Genetyczno-hodowlane aspekty wykorzystania cytoplazmy CMS-C w hodowli mieszańców żyta ozimego Sprawozdanie z prac wykonanych w 200 roku w ramach badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego realizowanych i finansowanych na podstawie decyzji MRiRW Opis realizowanego projektu W hodowli żyta ozimego od przeszło dwudziestu lat istotną rolę odgrywają odmiany mieszańcowe, które przyczyniły się w tym okresie do znaczącego wzrostu potencjału plonowania tego zboża. Duża popularność odmian mieszańcowych żyta w Niemczech i przypuszczalne coraz szersze ich rozpowszechnienie w Polsce, które następować będzie wraz z unowocześnianiem polskiego rolnictwa, może w dającej się przewidzieć przyszłości doprowadzić do ujednolicenia plazmotypowego zasiewów żyta na dużym obszarze. Jednorodność plazmotypowa, tak jak każde ograniczenie zróżnicowania genetycznego w populacjach roślin uprawnych, może rodzić zagrożenia dobrze znane chociażby z historii uprawy mieszańców kukurydzy w Stanach Zjednoczonych. Stąd też od wielu lat zarówno w Niemczech, jak i w Polsce postulowane jest wprowadzenie do uprawy odmian mieszańcowych posiadających alternatywny typ cytoplazmy sterylizującej. Jednym z takich potencjalnych źródeł CMS możliwym do zastosowania w hodowli jest cytoplazma C. Celem realizowanych badań jest opracowanie bazy teoretycznej pozwalającej na szersze niż dotąd wykorzystanie cytoplazmy CMS-C w hodowli odmian mieszańcowych żyta ze szczególnym uwzględnieniem aspektów mających bezpośrednie znaczenie w pracach hodowlanych. Zatwierdzony harmonogram na rok 200 przewidywał wykonanie prac badawczych w ramach następujących długookresowych zadań: Zadanie. Określenie stabilności męskiej sterylności warunkowanej przez cytoplazmę C w różnych środowiskach. Zadanie 2. Określenie frekwencji alleli męskiej sterylności dla CMS-C w polskich populacjach żyta. Zadanie 3. Ocena efektu heterozji u mieszańców żyta z cytoplazmą C.
Zadanie 4. Ocena przydatności dla hodowli markerów molekularnych sprzężonych z głównym locus kontrolującym płodność w cytoplazmie C. Zadanie 5. - Identyfikacja polimorfizmu mutacji punktowych (markery SNP i PCR-RFLP) w obrębie markerów blisko sprzężonych z genem Rfc. Realizacja planowanych zamierzeń Zadanie. Określenie stabilności męskiej sterylności warunkowanej przez cytoplazmę C w różnych środowiskach. Dziewięć mieszańców pojedynczych pomiędzy męskosterylnymi liniami z cytoplazmą C, a płodnymi liniami wsobnymi (dopełniającymi i restorerowymi) ocenionych zostało pod względem męskiej sterylności w dwóch miejscowościach: w Choryni i w Szczecinie, w warunkach polowych i w szklarni. Spośród testowanych mieszańców pięć było rezultatem krzyżowań linii męskosterylnych z liniami dopełniającymi. Pozostałe mieszańce uzyskano po zapyleniu form męskosterylnych pyłkiem restorerów, wśród których dwa wyróżniały się we wcześniejszych badaniach wysoką efektywnością (Ot0-20, L), a dwa miały charakter słabych restorerów (620/75--5, 5527LM). Od 0 do 40 nasion każdego z mieszańców wysiano punktowo w czterech wyżej wymienionych punktach doświadczalnych traktowanych jako odrębne środowiska. Każda z roślin oceniona została wzrokowo pod kątem płodności pręcikowia przy zastosowaniu skali bonitacyjnej opracowanej przez Geigera i Morgensterna (975). Dodatkowo, w celu zweryfikowania poprawności oceny wzrokowej, w Szczecinie oceniano również liczbę zawiązanych ziaren w kłosach pod izolatorami. Zgodnie z przewidywaniami, u wszystkich pięciu badanych mieszańców pomiędzy formami męskosterylnymi, a liniami dopełniającymi dominowały rośliny niewytwarzające pyłku. U mieszańców tych pojawiały się jednak sporadycznie rośliny częściowopłodne oraz w pełni męskopłodne (tab.-3). Największy odsetek męskosterylnych roślin F uzyskiwano przy krzyżowaniach pomiędzy liniami siostrzanymi: [585/92--2(C) x 585/92-6-]F, [404/03-3-4- -2(C) x 404/03-66-2-2--5] F i [405/03-50--2-3(C) x 405/03---2--2]F oraz u mieszańca, gdzie rolę zapylacza pełniła linia 54-6 (tab.3). Mieszańce z udziłem linii Ot0-20 były w 00% płodne (tab. -3). W przypadku mieszańców z dwoma restorerami - L oraz 5527LM w roli zapylaczy, obserwowano sytuację odwrotną w porównaniu z dopełniaczami: wśród przeważającej grupy roślin silnie pylących znajdowano pojedyncze rośliny męskosterylne. Linia L była we wczesniejszych badaniach definiowana jako skuteczny restorer, skuteczność linii 5527LM w przywracaniu płodności budziła już wcześniej poważne wątpliwości. Obserwowane męskosterylne rośliny F stanowiły niespełna 5% 2
spośród badanych pojedynków każdego mieszańca (z uwzględnieniem danych ze wszystkich czterech lokalizacji). Pojawianie się pojedynczych w pełni płodnych roślin w męskosterylnym mieszańcu i odwrotnie pojedynczych roślin męskosterylnych w mieszańcu męskopłodnym raczej nie ma związku z wpływem środowiska na ocenianą cechę, ale przypuszczalnie wynika z braku pełnej homogeniczności analizowanych materiałów. Część z linii użytych do wytworzenia mieszańców jest stosunkowo słabo zaawansowana w chowie wsobnym, stąd może się tu pojawiać problem braku pełnej homozygotyczności krzyżowanych genotypów. Nie można też wykluczyć pewnych błędów technicznych w procesie krzyżowania lub przygotowywania nasion do siewu. Poza wynikami budzącymi wątpliwości z wyżej podanych powodów, należy zwrócić uwagę, że u mieszańca [585/92--2(C) x 585/92-6-]F w doświadczeniu założonym w Szczecinie pojawiły się rośliny o słabych objawach płodności, które zostały wykryte dopiero przy ocenie zawiązywania ziaren pod izolatorami (tab.3). W ocenie wzrokowej pylenia roślin wydawało się, że wszystkie rośliny są sterylne (tab.), ale kilka spośród nich zawiązało pojedyncze ziarniaki pod izolatorami (tab.2). W przypadku pozostałych badanych mieszańców zgodność oceny wzrokowej i obserwacje zawiązywania ziaren pod izloatorami były wysoce zgodne, chociaż różnice dotyczące pojedynczych roślin tam również się pojawiały (tab.3). Największą zmienność pod względem oceny fenotypowej przeprowadzonej w różnych środowiskach zaobserwowano u mieszańca [425/00-44(C) x 620/75--5]F, który charakteryzował się znacznym odsetkiem form męskosterylnych oraz przeważnie słabymi objawami płodności u pozostałych roślin. W przypadku tego mieszańca obserwowano najwięcej rozbieżności między oceną wzrokową i osadzaniem ziarna (tab.3), przy czym były to rozbieżności w obu kierunkach: zdarzało się, podobnie jak u mieszańca [585/92--2(C) x 585/92-6-]F, że rośliny wizualnie męskosterylne zawiązywały niewielkie ilości ziaren, ale również rośliny, które były źródłem pyłku widocznego przy obserwacjach wzrokowych nie osadzały ani jednego ziarniaka pod izlolatorami. Z dostępnych danych literaturowych wiadomo, że w przypadku cytoplazmy Pampa znaczenie środowiska było szczególnie duże przy genotypach z częściowo przywróconą płodnością. Wyniki uzyskane w bieżącym roku w badaniach nad cytoplazmą C są zgodne z tymi obserwacjami. Największa uwarunkowana środowiskiem zmienność fenotypowa występowała u mieszańców, u których forma ojcowska była nie w pełni skutecznym 3
restorerem. Wyraźnie też widać, że w przypadku źródła CMS-C bardzo ważne jest dokładne testowanie w różnych środowiskach mieszańców między liniami męskosterylnymi a dopełniaczami. Teoretycznie powinny one być męskojałowe, ale w niektórych kombinacjach krzyżowania, przy sprzyjających warunkach środowiska może dochodzić do wykształcenia niewielkich ilości pyłku. Czasami poziom pylenia jest na tyle słaby, że przy rutynowej ocenie wzrokowej uchodzi on uwadze obserwatora. Pomimo, że zgodność oceny wzrokowej z późniejszym zawiązywaniem ziarna pod izolatorami jest bardzo wysoka, to jednak rezultaty niniejszego doświadczenia wskazują na zasadność przynajmniej wyrywkowego weryfikowania rezultatów oceny wzrokowej przez zastosowanie bardziej pracochłonnej, ale dokładniejszej metody oceny zawiązywania ziaren pod izolatorami. 4
Tabela Ocena objawów męskiej sterylności (w skali Geigera i Morgensterna) u roślin dziewięciu mieszańców F wysianych w różnych środowiskach Choryń Szczecin Mieszaniec Szklarnia Pole Szklarnia Pole średnia minmax liczba roślin średnia minmax liczba roślin średnia minmax liczba roślin średnia minmax liczba roślin 585/92--2(C) x 7,00 7-7 2 3,37-9 27 2,6 2-3 23 2,74 2-3 34 585/92-6- 585/92--2(C) x 8,00 5-9 4 8,56 3-9 27 8,58 3-9 24 8,38 7-9 29 5527LM 585/92--2(C) x Ot0-20 9,00 9-9 3 8,95 7-9 37 8,77 4-9 22 9,00 9-9 28 425/00-44(C) x 3,20 2-5 5 3,00-5 26 3,76 3-8 2 4,6 3-6 3 620/75--5 425/00-44(C) x L 9,00 9-9 4 8,74 3-9 3 6,92 3-9 26 7,94 3-9 32 425/00-44(C) x 54-6 2,7-3 6 2,09-9 23 2,96 2-3 25 2,96 2-9 27 403/03-8-2-2-3(C) x 5,57 3-9 7 2,93-9 28 4,57 2-9 28 3,6 2-9 32 402/03-4-3-2--4 404/03-3-4--2(C) x 2,83 2-3 6 2,83-3 35 3, 3-6 27 3,27 2-9 33 404/03-66-2-2--5 405/03-50--2-3(C) x 405/03---2--2 2,50-3 6 4,3-9 6 2,74 2-3 9 3,2 2-8 29 5
Tabela 2 Ocena zawiązywania ziarna pod izolatorami u roślin dziewięciu mieszańców F wysianych w Szczecinie Szklarnia Pole Mieszaniec średnia min-max średnia min-max 585/92--2(C) x 585/92-6- 0,20% 0-5% 0,49% 0-6% 585/92--2(C) x 5527LM 68,0% 0-92% 84,58% 46-00% 585/92--2(C) x Ot0-20 76,00% 5-94% 74,67% 40-96% 425/00-44(C) x 620/75--5 2,60% 0-38% 22,38% 0-76% 425/00-44(C) x L 58,90% 0-00% 83,99% 0-00% 425/00-44(C) x 54-6 0,00% 0-0% 3,48% 0-00% 403/03-8-2-2-3(C) x 402/03-4-3-2--4 28,00% 0-00% 2,36% 0-00% 404/03-3-4--2(C) x 404/03-66-2-2--5 2,0% 0-57% 7,59% 0-90% 405/03-50--2-3(C) x 405/03---2--2 0,00% 0-0% 5,28% 0-92% Tabela 3 Odsetek roślin sterylnych (-3 w skali Geigera i Morgensterna) u badanych mieszańców F Mieszaniec Choryń Szczecin ) Ogółem Szklarnia Pole Szklarnia Pole 585/92--2(C) x 585/92-6- 0 93 00 (96) 00 (97) 95,35 585/92--2(C) x 5527LM 0 4 4 (4) 0 (0) 2,38 585/92--2(C) x Ot0-20 0 0 0 (0) 0 (0) 0,00 425/00-44(C) x 620/75--5 80 93 43 (82) 9 (39) 52,38 425/00-44(C) x L 0 3 4 () 3 (6) 3,23 425/00-44(C) x 54-6 00 96 00 (00) 93 (94) 96,30 403/03-8-2-2-3(C) x 402/03-4-3-2--4 57 86 68 (68) 84 (78) 77,89 404/03-3-4--2(C) x 404/03-66-2-2--5 00 00 96 (96) 88 (88) 95,05 405/03-50--2-3(C) x 405/03---2--2 00 69 00 (00) 83 (86) 85,7 ) w zawiasach podano odsetek roślin, które nie zawiązały ziaren pod izolatorami Zadanie 2. Określenie frekwencji alleli męskiej sterylności dla CMS-C w polskich populacjach żyta. Mieszańce między męskosterynym źródłem cytoplazmy C jako formą mateczną a dwunastoma populacjami żyta uprawnego zostały w sezonie 2009/0 wysiane punktowo (w rozstawie 20 x 25 cm) na terenie Hali Wegetacyjnej Zachodniopomorskiego Uniwerytetu Technologicznego w Szczecinie. Nasiona do siewu pochodziły z izolowanych przestrzennie szkółek top-crossowych założonych w poprzednim sezonie wegetacyjnym w ramach współpracy z Hodowla Roślin Danko Sp. z o.o. oraz z namiotów płóciennych założonych 6
przed kwitnieniem na poletka rozmnożeniowe w Szczecinie. Wśród badanych populacji osiem stanowiły rody hodowlane oznaczone jako LAD, LAD2, Szk.2, Szk.4, Szk.62, Szk.73, Szk.82 i Szk.83, a cztery pozostałe to zarejestrowane odmiany populacyjne żyta: Dańkowskie Diament, Dańkowskie Nowe, Kier i Walet. Każda z wysianych punktowo roślin dwunastu badanych mieszańców F oceniana była wzrokowo pod kątem płodności pręcikowia przy zastosowaniu 9-stopniowej skali Geigera i Morgensterna (975). Ogółem oceniono 848 pojedynków (tab.4). Udział roślin męskosterylnych w mieszańcach pochodzących z zapylenia populacjami LAD2 i Szk.82 nie przekraczał 5%. Większość badanych populacji (LAD, Szk.2, Szk.4, Szk.62, Szk.73, Szk.83, Dańkowskie Diament, Dańkowskie Nowe i Walet) dawała mieszańce, u których udział roślin męskosterylnych mieścił się w granicach od 5 do 5%. W związku z założeniem, że wśród roślin danej populacji posiadających allele sterylności tylko część można byłoby zaliczyć do kategorii genotypów w pełni dopełniających (tj. dających stabilne efekty fenotypowe w różnych warunkach środowiska), zaobserwowany odsetek roślin męskosterylnych daje niewielkie nadzieje na znajdowanie w tych populacjach genotypów skutecznie dopełniających męską sterylność. Z drugiej strony, udział roślin męskosterylnych u tych dziewięciu mieszańców jest na tyle znaczący, że znalezienie w każdej z trzech wyżej wymienionych populacji dobrych dopełniaczy wydaje się co prawda trudne, ale w pełni wykonalne. Ostatnia populacja objęta badaniami w 200 roku - odmiana Kier, charakteryzowała się wyraźnie wyższą frekwencją alleli sterylności. Co prawda przebadano tu zaledwie 79 roślin F, ale ponad 25% spośród nich wykazywało pełne objawy sterylności pylników (tab.4). Pozwala to wstępnie wysunąć przypuszczenie, że częstotliwość występowania form dopełniających w polskich populacjach żyta uprawnego jest niska, ale może być zróżnicowana w zależności od pochodzenia danego materiału hodowlanego. 7
Tabela 4 Płodność mieszańców między męskosterylnym źródłem CMS-C a hodowlanymi populacjami żyta ozimego (liczebność roślin w poszczególnych klasach fenotypowych). Populacja Męskosterylne Częściowo płodne Męskopłodne Suma 2 3 4 5 6 7 8 9 D.Diament 0 6 4 2 2 3 97 26 D.Nowe 0 2 7 8 2 4 7 27 78 Kier 0 3 8 6 2 3 3 3 4 79 LAD 0 0 2 7 3 0 6 02 3 LAD2 0 0 8 7 3 7 88 25 Szk.2 2 7 4 3 3 4 0 36 70 Szk.4 0 0 8 4 4 2 0 0 49 Szk.62 0 2 6 4 6 4 9 05 47 Szk.73 2 20 6 2 0 0 22 64 Szk.82 0 0 6 3 3 2 9 2 36 Szk.83 0 7 3 5 3 0 4 57 200 Walet 0 0 0 3 2 3 2 2 2 53 Ogółem 4 65 57 3 26 26 0 48 848 Weryfikacja tych przypuszczeń wymaga jednak rozszerzenia badań o kolejne populacje. W tym celu, w ramach realizowanych w 200 roku badań założono cztery izolowane przestrzennie szkółki top-crossowe w obrębie których doszło do panmiktycznych przekrzyżowań pomiędzy męskosterylnymi roślinami z cytoplazmą C, a populacjami żyta ozimego. Uzyskane nasiona czterech mieszańców wysiano punktowo jesienią 200 (po 00-250 ziaren z każdej kombinacji) w celu przeprowadzenia oceny płodności roślin w kolejnym sezonie wegetacyjnym. Jesienią 200 roku założono też w stacjach Hodowli Roślin Danko kolejne izolowane szkółki top-crossowe w celu przeprowadzenia następnej serii krzyżowań. Zadanie 3. Ocena efektu heterozji u mieszańców żyta z cytoplazmą C. Z uwagi na słabe zawiązywanie ziaren w szkółce top-crossowej w roku 2009, doświadczenia pozwalające wstępnie oszacować ogólną zdolność kombinacyjną przeprowadzono dla zaledwie trzech męskosterylnych linii z cytoplazmą C. Mieszaniec pomiędzy jedną z linii, a odmianą Walet jako testerem oceniony został w jednopowtórzeniowym doświadczeniu założonym w czterech miejscowościach (Choryń, Nagradowice, Wierzenica, Laski) metodą wzorcową na poletkach o powierzchni 5m 2. W celach porównawczych w doświadczeniu ocenianych było (poza mieszańcem z cytoplazmą C) 35 mieszańców z cytoplazmą Pampa (odmiana Brasetto oraz 34 mieszańce eksperymentalne). Jako wzorzec systematyczny wysiano odmianę Minello F umieszczoną co szóste poletko. 8
W drugim doświadczeniu oceniono ogólną zdolność kombinacyjną pozostałych dwóch linii. Jako materiał porównawczy wysiano 34 mieszańce eksperymentalne z cytoplazmą Pampa. Doświadczenie drugie założono w układzie podobnym do pierwszego, ze wzorcem systematycznym Minello F, w dwóch miejscowościach (Choryń, Nagradowice). Uzyskane wyniki oceny poziomu plonowania badanych mieszańców z cytoplazmą C były zróżnicowane w poszczególnych miejscowościach. Mieszaniec z udziałem linii 455/05-2-4-2(C) oceniany w czterech miejscowościach najsłabiej plonował w doświadczeniu założonym w Choryni (72,9% wzorca), a najlepiej w Nagradowicach, gdzie zaobserwowany poziom plonowania nieznacznie przewyższał pułap odmiany wzorcowej (02,4%). Ogólnie jednak, mieszaniec między linią 455/05-2-4-2(C), a odmianą Walet jako testerem, należał do słabiej plonujących. Wśród 36 badanych mieszańców znajdował się na 30-tej pozycji ze średnim plonem w wysokości 63,35dt/ha (tab.5), co stanowiło niespełna 89% plonowania wzorcowej odmiany Minello F. Pod względem pozostałych cech rolniczych (tab.5) można zauważyć, że mieszaniec z udziałem linii 455/05-2-4-2(C) był stosunkowo wczesny, charakteryzował się przeciętnym poziomem odporności na mączniaka, dość dużą podatnością na rdzę brunatną i wyleganie (szczególnie pod koniec wegetacji dane z oceny obu tych cech w drugim terminie nie zostały ujęte w tabeli 5), oraz względnie dużą wysokością roślin. Jednocześnie warto zauważyć, że przy porównaniu z wynikami podobnych doświadczeń z poprzednich sezonów wegetacyjnych, linia 455/05-2-4-2(C), która pochodzi z programu hodowlanego zainicjowanego w połowie mijającego dziesięciolecia, wydaje się być pod względem wysokości roślin u mieszańców wyraźnie lepsza niż linie wcześniej wytwarzane. Mieszańce z udziałem dwóch pozostałych badanych linii z cytoplazmą C, które oceniano w dwóch miejscowościach plonowały dość słabo. Linia 505/04-28-2-3(C) skrzyżowana z odmianą Walet dała plon na poziomie około 90% wzorca, mieszaniec z udziałem linii 454/05-2-6-3(C) plonował o ponad 0% słabiej (tab.6). Podoabnie jak w doświadczeniu prowadzonym w 4 miejscowościach, tutaj również dał się zauważyć istotny wpływ środowiska oba testowane mieszańce lepiej plonowały w Nagradowicach. Plon uzyskiwany w Choryni był wyraźnie niższy, zarówno w wartościach bezwzględnych, jak i w porównaniu do odmiany wzrocowej Minello F. Mieszaniec linii 505/04-28-2-3(C) należał przy tym do grupy najwyższych spośród badanych w doświadczeniu, ale pomimo tego charakteryzował się dość dobrą odpornością na wyleganie. Jednocześnie był on bardzo wrażliwy na rdzę brunatną, przy przeciętnej odporności na mączniaka (tab.6). 9
Tabela 5 Plon ziarna oraz inne cechy użytkowe mieszańców F zaobserwowane w doświadczeniu z mieszańcami żyta założonym metodą wzorcową w czterech miejscowościach. Lp. Nazwa mieszańca Plon [dt/ha ] Termin kłoszenia [dni od maja] Wysokość [cm] Wyleganie Rdza brunatna Mączniak S_26P/08 83,05 5,50 46 7,00 7,50 8,00 2 BRASETTO_OB. 89,60 5,75 49 5,67 5,50 7,00 3 S_4P/08 82,65 5,50 50 6,33 7,25 7,50 4 S_43P/08 80,05 4,50 48 6,00 6,25 7,50 5 S_23P/08 80,40 6,50 46 7,33 5,75 8,00 6 NS-0759/P/5 77,75 4,75 45 6,67 5,25 7,00 7 S_38P/08 76,75 5,00 4 5,67 6,25 8,50 8 S_6P/08 80,00 4,75 46 7,00 6,75 8,00 9 NS-0728/P/5 7,75 5,00 4 6,67 5,50 7,00 0 NS-0748/P/ 7,70 5,25 52 6,00 5,00 7,50 NS-0757/P/3 73,00 4,50 46 5,00 5,75 7,00 2 NS-0723/24P/4/6 68,95 4,25 48 6,00 4,00 7,00 3 S_4P/08 74,30 5,00 5 7,33 4,75 7,50 4 NS-0758/P/3 79,90 4,50 54 6,67 5,25 6,00 5 S_266P/08 73,00 4,00 52 5,67 5,25 7,50 6 S_45P/08 72,60 4,75 55 6,33 4,50 7,50 7 NS0709/0P/3/2 73,75 4,50 57 6,67 5,00 7,00 8 NS-073/P/3 73,30 4,50 46 7,00 4,75 6,50 9 NS-0725/27P/5/3 70,70 4,25 49 6,67 4,75 7,50 20 NS-0787/89P/4/6 72,60 4,25 5 5,00 5,00 6,50 2 S_4P/08 67,40 4,25 43 5,67 5,75 6,50 22 NS-0762/P/ 67,40 5,25 40 6,00 4,75 6,50 23 S_54P/08 62,70 4,25 49 5,67 4,25 6,50 24 S_83P/08 7,80 4,50 44 6,00 5,00 7,50 25 NS-0733/P/2 65,00 4,75 55 5,00 4,75 6,00 26 NS-0728/P/3 66,95 4,75 4 6,67 5,25 7,00 27 NS-079/P/5 65,30 5,75 39 5,67 5,00 6,50 28 S_6P/08 66,70 5,00 46 7,33 4,00 7,50 29 S_69P/08 69,50 3,50 43 6,00 3,50 8,00 30 455/05-2-4-2 63,35 3,75 55 6,33 4,00 8,00 3 S_65P/08 62,35 4,25 49 6,67 5,00 7,50 32 S_209P/08 68,80 3,50 47 7,00 5,50 7,00 33 S_242P/08 62,85 3,75 40 5,33 4,25 7,00 34 LS_222P/07 62,65 5,00 48 5,67 4,25 6,50 35 S_95P/08 62,05 5,25 45 6,00 4,50 7,00 36 S_89P/08 64,50 4,25 48 5,67 4,50 6,00 Średnia ogólna 7,53 4,69 47,42 6,2 5,2 7,4 Średnia wzorca 73,44 5,78 46,78 6 6 6,94 (Minello F) odch.std. (wzorce) 6,26 0,26 3,4 0,98 0,72 0,47 0
Tabela 6 Plon ziarna oraz inne cechy użytkowe mieszańców F zaobserwowane w doświadczeniu z mieszańcami żyta założonym metodą wzorcową w dwóch miejscowościach. Lp. Nazwa mieszańca Plon [dt/ha] Termin kłoszenia [dni od maja] Wysokość [cm] Plon [% wzorca] Wyleganie Rdza brun. Mącz -niak S_256P/08 85,8 7,7 0 57 5,0 6,5 7,0 2 S_5P/08 82,0 3,9 45 4,5 5,5 8,0 3 S_6P/08 76,0 07,3 2 52 2,5 6,0 6,0 4 S_22P/08 77,2 06,2 4 48 5,5 6,0 7,0 5 NS-0708/P/2 70,4 03,6 2 5 4,0 3,5 5,0 6 S_86P/08 74,2 03,5 2 48 4,5 4,5 6,0 7 NS0749/P/5 74,7 02,7 5 42 4,5 3,5 5,0 8 S_7P/08 66,8 00,9 2 52 3,5 3,0 5,0 9 NS-0720/P/3 68,8 99,4 4 47 3,5 4,0 6,0 0 NS-078/P/3 70,5 98,2 3 47 5,0 3,0 8,0 S_85P/08 68,0 97,2 2 47 3,0 5,5 7,0 2 S_258P/08 70,9 94,8 4 53 6,0 5,5 7,0 3 S_99P/08 67,7 94,3 3 48 3,0 3,5 6,0 4 S_63P/08 62,9 93,6 3 49 3,5 5,5 7,0 5 S_80P/08 69,2 93,5 5 35 6,0 4,5 5,0 6 NS075/P/3/6 66,0 92,0 3 46 4,5 3,0 7,0 7 NS0748/P/2 67, 9,9 5 55 4,0 4,0 7,0 8 NS0730/P/ 62,5 9,9 46 5,0 5,0 5,0 9 NS0754/55/P/4/6 64,0 9,4 3 53 4,0 4,0 6,0 20 NS-0720/P/4 66,5 90,7 3 46 4,5 3,0 6,0 2 S_96P/08 66,7 90,7 4 45 3,5 4,5 8,0 22 NS-0720/P//2 63,2 90,4 3 44 4,0 4,0 6,0 23 505/04-28-2-3 65,8 89,6 3 55 5,0 3,5 7,0 24 S_00P/08 67, 89,4 4 48 5,5 4,0 8,0 25 NS-0723/P//2 6,9 85,6 3 47 3,5 3,0 6,0 26 NS0797/00/P/2 62,5 85,6 3 40 5,0 4,0 5,0 27 NS-076/P//08 59,3 85,2 3 42 4,0 2,5 5,0 28 S_5P/08 64,8 83,7 2 45 3,5 4,0 8,0 29 NS-0727/P/5 6,0 82,9 4 4 4,5 3,0 6,0 30 S_73P/08 53, 80,8 4 45 4,0 3,0 6,0 3 S_275P/08 58,0 80,2 4 46 5,5 4,5 8,0 32 NS-078/P/3 58, 79,0 3 46 3,5 3,5 7,0 33 454/05-2-6-3 55,6 78,6 3 45 3,0 5,0 6,0 34 NS0745/P//2 60,6 78,2 5 37 3,5 5,0 7,0 35 S_60P/08 55,2 75,5 7 2 8,0 3,0 5,0 36 NS-079/P/4 55,0 74,3 5 3 3,0 3,0 4,0 średnia ogólna 66,09 3 46 4,3 4, 6,3 Średnia wzorca 7,02 4 47 3,7 5,3 6,6 (Minello F) odch.std. (wzorce) 5,99 0 4,76 0,6 0,8,0
Linia 454/05-2-6-3(C) skrzyżowana z odmiana Walet dała mieszańca o przeciętnej wysokości i odporności na choroby, ale podatnego na wyleganie (tab.6) Trzy oceniane w roku 200 linie z cytoplazmą C charakteryzowały się w porównaniu do linii ocenianych w latach poprzednich wyraźnie zminiejszoną wysokością roślin u mieszańców testowych. Co prawda nadal mieszańce oparte o system CMS-C należą do wysokich, ale są wielkości w pełni porównywalne do najwyższych mieszańców opartych o system CMS-P. Mieszańce z cytoplazmą C badane w poprzednich sezonach wegetacyjnych były na ogółe wyższe od tych z cytoplazmą P nawet o 20-30 cm. Jak wynika z tegorocznych doświadczeń, nie była to cecha związana z typem cytoplazmy sterylizującej, ale wynikała z genotypu, a przed wszystkim z obecności w rodowodach starszych linii genotypu dopełniacza 54-6. Nadal poważnym problemem linii bazujących na systemie CMS-C pozostaje znaczna wrażliwość na rdzę brunatną. Niezadowalająca jest też oczywiście zdolność kombinacyjna mierzona poziomem plonowania mieszańców testowych. W celu kontynuowania badań w kolejnych sezonach wegetacyjnych przeprowadzono w 200 roku krzyżowania w izolowanej szkółce top-crossowej z odmianą Walet jako testerem, w której formami matecznymi było 7 linii męskosterylnych z cytoplazmą C. W przypadku czterech linii ilość zebranych ziaren nie przekraczała 80g (tab.7), co nie pozwoliło na założenie doświadczeń z tymi mieszańcami. Tylko z jednej linii (454/05-8-4-4-4C) zebrano ziarno w ilości wystarczającej do założenia doświadczenia dwupowtórzeniowego w trzech miejscowościach (Nagradowice, Wierzenica, Wiatrowo). Dwa kolejne mieszańce (z udziałem linii 454/05-07-4-3-C i 454/05-8-4-4-4C) umieszczono w doświadczeniu założonym metodą wzorcową w czterech miejscowościach. Tabela 7 Wagi nasion uzyskanych w szkółce typu top-cross z liniami męskosterylnymi posiadającymi cytoplazmę CMS-C oraz odmianą Walet jako testerem. Lp. Nazwa linii Waga nasion (kg) MTZ (g) 454/05-23-4-3-4C 0,080 8,7 2 454/05-42-2-3-C 0,050 9,3 3 454/05-68-4-4-4C 0,240 9,8 4 454/05-07-4-3-C 0,90 8,3 5 454/05-8-4-4-4C 0,280 20,7 6 452/05-8-2-3-3C 0,030 7,7 7 45/05-9-2--4C 0,070 9,7 2
Zadanie 4. Ocena przydatności dla hodowli markerów molekularnych sprzężonych z głównym locus kontrolującym płodność w cytoplazmie C. W ramach badań wykonanych w 200 roku dokonano prób identyfikacji nowych markerów sprzężonych z genem Rfc, który wykazuje najsilniejsze działanie przy przywracaniu płodności u żyta z cytoplazmą C. W badaniach wykorzystano populację złożoną z rekombinacyjnych linii wsobnych (RIL), które otrzymano po skrzyżowaniu linii 54 (posiadającej allele sterylności) z przywracającą płodność linią wsobną 2020LM. W poprzednich latach badań wykazano, że u mieszańca BC między tymi samymi liniami wsobnymi markery SCAR sprzężone z Rfc wykazują efektywność w pracach selekcyjnych, ale skuteczność ewentualnej selekcji nie jest w pełni zadowalająca. Stąd konieczne wydaja się próby: a) znalezienia nowych, bliżej sprzężonych z Rfc markerów; b) zidentyfikowania innych niż Rfc genów przywracających płodność w cytoplazmie C. Do pierwszego z tych zadań, realizowanego w 200 roku wybrano wyprowadzaną na drodze wieloletniego chowu wsobnego populację RIL 54 x 2020LM. Segregacje markerów molekularnych analizowano w obrębie 92 genotypów linii wsobnych wyprowadzonych z kombinacji [54 x 2020LM]. Analizowano segregacje różnych dostępnych markerów: SSR, STS, SCAR. Próby DNA badanej populacji poddano też ocenie pod względem markerów DArT (Diversity Array Technology). Ten ostatni typ markerów stanowił najliczniejszą grupę loci. W celu określenia czy badane linie rekombinacyjne posiadają allele sterylności, czy też przywracają płodność, poszczególne genotypy skrzyżowano w sezonie wegetacyjnym 2008/09 z męskosterylnymi formami żyta posiadającymi sterylizującą cytoplazmę CMS-C. Uzyskano 8 mieszańców, w których rolę zapylacza pełniły różne genotypy RIL [54 x 2020LM]. Po dwanaście roślin każdego z mieszańców wysiano punktowo (rozstawa 20x25cm) jesienią 2009 roku na polu należącym do Hali Wegetacyjnej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie. Każdą z roślin testowych oceniano wzrokowo pod względem męskiej płodności wykorzystując skalę bonitacyjną opracowaną przez Geigera i Morgensterna (975). Wyniki oceny wzrokowej weryfikowano zakładając przed kwitnieniem na główny kłos każdej z roślin izolator z tomofanu, a po zbiorze oceniając zawiązywanie ziaren na drodze samozapylenia. Mapy genetyczne markerów wykazujących silne sprzężenie z genem Rfc utworzono w programie JoinMap 3 wybierając do analizy markery najsilniej sprzężone, tj. takie, dla których częstotliwość rekombinacji między danym locus markerowym, a genem Rfc nie przekraczała 3
poziomu 5%. Poza najsilniej sprzężonymi z Rfc markerami, przy konstruowaniu map genetycznych uwzględniono marker Xpsr9, którego lokalizacja na długim ramieniu chromosomu 4R była wcześniej opisywana przez autorów różnych map genetycznych. Uzyskane dane z oceny fenotypowej mieszańców testowych wskazywały na monogeniczną kontrolę przywracania płodności pyłku w badanej populacji rekombinacyjnych linii wsobnych. Locus genu determinującego płodność, zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z analiz przeprowadzonych w poprzednich latach na pokoleniu BC, został zlokalizowany na długim ramieniu chromosomu 4R. Locus Rfc został na mapie genetycznej populacji RIL [54 x 2020LM] zlokalizowany w grupie bardzo silnie sprzężonych z nim 94 markerów molekularnych, wśród których były 3 markery SCAR (SCSz23L500, SCSz670L900 oraz SCP2M56) oraz 9 loci DArT (ryc.). Wśród tych markerów znalazło się 27 markerów DArT, które segregowały ze zgodnością ponad 99% z genem Rfc (tab.8). Oczywiście trzeba zaznaczyć, że z uwagi na małą liczebność populacji mapującej RIL [54 x 2020LM] wyniki te należy traktować jako wstępne, ale w świetle tych wyników wydaje się, że technologia DArT powinna dostarczyć w najbliższej przyszłości szeregu przydatnych w hodowli żyta markerów. 54x2020LM 4 Xpsr9 XrPt505904 XrPt508435 Xscsz23L500 Xscsz670L900 XrPt390553 XrPt389907 XrPt347800 XrPt506696 XrPt398754 Xscp2m56 XrPt398699 XrPt505207 XrPt505760 XrPt398697 XrPt400726 XrPt700 XrPt398504 XrPt400377 XrPt508573 XrPt40508 XrPt34828 XrPt507666 XrPt50646 XrPt40773 XrPt402436 XrPt400933 XrPt407 XrPt398747 XrPt456 XrPt389977 XrPt40273 XrPt40254 XrPt505440 XrPt509636 XrPt506444 XrPt508638 XrPt50764 XrPt390763 XrPt4073 XrPt40873 XrPt50926 XrPt20262 XrPt40807 XrPt508766 XrPt50838 XrPt40070 XrPt39984 XrPt40336 XrPt400708 XrPt40848 XrPt399265 XrPt507547 XrPt389935 XrPt505672 XrPt40308 XrPt508878 XrPt398602 XrPt50580 XrPt389928 XrPt39079 XrPt20306 XrPt399747 Rfc XrPt2094 XrPt390424 XrPt39035 XrPt398695 XrPt389652 XrPt400382 XrPt5058 XrPt399900 XrPt505373 XrPt509323 XrPt399902 XrPt347534 XrPt508305 XrPt508800 XrPt507668 XrPt40883 XrPt4023 XrPt40257 XrPt400484 XrPt398763 XrPt4083 XrPt509637 XrPt390787 XrPt400520 XrPt3987 XrPt40077 XrPt50756 XrPt400993 XrPt505380 XrPt505343 XrPt50849 XrPt508026 Ryc.. Mapa sprzężeń obejmująca fragment długiego ramienia chromosomu 4R wraz z genem Rfc. 4
Tabela 8 Liczba markerów w obrębie grupy sprzężeń obejmującej fragment długiego ramienia chromosomu 4R oraz ich częstotliwość rekombinacji względem genu Rfc w populacji RIL [54 x 2020LM] Częstotliwość rekombinacji Liczba markerów <0,0 27 0,0-0,02 9 0,02-0,03 42 0,03-0,04 7 0,04-0,05 9 W trakcie dotychczasowych badań nad cytoplazmą C zidentyfikowano szereg markerów molekularnych sprzężonych z locus Rfc z chromosomu 4RL. O ewentualnej przydatności markerów w hodowli nowych linii dopełniających decyduje siła sprzężenia danego markera z genem męskiej sterylności oraz zdolność rozdzielcza markera, która zależy od polimorfizmu jaki dany marker wykazuje w zróżnicowanych materiałach genetycznych. Potencjalnie przydatne w selekcji markery sprzężone z locus Rfc kontrolującym płodność u mieszańców z cytoplazmą C, użyte zostały do testowania genotypów występujących w odmianach populacyjnych żyta. Badaniami w 200 roku objęto trzy populacje: jadną pochodzącą z Ameryki Południowej i dwie z Iranu. W obrębie każdej z populacji testowano obecność markerów u 48 losowo wybranych osobników. W związku z faktem, że celem badań jest określenie przydatności markerów molekularnych do zastosowań w praktyce hodowlanej, izolację DNA przeprowadzono przy użyciu bardzo uproszczonej metody. W badaniach użyto dziewięć markerów SCAR i jeden STS, których loci znajdują się na długim ramieniu chromosomu 4R. W oparciu o uzyskane dane wyliczono wartości współczynnika PIC (polymorphic information content) informującego o przydatności danego markera do rozróżniania badanych genotypów (Powell i in. 996). PIC n 2 p i i gdzie p i oznacza częstotliwość występowania i-tego allela. Osiem z dziewięciu użytych markerów SCAR wykazywało dominujący typ dziedziczenia (formy alleliczne tych markerów różnią się obecnością lub brakiem odpowiedniego produktu amplifikacji). Ostatni z zastosowanych markerów (SCSz670L900) daje dwa produkty amplifikacji o wielkościach około 900 i 950bp, co w niektórych kombinacjach krzyżowania pozwala na ujawnienie kodominacji. 5
Najmniejszą wartość współczynnika PIC wskazującą na zupełny brak polimorfizmu zaobserwowano w przypadku markera SCSz334L700 (tab.9). Marker ten nie dawał produktów amplifikacji u żadnego z testowanych genotypów. Niski poziom polimorfizmu (wartość współczynnika PIC poniżej 0,2) odnotowano dla markera SCSz39L550f4r3. Marker ten generował produkty amplifikacji u stosunkowo mało licznej grupy osobników pochodzących z zaledwie jednej spośród trzech badanych populacji. Odmienną charakterystykę miał marker SCSz530L850 większość badanych genotypów charakteryzowała się obecnością prążków markerowych tego fragmentu DNA, co spowodowało, że wartość PIC dla tego locus też była stosunkowo niska. Najwyższy możliwy do osiągnięcia poziom polimorfizmu dla markerów dominujących (wartość współczynnika PIC równa 0,5) odnotowano dla markera SCSz2L450, nieco niższy, ale przekraczający wartość 0,4 współczynnika informacji o polimorfizmie - dla SCSz39L550f3r4 (tab.9). 6
Tabela 9 Zbiorcze wyniki analiz PCR-SCAR w obrębie trzech populacji żyta uprawnego. Marker IRAN I IRAN IX Trenelense Razem Suma PIC z prążkiem bez prążka z prążkiem bez prążka z prążkiem bez prążka z prążkiem bez prążka SCSz2L450 29 9 8 30 3 7 78 66 44 0,50 SCSz23L500 40 8 38 0 39 9 7 27 44 0,30 SCSz530L850 42 6 4 7 43 5 26 8 44 0,22 SCSz39L550f3r4 0 48 9 39 33 5 42 02 44 0,4 SCSz39L550f4r3 5 33 0 48 0 48 5 29 44 0,9 SCSz670L900 (950 pz) 34 4 47 26 22 07 37 44 0,38 SCSz670L900 (900pz) 4 7 23 25 45 3 09 35 44 0,37 SCSz670L900-2 0 48 0 48 2 27 2 23 44 0,25 SCP4M55 24 24 0 48 0 48 24 20 44 0,28 PSR9f2r2 35 5 39 9 27 2 0 35 36 0,38 SCSz334L700 0 48 0 48 0 48 0 44 44 0,00 7
Zadanie 5. - Identyfikacja polimorfizmu mutacji punktowych (markery SNP i PCR-RFLP) w obrębie markerów blisko sprzężonych z genem Rfc. Wyizolowane z żelu agarozowego i oczyszczone produkty amplifikacji trzech markerów SCAR: SCSz23L500, SCSz670L900 i SCSz2L450, które zostały opracowane w Katedrze Genetyki, Hodowli i Biotechnologii ZUT w Szczecinie zostały poddane klonowaniu w plazmidach bakteryjnych w celu ponownego ich sekwencjonowania w obrębie różnych genotypów żyta. Dwa pierwsze z wymienionych markerów znalazły się w grupie najsilniej sprzężonych z genem Rfc (por. Zadanie 4, ryc.) Prowadzone w poprzednich latach próby bezpośredniego (z pominięciem etapu klonowania) sekwencjonowania tych produktów nie dostarczyły informacji o polimorfizmie pojedynczych nukleotydów (SNP) Produkty markera SCSz23L500 pochodziły od dwóch różnych co do pochodzenia linii wsobnych: Ot0-20 (wywodzącej się ze starej szwedzkiej odmiany Otello) oraz 620/75--5 (pochodzącej z odmiany Dańkowskie Złote). Każdy produkt sekwencjonowany był z dwóch stron przy użyciu starterów flankujących amplifikowany region w obrębie sekwencji plazmidu bakteryjnego (ang. forward and reverse primers). W obrębie uzyskanych danych o sekwencji nukleotydów poszukiwano różnic charakterystycznych dla badanych genotypów (powtarzalnych w sekwencjach niezależnie otrzymanych z zastosowaniem starterów forward i reverse). Niestety wszystkie badane produkty z róznych klonów bakteryjnych okazały się w zsekwencjonowanym obszarze w pełni identyczne. Różnice, które sporadycznie występują w obrębie uzyskanych danych (ryc.2) mają charakter przypadkowy (nie były potwierdzane w trakcie sekwencjonowania tego samego produktu w innym klonie bakteryjnym lub tym samym klonie sekwencjonowanym z przeciwnej strony) i należy je traktować jako efekt błędów w procesie amplifikacji lub sekwencjonowania. Drugi z analizowanych markerów otrzymano na bazie genotypów linii Ot0-20 (z odmiany Otello) i S76 (linia wyprowadzona w HR Danko, mająca w swoim rodowodzie odmianę Amilo). Zmienność w obrębie uzyskanych sekwencji była niewielka. Sekwencje uzyskane przy zastosowaniu startera M3R (reverse) wykazywały drobne różnice (tyc. 3) o charakterze insercyjno-delecyjnym (tzw. polimorfizm indel ). Tego samego rodzaju róznice, ale w większym nasileniu widoczne są w sekwencjach otrzymanych przy zastosowaniu startera M3F (forward) (ryc. 4). Trzeci marker (SCSz2L450) był reprezentowany przez produkty amplifikacji pochodzące od linii DS2 oraz 620/75--5. W obrębie analizowanej sekwencji zidentyfikowano pojedynczy polimorfizm typu indel i trzy przypadki SNP (ryc.5). 8
Ryc. 2. Porównanie sekwencji nukleotydów w obrębie klonowanego fragmentu SCSz23L500. 9
Ryc. 3. Porównanie sekwencji nukleotydów w obrębie fragmentu SCSz670L900 przy zastosowaniu starterów M3R (reverse). Ryc. 4. Porównanie sekwencji nukleotydów w obrębie fragmentu SCSz670L900 przy zastosowaniu starterów M3F (forward). 20
Ryc. 5. Porównanie sekwencji nukleotydów w obrębie klonowanego fragmentu SCSz2L450. 2
Wykonawcy projektu w roku 200: dr inż. Stefan Stojałowski mgr inż. Monika Hanek mgr inż. Przemysław Tomczak dr Marek Szklarczyk mgr inż. Waldemar Brukwiński mgr inż. Michał Materka dr Beata Myśków st. tech. Ewa Skurko Sprawozdanie końcowe opracował: dr inż. Stefan Stojałowski 22