nie na wynikach moich badań. Wykres 2 przedstawia ostatnią serię doświadczeń. Zestawienie z wynikami wykresu 1 umożliwiło określenie wpływu czasu inkubacji na stopień inaktywacji proteaz zawartych w sokach badanych owoców. Z tych doświadczeń wynika, że w przypadku inkubacji trwającej 2,5 minuty temperatura inaktywacji dla obu enzymów wynosi powyżej 90 C. Znajomość temperatury, w jakiej zachodzi inaktywacja termiczna enzymów, ma bardzo duże znaczenie, szczególnie w przypadku badanej przeze mnie bromelainy. Spowodowane jest to tym, że lecznicze właściwości A. comosus są związane głównie
z aktywnością proteolityczną tego enzymu [6]. Jak pokazują wyniki moich badań, nawet krótkie przebywanie w wysokiej temperaturze jest w stanie doprowadzić do częściowej lub całkowitej utraty aktywności przez enzym. Skutkiem tego jest kompletny brak aktywności proteolitycznej we wszystkich przetworzonych produktach zawierających A. comosus. Przez co tracą one, w dużej części, właściwości lecznicze w porównaniu z nieprzetworzonymi owocostanami. Z drugiej strony, znając temperaturę, jaka potrzebna jest, by enzym uległ inaktywacji, możliwym jest wykorzystanie tego w przemyśle spożywczym do produkcji nowych potraw. Znajomość tych temperatur umożliwia takie przetworzenie owoców i soków, aby zawarte w nich proteazy utraciły aktywność, lecz tak, by nie miało to wpływu na ich walory smakowe. Może to pozwolić na łączenie składników w sposób, który wcześniej był niemożliwy. Pozwoli to na przykład na wytworzenie galaretki o smaku A. comosus czy A. deliciosa bez potrzeby stosowania sztucznych aromatów i substancji smakowych. Nie mam niestety możliwości porównania wyników swoich doświadczeń z innymi pracami badawczymi. W przypadku proteaz w A. comosus jest to spowodowane używaniem przez innych naukowców różnych metod [6], a w przypadku A. deliciosa brakiem ogólnodostępnych prac badawczych, dotyczących inaktywacji termicznej zawartej w nim proteazy. Piśmiennictwo 1. Dubey V. K. et. al. (2007) Papain-like proteases: Applications of their inhibitors 2. Maurer H.R. (2001) Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use 3. Miraghaee S. S. et. al. (2011) Investigation of Protein Pattern in Kiwifruit (Actinidia deliciosa) 4. Pastorello E. A. et. al. (1998) Identification of actinidin as the major allergen of kiwi fruit 5. Podivinsky E. (1991) Molecular Studies on Actinidin, A Cysteine Protease from Kiwifruit 6. Rungtip J., Charoenrein S. (2010) Effect of Temperature on the Stability of Fruit Bromelain from Smooth Cayenne Pineapple 7. Wiederanders B. (2003) Structure-function relationships in class CA1 cysteine peptidase propeptides