SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI ZADANIA z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w latach

Transkrypt

1 SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI ZADANIA z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej w latach Zadanie Nazwa tematu: Charakterystyka zróżnicowania Raphanus sativus L. w aspekcie rolnictwa ekologicznego (zadanie nr 101) 3. Podmiot realizujący temat: Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin 4. Wydział: Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu, SGGW 5. Kierownik tematu: prof. dr hab. Katarzyna Niemirowicz-Szczytt Wykonawcy: dr hab. Grzegorz Bartoszewski, dr Aleksandra Korzeniewska, mgr Teresa Gałecka, mgr Marta Romać, magistranci, inżynieranci, pracownicy techniczni. Podsumowanie doświadczeń prowadzonych w latach , zadanie 101. Celem projektu było zbadanie cechy męskiej sterylności w zróżnicowanych materiałach Raphanus sativus i powiązanie jej z innymi cechami tego gatunku, a także uzyskanie markerów genu(ów) męskiej sterylności. W 2008 roku wykonano ocenę cech morfologicznych roślin (kształt i kolor zgrubienia, pokrój roślin, wczesność kwitnienia, barwa płatków korony) w 14 liniach dopełniających oraz w 14 populacjach BC3 powstałych z krzyżowania roślin męskosterylnych z liniami dopełniającymi. Otrzymano nasiona z krzyżowania roślin męskosterylnych z roślinami linii dopełniających. Linie dopełniające zostały rozmnożone przez krzyżowanie siostrzane a także samozapylenie. Zaprojektowano startery specyficzne do sekwencji genu Rfo i testowano startery na wybranych materiałach roślinnych oraz sekwencjonowano wybrane produkty reakcji PCR. Wyniki sugerują, że genów restorerów może być więcej niż jeden, oraz iż w różnych materiałach różne geny mogą pełnić tę funkcję. Dodatkowo możliwe jest, iż w badanym materiale występują inne, niescharakteryzowane wcześniej formy alleliczne genów Rf. W tej sytuacji zasadne wydaje się kontynuowanie analiz w celu lepszego scharakteryzowania locus Rfo oraz sekwencji promotorowych genu, w różnych materiałach. Zasadne wydawało się opracowanie nowych par starterów pozwalających na amplifikację dłuższych fragmentów genu, co może pozwolić na identyfikację znaczących różnic. Celem prac w 2009 roku była: a). Charakterystyka wybranych cech zgrubień korzeniowych u 14 linii dopełniających oraz b) w 14 kombinacjach pokolenia BC4 powstałych z krzyżowania roślin męsko

2 sterylnych z liniami dopełniającymi; c). Ocena wartości linii dopełniających (wynik krzyżowania z formami męsko sterylnymi BC4) uzyskanymi poprzez ręczne zapylanie, oraz zapylanie przez pszczołę murarkę w izolatkach; d) Otrzymanie dużej ilości nasion z krzyżowania roślin męsko sterylnych z roślinami linii dopełniających (BC5) wykonane w izolatorach z pomocą owadów; e). Rozmnożenie linii dopełniających poprzez siostrzane krzyżowanie (owady w izolatkach), a także samozapylenie. Harmonogram został zrealizowany. Wyniki obserwacji rozmnażanych i charakteryzowanych linii męsko sterylnych i płodnych wskazują, że zmienność uległa zawężeniu. Do ograniczenia zmienności przyczynia się zwiększona podatność linii wsobnych na patogeny. Zapylanie w izolatkach przez pszczołę murarkę w 2008 spowodowało przypylenia obcym pyłkiem. Zapylanie przez inne owady (trzmiele) w 2009 roku było niekorzystne dla linii dopełniających. Wykazano niski plon nasion z rośliny. W tych samych warunkach rośliny męsko sterylne plonowały lepiej. Sugeruje to podjecie wysiłków w celu doskonalenia linii męsko sterylnych i dopełniających a także rozpoczęcie nowego cyklu uzyskiwania linii dopełniających w kontekście zróżnicowanego tła genetycznego. W roku 2009 kontynuowano prace mające na celu scharakteryzowanie locus Rfo, o którym wiadomo, że zawiera gen(y) regulujące przywracanie płodności męsko sterylnym roślinom z cytoplazmą typu Ogura. Locus Rfo zawiera 3 geny kodujące białka typu PPR. Są to geny PPRA, PPRB i PPRC. Duże podobieństwo tych genów sugeruje, iż ulegały one duplikacji w genomie rzodkiewki w trakcie ewolucji. Z opublikowanych prac wynika, że właściwym genem przywracającym płodność jest gen PPRB. Przeprowadzono analizę bioinformatyczną, porównując dostępne w bazach danych sekwencje nukleotydowe genu Rfo. Chodziło o zidentyfikowanie unikalnych sekwencji znajdujących się w sąsiedztwie lub w obrębie genu PPRB tak by można było zaprojektować startery pozwalające na specyficzną amplifikację tego genu. Obecność kilku genów o podobnej sekwencji znacznie utrudniała analizę badanego locus Rfo. Także różnorodność sekwencji w locus Rfo, w testowanych formach, dodatkowo komplikowała projektowanie uniwersalnych starterów, które umożliwiałyby amplifikowanie genu PPRB we wszystkich analizowanych materiałach. Opracowano zestaw unikalnych starterów pozwalających charakteryzować allele PPRB. Potwierdzono obecność genu PPRB w testowanych materiałach. Uzyskano trzy nowe sekwencje alleliczne genu PPRB (P2/08-Rfo-2,4kb, 31/08-Rfo-2,4kb, oraz sekwencję konsensusową linii 7, 15 i 21). Udało się wyodrębnić zmiany w sekwencji nukleotydowej. Jednoznaczne stwierdzenie, czy istnieje możliwość zaprojektowania na podstawie tych sekwencji specyficznych starterów, które umożliwiałyby odróżnienie form restorujących od dopełniających wymaga przeprowadzenia dodatkowych analiz. W 2010 roku rozpoczęto nowy etap otrzymywania linii dopełniających w oparciu o otrzymane materiały przy włączeniu nowych odmian o pożądanych cechach (program trzyletni).wytypowano 3 linie płodne dopełniające, samozgodne, o najlepszych cechach nasion (14/13, 45/5 i 32/5) oraz odmiany Jolly, Sora, Marabelle, Carmen, i Gamma MM 09. Wykonano krzyżowania w 10 kombinacjach.

3 W roku 2010 przeprowadzono również kolejną ocenę wartości posiadanych linii dopełniających przez ocenę wyniku ich krzyżowania z formami męsko sterylnymi BC5, uzyskanymi poprzez ręczne zapylanie, oraz zapylanie przez trzmiele w izolatkach latem Analiza w przypadku krzyżowań ręcznych dotyczyła 10 kombinacji. W 5 kombinacjach BC5 linii krzyżowanych w 2009 (Ms x Pł) obserwowano 100 % roślin męsko sterylnych. Były to kombinacje z numerami wysiewu 92, 95, 96, 97 i 100. Linie płodne dopełniające (ojcowskie) w przypadku tych kombinacji pochodziły z odmiany Rewa oraz linii: 157/04 P.Ziel. i 610 Reg. Natomiast linie męsko sterylne (mateczne) pochodziły z odmiany Mastareed, Corox, Goliath i Rondor. Kolejne trzy oceniane kombinacje: 98, 99 i 93 miały kwiaty męsko sterylne, odpowiednio w ilości: : 67%, 70% i 83%. Najwięcej roślin z kwiatami płodnymi obserwowano w numerach: % i 90 76%.W przypadku tych kombinacji linie mateczne (męsko sterylne) pochodziły z odmiany Mastareed a ojcowskie z odmiany Rewa. Oceny linii dopełniających, które były zapylane (Ms x Pł) w izolatkach przez trzmiele dotyczyła 11 kombinacji pokolenia BC5. W trzech kombinacjach (103, 105 i 111) linii zapylanych przez trzmiele (Ms x Pł) obserwowano 100% roślin z kwiatami męsko sterylnymi. Także w kombinacji 103, 106 i 107 obserwowano 97-98% roślin męskosterylnych. Pozostałe 2-3% były to rośliny wyglądające jak męskosterylne, ale z widocznymi ziarnami pyłku. Najwięcej roślin płodnych (100%) zanotowano w kombinacji 102. Podobny wynik uzyskano także przy ręcznym krzyżowaniu kombinacji % roślin płodnych odnotowano w ręcznie krzyżowanej kombinacji 90. Ocena wizualna nie zawsze pozwoliła jednoznacznie określić fenotyp kwiatów. W niektórych przypadkach mimo zredukowanych pręcików obserwowano niewielkie ilości pyłku, w innych pręciki przypominały te z roślin płodnych, lecz nie obserwowano ziaren pyłku. W celu wyjaśnienia wątpliwości wytypowano 30 roślin o zróżnicowanym fenotypie do badań cytologicznych. Wykazano, że tylko roślina 100/26 sklasyfikowana fenotypowo jako MS przez 16 dni kwitnienia nie wytwarzała żywego pyłku. Roślina ta różniła się morfologicznie od innych MS tzn. miała bardzo wyraźnie zredukowane pylniki i ograniczoną ilość płatków korony. Ponadto, niektóre jej pączki, żółkły i zasychały przed rozwinięciem. Pozostałe rośliny określone jako MS wytwarzały na jednej gałązce od 0 do 10 żywych ziaren pyłku przez okres od 11 do 24 dni ich kwitnienia. Rośliny określone jako MS? grube pylniki, nie pyli miały podobną ilość żywego pyłku w jednym pąku kwiatowym (od 0 do 2 żywych ziaren pyłku) przez okres od 10 do 24 dni ich kwitnienia. Rośliny określone jako MS? grube pylniki, pyli i Pł?, wytwarzały w jednym pąku, bardzo dużą ilość żywego pyłku i należy je traktować jak rośliny płodne. Wykonano również charakterystykę cech pokroju roślin i barwy płatków korony 34 linii płodnych, dopełniających pokolenia F6. Dla wykonania lepszej i pełniejszej oceny podłoża genetycznego cechy męskiej sterylności u rzodkiewki w roku 2009/2010 wyprowadzona została populacja mapująca składająca się z 436 roślin pokolenia F2. Populacja ta została oznaczona w skrócie 339 x 419. Do uzyskania tej populacji wykorzystano najlepsze materiały roślinne, którymi dysponowano.

4 Wstępny test segregacji cechy męskiej sterylności w populacji F2 (339 x 419), (oceniono 97 kwitnących roślin pokolenia F2), przeprowadzono na przełomie stycznia i lutego w fitotronie na Wolicy. Kolejna ocena populacji F2 339 x 419 oraz pokoleń BC1 została wykonana w warunkach polowych. Z pośród 97 roślin ocenionych w fitotronie, 51 miało fenotyp płodny, 45 było męsko sterylnych, a 1 roślina miała fenotyp pośredni. Spośród 333 roślin testowanych w polu, 209 roślin było płodnych, 119 męskosterylnych, a 5 miało fenotyp pośredni. Rośliny o fenotypie pośrednim nie były uwzględnione w dalszych badaniach. Łącznie w analizie genetycznej przeprowadzonej w fitotronie i w polu przetestowano 430 roślin pokolenia F2, z czego 260 było płodnych, 164 męskosterylnych, a 6 miało fenotyp pośredni. Analiza statystyczna, w której nie uwzględniano roślin o fenotypie pośrednim wykazała, że cecha męskiej sterylności pojedynków testowanej populacji segregowała w stosunku 9:7 (wartość χ2emp 4,43; χ2tab 6,64 przy α = 0,01, v=1). Stosunek segregacji wskazuje na udział dwóch komplementarnych genów dominujących, które są niezbędne do przywrócenia płodności w roślinach wchodzących w skład populacji. Dodatkowo oceniono fenotyp roślin pokoleń wstecznych BC1 (1) i BC1 (2). Wszystkie z 91 ocenionych roślin pokolenia wstecznego BC1(2) (24/15 x F1/3) było płodne, natomiast rośliny pochodzące z krzyżowania 339/06 x F1/2 (BC1(1)) segregowały na płodne i męskosterylne w stosunku 3:1. Z roślin pokolenia rodzicielskiego (339/07, 24/15) oraz z roślin pokolenia F2 rosnących w polu (158) zostało wyizolowane DNA. Dla roślin 339/07 i 24/15 oraz 100 roślin pokolenia F2 (339/2 x 419/2) wykonano reakcje Multiplex PCR w celu stwierdzenia obecności mitochondrialnego genu orf138, charakterystycznego dla roślin z cytoplazmą typu Ogura, odpowiedzialnego za wykształcenie cytoplazmatycznych czynników powodujących męską sterylność kwiatów. Właściwym produktem reakcji Multiplex PCR był amplikon o długości około 290pz, obrazujący występowanie mitochondrialnego genu orf138, co pozwoliło na stwierdzenie obecności cytoplazmy typu Ogura. Reakcja PCR przebiegła poprawnie dla 91 roślin pokolenia F2 oraz dwóch pojedynków o genotypie rodzicielskim (339/07 i 24/15). Potwierdzono obecność genu orf138, a tym samym cytoplazmy typu Ogura, u wszystkich (91) roślin pokolenia F2, w których obecne były produkty amplifikacji. Prążek charakterystyczny dla genu orf138 obecny był również w próbach wyizolowanych z roślin o genotypie matecznym 339/07. Zgodnie z oczekiwaniami, brak produktu amplifikacji obserwowano w próbkach izolowanych z roślin 24/15, co potwierdzało Normalny typ cytoplazmy u formy ojcowskiej. W celu poznania struktury molekularnej genu regulującego przywracanie płodności roślinom z populacji mapującej podjęto próbę amplifikowania genu PPRB u form matecznych populacji 339 x 419. Wykorzystano startery RfoF1, RfoR4, zaprojektowane przez Wang i współpracowników (2007). Według autorów w reakcji PCR z wykorzystaniem tych starterów amplifikowany jest rejon kodujący genu PPRB wraz z sekwencją regulatorową, o łącznej długości 2,4kb. Nasze wcześniejsze analizy to potwierdziły i pokazały przydatność tych starterów do amplifikacji genu PPRB.

5 Stosując startery RfoF1-R4, wykryto polimorfizm polegający na tym, że fragment spodziewany, o długości około 2,4 kb amplifikowany był jedynie w przypadku formy ojcowskiej płodnej (24/15) ponadto dla obu form amplifikowany był nie specyficzny fragment o długości około 2kb. Ze względu na fakt, że prążek o długości 2,4kb amplifikowany z wykorzystaniem pary starterów RfoF1 i RfoR4 różnicował formy rodzicielskie, w przyszłym roku planuje się sprawdzenie czy będzie on różnicował formy płodne i męskosterylne roślin pokolenia F2 w populacji 339 x 419. Dodatkowo na roślinach pokolenia F2 planuje się wykonanie analizy RAPD- BSA, w celu zidentyfikowania markerów sprzężonych z cechą męskiej sterylności. W 2011 roku celem badań było określenie wpływu tła genetycznego na ekspresję i stabilność cechy męskiej sterylności. Ocena cechy męskiej sterylności w powiązaniu z cechami korzenia w materiałach różnych genetycznie z uwzględnieniem markerów molekularnych genów męskiej sterylności. Dodatkowym celem jest wyodrębnienie odporności na szkodniki i patogeny w odmianach i liniach rzodkiewki odporność odmian jest niezbędna w rolnictwie ekologicznym. Za najważniejsze osiągnięcia należy uznać: (1) Doskonalenie materiałów męskosterylnych i dopełniających (płodne) przez ostrą i łagodniejszą formę chowu wsobnego. (2) Kontynuowanie nowego etapu otrzymywania linii dopełniających w oparciu o otrzymane materiały przy włączeniu nowych odmian o pożądanych cechach: (2a) ocena 10 populacji F2 segregujących na rośliny płodne dopełniające i płodne niedopełniające, samozapylanie roślin. (2b) wykonanie krzyżowań dwóch linii ms z wybranymi roślinami płodnymi z 10 populacji F2. (2c) sprawdzenie płodności 17 nowych kombinacji F1(ms x pł). Ocena cech agronomicznych i podatności na patogeny wybranych odmian rzodkiewki nowy wariant doświadczenia (Spółki Hodowlano-Nasienne). Przeprowadzono dwa doświadczenia porównawcze: (1) Doświadczenie wykonane przez IWARZ-PNOS Sp. z o.o., PHiNRO Reguły. (2) Doświadczenie wykonane przez Spójnia HiNO Nochowo. Celem pracy było porównanie 10 odmian rzodkiewki uprawianych w polu bez stosowania środków ochrony roślin w miejscowościach Reguły k/warszawy i Nochowo k/środy Wielkopolskiej. Odmiany do tego eksperymentu zostały wytypowane na podstawie wyników z roku ubiegłego i najciekawsze będą przydatne do poprowadzenia hodowli odmian o cechach pożądanych w uprawach ekologicznych. Badano odmiany Frida F1 (POLAN), Rondar F1, Poznanianka, Bona, Grazis, NOE 8, NOE13 (SPÓJNIA), Karminowa, Zorza i Amelka (IWARZ-PNOS, Reguły). Doświadczenia w obu miejscowościach założono metodą bloków losowanych, w dwóch sposobach uprawy i trzech powtórzeniach. Uprawę prowadzono z wysiewu nasion niezaprawionych wprost do gruntu w dwóch wariantach: (1) uprawa w odkrytym polu, (2) gleba okryta zaraz po wysiewie markizetą o drobnych oczkach. W trakcie wegetacji określano: terminy wschodów, zdrowotność roślin, różnice w ich bujności. Zbierając zgrubienia segregowano je na frakcje: handlowe, chore, niewyrośnięte, porażone przez śmietkę kapuściana, lub pchełkę ziemną. Oceniono także stopień parcenia miąższu oraz jego smak. Podsumowując wyniki z obu doświadczeń można za stwierdzić: (a) Odmiany biorące udział w doświadczeniu nie wybijały w pędy kwiatostanowe oraz utworzyły zgrubienia. (b) Najwyższy plon ogólny uzyskano z odmian Rondar F1 i Amelka (w obu miejscowościach). (c)

6 Najwyższy plon handlowy w doświadczeniu przeprowadzonym w Regułach miały odmiany: Karminowa i Rondar F1. zaś w Nochowie : Poznanianka, NOE8 i Bona. (d) Plon ogólny zebrany z pasa nie okrytego markizetą był nieznacznie wyższy od plonu z uprawy pod przykryciem. (e) Udział plonu handlowego w plonie ogólnym był zdecydowanie większy w pasie okrytym.(f) W doświadczeniu przeprowadzonym w Regułach okrycie roślin markizetą całkowicie ochroniło je przed żerowaniem śmietki kapuścianej. Najmniej porażone przez śmietkę kapuścianą były Poznanianka i NOE 13. Natomiast w doświadczeniu przeprowadzonym w Nochowie stwierdzono, że zastosowanie okrycia siatką zwiększyło ilość szkodników rzodkiewki. Autorzy sugerują, że przyczyną tego była prawdopodobnie większa przeżywalność owadów pod siatką podczas silnych majowych przymrozków, a także ich obecność w glebie przed siewem. (g) W doświadczeniu przeprowadzonym w Nochowie rośliny chorowały na czernienie korzeni rzodkiewki spowodowane przez Aphanomyces raphani. Dotyczyło to głównie odmian: Rondar F1 i Amelka, niezależnie od sposobu uprawy. (h) W Regułach pchełki w najmniejszym stopniu zaatakowały odmiany Zorza i Poznanianka. Najsilniej porażone były odmiany: Amelka, Frida F1, Rondar F1. (i) Większa wilgotność w pasie pod przykryciem przyspiesza wzrost roślin, sprawia, iż zgrubienia są lepsze w smaku (łagodniejsze), jednak w sezonie deszczowym może powodować wnikanie chorób takich jak czerń krzyżowych. (j) Większość odmian charakteryzowała się brakiem parcenia miąższu, bądź było ono umiarkowane. Odmiana Rondar F1 wykazała wprawdzie wyższy stopień sparcenia, ale jako odmiana wczesna powinna mieć inny termin zbioru niż pozostałe odmiany. (k) Największą frakcję zgrubień niewyrośniętych niezależnie od okrycia wykazały odmiany Zorza i Bona. (l) Z wyjątkiem NOE 13 wszystkie odmiany w tych warunkach doświadczenia (podlewanie) okazały się odporne na spękania zgrubień. Analiza RAPD Wykorzystując uzyskaną i scharakteryzowaną fenotypowo w poprzednich latach populację mapującą F2 339 x 419 podjęto próbę identyfikacji markerów RAPD sprzężonych z genem przywracającym płodność. Wykorzystano metodę prób zbiorczych RAPD-BSA. Sprawdzono też, czy wcześniej zidentyfikowany amplikon RfoF1-R4 o wielkości 2.4kb zawierający gen PPRB i pozwalający na odróżnienie form rodzicielskich różnicuje rośliny płodne i męsko-sterylne w tej populacji. Analizy molekularne przeprowadzone w 2011 roku potwierdziły dużą złożoność populacji F2 339 x 419 pod względem genetycznym. Mimo przetestowania 547 starterów RAPD na próbach zbiorczych nie udało się zidentyfikować markera sprzężonego z cechą męskiej sterylności. Segregacja zidentyfikowanych polimorficznych produktów RAPD w pokoleniu F2 była inna niż spodziewana 3:1. Interesujący wydaje się fakt, iż u formy matecznej (339/07) nie uzyskiwano amplifikacji rejonu zawierającego gen PPRB (jeden z 3 genów typu PPR występujących w locus Rfo i opisany jako funkcjonalny gen przywracający płodność). Analiza segregacji amplikonu RfoF1R4-2,4kb w populacji mapującej F2 339 x 419 pokazała, że obecność tego amplikonu nie jest skorelowana z płodnością, a jego brak z męską sterylnością. Wskazuje to na obecność innego locus/loci przywracających płodność bądź znaczne re-aranżacje w obrębie locus Rfo. Tak więc analiza fenotypowa (wykonana w 2010 roku) oraz wykonane w 2011 roku analizy molekularne pokazują, że w badanych materiałach roślinnych występują 2 lub więcej loci kontrolujące przywracanie płodności. Należy

7 też podkreślić dużą złożoność genetyczną populacji 339 x 419, jednakże populacja ta została uzyskana w wyniku krzyżowania najlepszych materiałów dostępnych w czasie, kiedy była wyprowadzana. W 2012 roku przeprowadzono następujące prace badawcze (1) Doskonalenie uzyskanych wcześniej materiałów męskosterylnych i dopełniających (płodnych), wyrównywanie cech, szczególnie stabilizacja męskiej sterylności przez ostrą i łagodniejszą formę chowu wsobnego. Materiały na poziomie BC8-8 populacji, oraz BC1 5 populacji. (2) Nowy etap otrzymywania linii dopełniających w oparciu o otrzymane materiały przy włączeniu nowych odmian o pożądanych cechach. Sprawdzenie płodności u 265 populacji F1 (Ms x Pł) uzyskanych w 2011 roku (2 linie MS z różnymi osobnikami dopełniającymi). (3) Ocena cech agronomicznych i podatności na patogeny wybranych odmian rzodkiewki (Spółka Hodowlano- Nasienna Nochowo). (4) Molekularna ocena cytoplazmy w pojedynkach dopełniających rzodkiewki. W zadaniu 1 w materiałach na poziomie BC8-8 populacji, oraz BC1 5 populacji wysadzono łącznie 570 osobników i dokładnie je zbadano. Potwierdzono 100% cechę męskiej sterylności u wszystkich roślin. Podobnie w zadaniu 2 przeprowadzono dokładną charakterystykę roślin pod względem płodności 265 populacji oraz charakterystykę łuszczyn i oceniono liczbę nasion w łuszczynach. Łącznie wysadzono 3250 roślin. Z 80 kombinacji krzyżowań z wybranymi osobnikami zebrano nasiona. Także z 67 osobników linii dopełniających uzyskano nasiona. W zadaniu 3 przeprowadzono doświadczenia w dwóch miejscowościach, w których porównano 10 odmian rzodkiewki w dwóch sposobach uprawy (pole odkryte oraz pole okryte siatką). W trakcie wegetacji określano: terminy wschodów, zdrowotność roślin, różnice w ich bujności. Przeprowadzono jednorazowy zbiór zgrubień sortując je na je na frakcje: handlowe, chore, niewyrośnięte, porażone przez śmietkę kapuściana, lub pchełkę ziemną. Oceniono także stopień parcenia miąższu oraz jego smak. Podsumowując wyniki z obu doświadczeń można stwierdzić: (a) Odmiany i rody o kulistych zgrubieniach to: NOE 8, NOE 13, Rondor F1, Grazis, Bona, Frida F1 Karminowa i Zorza, a Poznanianka i Amelka posiadają zgrubienia paluszkowe. (b) Wschody roślin poszczególnych odmian i rodów były średnie do bardzo dobrych i następowały najczęściej po 8 dniach od wysiewu. Najgorsze wschody bez względu na sposób uprawy obserwowano u odmiany Zorza. (c) Większość badanych rodów i odmian charakteryzowała się dużą równomiernością w osiąganiu dojrzałości zbiorczej, bez względu na sposób uprawy. (d) Najmniejszą tendencję do parcenia,niezależnie od sposobu uprawy obserwowano u odmiany Karminowa zaś najwyższa u odmiany Amelka i NOE 8. (e) Najwięcej zgrubień spękanych zanotowano wśród zbieranych zgrubień rodu NOE 8.(f) Odmiana Amelka tworzyła najwięcej zgrubień niekształtnych. (g) Plon handlowy zebranych zgrubień przy uprawie z osłoną (siatka) był ponad dwa razy wyższy od tego jaki zbierano przy uprawie bez osłony. Przykładowo z odmiany Rondor F1 w uprawie bez osłony, zbierano z metra kwadratowego uprawy 97 a z osłoną 161 zgrubień. (h) Odmiany w zależności od stanowiska uprawy osiągały wyższy lub niższy plon zgrubień. Najwyższy plon handlowy zgrubień niezależnie od sposobu uprawy zebrano z odmiany Rondor F1, Frida F1 i Poznanianka. (i) Wśród badanych odmian zaobserwowano porażenie przez szkodniki : śmietkę kapuścianą

8 i sporadycznie przez rolnice i ślimaki. W uprawie z osłoną (siatka), najbardziej porażone były zgrubienia odmiany Rondor F1, a w uprawie z osłoną zgrubienia odmiany Frida F1. Celem badań molekularnych w 2012 roku było określenie typu cytoplazmy wskazanych pojedynków dopełniających za pomocą metod molekularnych. W doświadczeniu przetestowano obiekty oznaczone numerami od 1 do 307 oprócz numerów 28 i 34 (wypadły). Izolację DNA dla większości pojedynków wykonano z nasion. W przypadku ograniczonej ilości nasion DNA izolowano pojedynczych liścieni pobieranych z młodych siewek rosnących w tunelu. Izolacja DNA z nasion była bardziej wyrównana i uzyskiwano lepsze wyniki analiz. W celu oceny typu cytoplazmy wykorzystano wcześniej opracowaną reakcję multiplex-pcr, którą ulepszono dobierając optymalną temperaturę przyłączania starterów i stosując bardziej czułą polimerazę DreamTaq. Wykorzystując zoptymalizowaną metodykę wykonano reakcję Multiplex-PCR dla wskazanych 305 pojedynków i określono typ cytoplazmy badanych pojedynków. Stwierdzono, że 284 pojedynków posiadało cytoplazmę typu Ogura, zaś 21 pojedynków cytoplazmę normalną. W 2013 roku kontynuowano prace nad ceną cechy męskiej sterylności w powiązaniu z cechami korzenia w materiałach różnych genetycznie (badanie wpływu tła genetycznego na ekspresję i stabilność cechy męskiej sterylności) oraz oceną materiałów pod względem odporności (śmietka, czerń krzyżowych) oraz cech korzenia w dwóch porównawczych doświadczeniach polowych (Firma Hodowlano-Nasienna SPÓJNIA Nochowo). Drugi rok takiego samego układu doświadczenia a także molekularna oceną cytoplazmy w badanych pojedynkach dopełniających (KGHiBR). W zakresie doskonalenia uzyskanych materiałów męskosterylnych i dopełniających (płodnych) oraz wyrównywania cech, szczególnie stabilizacja męskiej sterylności, przez ostrą i łagodniejszą formę chowu wsobnego, objęto materiały na poziomie: BC8(msxpł) - 8 populacji, BC 2 (msxpł) - 3 kombinacji oraz 36 linii dopełniających pokolenia F 9. W drugim cyklu otrzymywania linii dopełniających ocenie i rozmnożeniu poddano 41 populacji BC 1 (ms x płodna) oraz charakterystyce i rozmnożeniu 39 linii płodnych dopełniających pokolenia F 4. Przeprowadzono powtórną ocenę materiałów pod względem odporności (śmietka, czerń krzyżowych) oraz cechy korzenia w dwóch porównawczych doświadczeniach polowych. (Spółka Hodowlano- Nasienna Spójnia Nochowo). Celem badań molekularnych było określenie typu cytoplazmy w osobnikach populacjach dopełniających rzodkiewki (Raphanus sativus L.) w oparciu o obecność genu orf138, warunkującego cechę cytoplazmatycznej męskiej sterylności Ogura. W analizach wykorzystano izolację DNA z nasion i reakcję Multiplex-PCR. Wśród 20 testowanych populacji zidentyfikowano pięć populacji posiadających sterylizującą cytoplazmę Ogura (2, 3, 4, 5 i 6), przy czym w przypadku dwóch populacji (2 i 3) obserwowano mniej wydajną amplifikację fragmentu genu orf138 co sugeruje zmienioną stechiometrię cząsteczek mtdna i możliwość występowania subcząsteczki z genem orf138 na poziomie

9 substechiometrycznym. W przypadku pozostałych 15 populacji nie stwierdzono obecności genu orf138. Wykonane badania potwierdziły przydatność metody Multiplex-PCR w połączeniu z izolacją DNA z nasion do identyfikacji cytoplazmy typu Ogura u rzodkiewki. Wnioski 1. W materiale roślinnym pochodzącym, w większości, z odmian mieszańcowych Raphanus sativus L., występuje gen mitochondrialny orf 138, warunkujący cechę męskiej sterylności. 2. Identyfikacja genu orf 138, w wyniku zastosowania zmodyfikowanej procedury MutiplexPCR, umożliwiła oznaczenie cytoplazmy (S lub N) w niewielkich ilościach tkanki (np. w jednym nasieniu). Wcześniejsze oznaczenie typu cytoplazmy (w nasionach, siewkach, młodych roślinach) pozwala na ograniczenie liczby roślin przeznaczonych do selekcji, a zatem obniża koszt hodowli. 3. Metoda MultiplexPCRw powiązaniu z chowem wsobnym i krzyżowaniem roślin męskosterylnych z płodnymi, pozwoliła na wyodrębnienie pojedynków a następnie linii dopełniających. Bez takich linii niemożliwa jest reprodukcja linii męskosterylnych oraz wykorzystanie ich w produkcji odmian mieszańcowych. 4. Potwierdzono, że linie dopełniające (7, 21,15) nie mają genu orf138 (cytoplazma N) oraz mają recesywny allel genu PPR-B w locus Rfo. 5. Dla wyodrębnienia markerów molekularnych genów restorerów wykorzystano 3 wcześniej opisane markery (SCAR H11-41, M-F24D7.9 i M-F24D7.13) oraz 2 startery RAPD (L06 i Z08) wyodrębnione w wyniku własnych analiz. Analizy powiodły się tylko częściowo i nie można wskazać uniwersalnego markera genu(ów) Rf w badanym materiale. 6. Na podstawie wyników analiz dwóch populacji mapujących można przypuszczać, że w formach rodzicielskich występowało więcej niż dwa geny restorujące. Pierwszym utrudnieniem interpretacji fenotypu jest zróżnicowana ekspresja genów męskiej sterylności w fitotronie i w polu. 7. W analizowanych liniach 7, 15, 21 i 31 (dopełniających) i 24/15 (restorującej) zidentyfikowano złożony locus Rfo, składający się z genów PPR-A, PPR-B i PPR-C. 8. Potwierdzono, że przy użyciu starterów RfoF1R4 można skutecznie amplifikować gen PPR-B wraz z jego sekwencją regulatorową. Referencyjną sekwencję genu PPR-B (AJ ) wykorzystano do porównania z sekwencjami pięciu linii dopełniających i jednej restorującej. 9. W wyniku analiz bioinformatycznych stwierdzono, że w obrębie locus Rfo w liniach własnych wystąpiły znaczne rearanżacje. Wydaje się, że największe zmiany wystąpiły w linii MS 339/7, gdyż zastosowane startery nie umożliwiły amplifikacj żadnego fragmentu locus Rfo (PPR-A, PPR-B, PPRA-B i PPRB-C). 10. Z pięciu pozostałych linii (7, 15, 21, 31 i 24/15) najmniejsze i identyczne zmiany wykazały linie dopełniające (7, 15, 21), które różniły się od wzorca (AJ ) zmianą dwóch aminokwasów w

10 pozycji (DF NL). Dwie identyczne sekwencje nukleotydowe były wcześniej zgłoszone przez innych badaczy GeneBank i zostały opisane jako allele recesywne genu PPR-B. 11. Unikatowe i identyczne zmiany (13 substytucji aminokwasowych, w tym 9 w obrębie pierwszego powtórzenia PPR) zidentyfikowano dla genu PPR-B lini 24/15 i 31. W przypadku linii 31 (dopełniającej) zmiany prawdopodobnie spowodowały utratę funkcji restorującej. Natomiast w przypadku linii 24/15 (restorującej) gen lub geny przywracające płodność istnieją prawdopodobnie poza locus Rfo.