Ćwiczenie 1 Część teoretyczna: I. PODSTAWOWE POJĘCIA 1. Sterylizacja, wyjaławianie Sterylizacja zabicie i usunięcie wszystkich drobnoustrojów, zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnych. Wszystkie mikrobiologiczne badania wykonywane są w warunkach jałowych, dlatego sterylizacji poddaje się szkło laboratoryjne, pożywki, na których hodujemy drobnoustroje, a także pomieszczenia badawcze. 2. Metody sterylizacji: A)TERMICZNE, a) sterylizacja na sucho (suchym gorącem) - wyżarzanie wyjaławianie ezy w płomieniu palnika, przed i po posiewie drobnoustrojów, - opalanie wyjaławianie głaszczek, bagietek szklanych, moździerzy, przez zanurzenie w alkoholu i opalenie płomieniem palnika, - wyjaławianie w suszarce szafka metalowa ogrzewana elektrycznie, zaopatrzona w termometr i termoregulator, służy do sterylizacji szkła laboratoryjnego (odpowiednio umytego) w temperaturze 150ºC przez 2 h lub 170ºC przez 1 h, b) sterylizacja na mokro (mokrym gorącem) - gotowanie temperatura 100 C, nie zabija form przetrwanych, dlatego dodaje się 2% węglan sodu i gotuje przez 10 minut, na ogół niszczy to większość przetrwalników, - sterylizacja w aparacie Kocha metodą tyndalizacji (frakcjonowania) sterylizuje się w nim pożywki poprzez ogrzewanie ich w parze bieżącej o temperaturze 100 C przez okres 30 minut, 3- krotnie w odstępach 24 h, jednokrotne zastosowanie aparatu nie prowadzi do sterylności, ponieważ zabiciu ulegają jedynie formy wegetatywne, ponowne zastosowanie aparatu powoduje ich zabicie, proces ten powtarza się 3 razy, aby na pewno zabić wszystkie formy i uzyskać sterylność, - sterylizacja w autoklawie stosuje się przy jałowieniu pożywek, które mogą być sterylizowane w temperaturze powyżej 100 C, w parze nasyconej i pod zwiększonym ciśnieniem, parametry, które są stosowane to nadciśnienie 1 Atm, temperatura 121-123 C i czas jałowienia 15-40 minut. B) MECHANICZNE (FILTROWANIE), Pożywki płynne, które nie mogą być poddawane działaniu wysokiej temperatury ze względu na skład chemiczny, sterylizuje się poprzez filtrowanie. Zestaw do sączenia składa się z kolby próżniowej z bocznym tubusem, podłączenia do pompy próżniowej i filtru. Rodzaje filtrów: - Berkefelda (ziemia okrzemkowa, B), - Chamberlanda (nie glazurowana porcelana, A), 1
- Seitza (mieszanina azbestu i celulozy, C), - Schotta (sproszkowane szkło, D), - membranowe (estry celulozy, E). C) RADIACYJNE, - promieniowanie UV (gł. 254 nm) stosuje się do sterylizacji pomieszczeń (0,5-2,5 h), - promieniowanie jonizujące, - promienie Rentgena, D) CHEMICZNE, - poprzez zastosowanie preparatu Aldesan, aldehydu glutarowego, chloru, 70% spirytusu, lizolu, mydła, wody utlenionej. 3. Dezynfekcja (odkażanie) proces zabijania form wegetatywnych mikroorganizmów, przez działanie na ich strukturę i przemianę materii, środkami chemicznymi odkażającymi. Stosuje się je tam, gdzie niemożliwe jest zastosowanie wyjaławiania lub wyjaławianie nie jest potrzebne. Środki odkażające mogą działać bakterio i grzybobójczo (zabicie) lub bakterio i mykostatycznie (powstrzymanie ich dalszego rozwoju bez przerywania ich czynności życiowych). Do najczęściej stosowanych środków odkażających należą: - kwasy, zasady, aldehydy, preparaty chlorowe, inne związki utleniające, alkohole, związki fenolowe, sole metali ciężkich, formalina. 4. Pasteryzacja polega na jednorazowym podgrzaniu płynów do temperatury 60-90 C i natychmiastowym schłodzeniu do temperatury 10-20 C. Celem pasteryzacji jest zniszczenie form wegetatywnych drobnoustrojów. Rodzaje pasteryzacji: - niska 65 C, czas 25-30 minut, - wysoka 80-90 C, czas 2-3 minuty, - krótkotrwała 75 C, kilka sekund, - długotrwała 75 C, 30 minut. 2
II. PODSTAWOWA APARATURA MIKROBIOLOGICZNA 1. Urządzenia do jałowienia w wysokiej temperaturze: A) AUTOKLAW (rys. 1): metalowy kocioł podwójne ściany, podwójne dno, szczelna pokrywa, docisk na śruby system grzewczy (elektryczny lub gazowy) przyrządy kontrolne (manometry, termometry, wodowskazy) zawór bezpieczeństwa kurek odpowietrzający czynnik jałowiący przegrzana nasycona para wodna pod zwiększonym ciśnieniem etapy sterylizacji: 1. nagrzewanie 2. sterylizacja właściwa temperatura na stałym poziomie 3. chłodzenie do temperatury otoczenia parametry: temperatura: 110-121 C czas: 15 60 minut (zależy od objętości pożywki) używanie autoklawu wymaga szczególnych zasad ostrożności do jałowienia pożywek, sprzętu itp. B) APARAT KOCHA (aparat Kocha, rys. 2): budowa prostsza niż autoklawu czynnik jałowiący bieżąca para wodna o temp. 100 C do sterylizacji pożywek, które nie mogą być sterylizowane w wyższej temp. czas sterylizacji: 15-60 minut (zależy od objętości i rodzaju materiału) w takich warunkach giną jedynie formy wegetatywne do całkowitej sterylizacji stosuje się tyndalizację (3-krotne ogrzewanie w 100 C) C) SUSZARKI: do prac analitycznych, do jałowienia szkła laboratoryjnego czynnik jałowiący suche, gorące powietrze dla lepszych efektów temperatura: 160-170 C przez 1-2 h swobodny obieg powietrza 3
Rys. 1. AUTOKLAW Rys. 2. APARAT KOCHA 2. Urządzenia do hodowli drobnoustrojów A) TERMOSTAT (CIEPLARKA): urządzenia do hodowli drobnoustrojów na pożywkach utrzymują stałą, określoną temperaturę wewnątrz komór optymalna temperatura bakterie i promieniowce 32 C drożdże i grzyby 28 C B) WYTRZĄSARKI: do hodowli wgłębnej drobnoustrojów w warunkach tlenowych do hodowli dynamicznej posiadają regulowane drgania, mogą być połączone z łaźnią wodną vortexy do pojedynczych prób C) ŁAŹNIE WODNE: do hodowli w probówkach lub kolbkach, krótkotrwałe hodowle łatwiej osiągnąć wymaganą temperaturę D) ANAEROSTATY: do hodowli w warunkach beztlenowych próżnia lub atmosfera gazów obojętnych (N 2, CO 2 ), lub stosując odpowiednie substancje pochłaniające tlen 4
E) WIRÓWKI: różne typy, wielkość, regulowane obroty, praca okresowa lub ciągła do oddzielania komórek mikroorganizmów od pożywki płynnej 3000-4000 obrotów F) SZAFY CHŁODNICZE I ZAMRAŻARKI: do przechowywania kultur komórkowych, jałowych podłoży, roztworów witamin itp. w warunkach chłodniczych G) SZAFY LAMINARNE: umożliwiają zachowanie jałowości, przeprowadzanie różnych prac mikrobiologicznych bez użycia palnika wyposażone w filtr bakteriologiczny, nawiew powietrza 5
H) URZĄDZENIA DO ROZDRABNIANIA PRÓB: homogenizator, stomacher, młynki, rozdrabniacze Stomacher III. POŻYWKI Badanie i obserwacja drobnoustrojów w warunkach sztucznych, laboratoryjnych, jest możliwa dzięki hodowli mikroorganizmów na pożywkach, zwanych inaczej podłożami. Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach pozwala na wyosobnienie czystych kultur, na prowadzenie badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych, diagnostycznych oraz wszelkiego rodzaju hodowli doświadczalnych. Pożywka jest mieszaniną roztworów odpowiednio dobranych składników. Pożywka powinna spełniać następujące warunki: - zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno organicznych, jak i nieorganicznych (energetycznych i budulcowych), - zawierać określone czynniki wzrostowe, - mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne, - zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do tlenu, - wykazywać właściwą temperaturę i ph. Nie ma uniwersalnej pożywki dla wszystkich drobnoustrojów. Podłoża dla autotrofów są nieskomplikowane, zawierają tylko związki mineralne. Heterotrofy mają już większe wymagania, które można zaspokoić dodając kompleksowe substancje np. ekstrakt mięsny, pepton, ekstrakt drożdżowy, brzeczkę. Obecnie na rynku dostępne są gotowe podłoża i składniki do pożywek, w formie odwodnionej lub proszku o wystandaryzowanym składzie (np. firmy BBL, Difco, Oxoid) zapewnia to powtarzalność warunków hodowli, a co za tym idzie pozwala na porównywanie wyników doświadczeń prowadzonych w różnym czasie lub różnych laboratoriach. Ponadto znacznie skraca czas przygotowania do doświadczeń. 6
Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga stosowania składników i związków chemicznych o najwyższym stopniu czystości. Czysta kultura kultura drobnoustrojów wyprowadzona z 1 komórki (monokultura). SKŁADNIKI POŻYWEK DLA HETEROTROFÓW 1. Substancje odżywcze Źródło węgla Najłatwiej przyswajalnym źródłem węgla i energii dla drobnoustrojów są cukry (gł. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza). Dodatek cukru do pożywki może służyć celom diagnostycznym lub wybiórczym, gdyż dany gatunek mikroorganizmów wykorzystuje określony rodzaj cukru. Zawartość cukru w pożywce waha się w ilości 0,5 do 2%. Oprócz cukrów drobnoustroje mogą też wykorzystywać glicerol i mannitol oraz niektóre kwasy organiczne. Źródło azotu Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych (sole amonowe, wodorotlenek amonu, azotany). Jon amonowy stanowi podstawowy związek w przemianach azotowych. Niektóre drobnoustroje mogą pobierać wolny azot atmosferyczny. Poza tym, drobnoustroje czerpią azot również ze związków organicznych, niekiedy bardzo skomplikowanych. Należy tu wymienić przede wszystkim ekstrakty (wyciągi) z tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz różnego typu hydrolizaty białek zwierzęcych i roślinnych. Wszystkie te składniki są dostępne już jako preparaty handlowe, w postaci proszków lub past. Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%. Do źródeł azotu zaliczamy: Ekstrakty mięsne wodne wyciągi z tkanki mięsnej, ale także ekstrakty z serc i wątroby; zawierają one substancje azotowe oraz węglowodany i witaminy rozpuszczalne w wodzie; Ekstrakty drożdżowe obok związków azotu i węgla organicznego są bogatym źródłem witamin z grupy B; Peptony to specyficzne produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka, są bardzo częstym źródłem azotu organicznego w pożywce; zawierają liczne wolne aminokwasy i krótkie łańcuchy peptydowe, pewne witaminy, czasami węglowodany; Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, jaj, nasion soi bogate źródło aminokwasów, jedno z najczęściej wykorzystywanych źródeł azotu organicznego w pożywce; Czyste białka (żelatyna, kazeina) oraz białka rodzime (np. białka jaja, surowicy krwi) opcjonalne źródło azotu wykorzystywane przez bakterie proteolityczne; Wolne aminokwasy czasami dodawane do podłoża. 7
Czynniki wzrostowe Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów syntetycznych witamin (kosztowne) lub w formie wspomnianych wyżej wyciągów mięsnego, wątrobowego i drożdżowego, a także wyciągów roślinnych (sok pomidorowy, brzeczka słodowa, ekstrakt glebowy lub ziemniaczany). Sole mineralne Dodawane do pożywek w niewielkich ilościach, są źródłem składników nieorganicznych: fosforu, siarki, potasu, sodu, magnezu, manganu, żelaza, i in. Drobnoustroje pobierają je w postaci odpowiednich soli, najczęściej KH 2 PO 4, K 2 HPO 4, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaCl, siarczany i chlorki żelaza, magnezu. Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne, np. NaCl, dodawane w ilościach 3-5 g/l pożywki. Inne, np. fosforany potasu, działają buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki. Związki korygujące ph Większość bakterii rośnie w ph obojętnym lub lekko alkalicznym (6,8-7,4). Grzyby preferują środowisko lekko kwaśne (ph 5-6,0). Korektę ph pożywek przeprowadza się najczęściej za pomocą 1-5 M roztworów NaOH i HCl. Substancje różnicujące i wybiórcze Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają pod wpływem mikroorganizmów modyfikacji lub rozkładowi, co uwidacznia się w zmianie barwy kolonii lub podłoża, lub powstaniu strefy przejaśnienia. Czynniki wybiórcze (sole kwasów żółciowych, niektóre barwniki np. zieleń brylantowa, fiolet krystaliczny, związki chemiczne np. azydek sodu) hamują rozwój pewnych grup bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej grupie drobnoustrojów. 2. Czynniki zestalajace Pozwalają one na uzyskanie pożywek w formie stałej. Agar-agar Jest to związek dostępny handlowo w formie proszku lub włókiem, wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Odznacza się właściwościami żelującymi, silnie chłonie wodę i w zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się w temperaturze 90-100ºC, a zestala w 45-48ºC. Chemicznie agar jest polisacharydem galaktonem (zawiera m.in. galaktozę), który nie jest wykorzystywany przez drobnoustroje jako składnik odżywczy, a tylko przez niektóre drobnoustroje może być rozkładany. W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5-3% agaru. Żelatyna Jest to substancja białkowa, z odpadów rzeźnych, która powstaje w wyniku hydrolizy kolagenu, może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne, następuje wówczas upłynnienie pożywki (nie należy przechowywać płytek z takimi hodowlami do góry dnem). Żelatyna upłynnia się w temperaturze 25-27ºC (co pozwala na hodowle w znacznie węższym przedziale temperatur niż agar), a 8
zestala w 18-20ºC, przy czym ogrzewana kilkukrotnie do 100ºC traci własności żelujące. Jako czynnik zestalający pożywkę dodaje się w ilości 12-15%. Inne czynniki zestalające są stosowane rzadko, należą tu m.in. żel krzemionkowy (do pożywek mineralnych dla autotrofów), jaja i surowica krwi (w badaniach specjalnych). RODZAJE POŻYWEK Kryteria podziału pożywek: A) skład chemiczny i pochodzenie składników, B) zawartość składników, C) cel hodowli (zastosowanie i funkcja podłoża), D) konsystencja. 1. Podział w zależności od składu podłoża Naturalne przygotowane wprost z surowca roślinnego lub zwierzęcego, w sposób zapewniający jego jałowość, np. mleko, serwatka, mięso, bulion, brzeczka, owoce i warzywa itp. Do tej grupy zalicza się także podłoża przygotowane z wyciągów naturalnych, w których surowiec zatracił już swoje cechy zewnętrzne (wyciągi i ekstrakty, stanowiące podstawę przygotowania podłoża, np. bulion zwykły, brzeczka słodowa). Syntetyczne wykonane z dokładnie określonych związków chemicznych, o znanym składzie jakościowym i ilościowym. Należą tu podłoża mineralne dla autotrofów. Półsyntetyczne to podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np. mleko z lakmusem, agar ziemniaczany z tiamina. 2. Ze względu na zawartość składników rozróżnia się podłoża Podstawowe (zwykłe) stanowią bazę do przygotowania innych pożywek, np. bulion zwykły, brzeczka. Wzbogacone to podłoża podstawowe wzbogacone dodatkowymi składnikami odżywczymi np. bulion odżywczy, bulion tryptofanowy, agar z krwią itp. Podłoża wzbogacone umożliwiają wzrost większości drobnoustrojów. 3. Ze względu na zastosowanie podłoża dzielimy na: Ogólne stwarzają warunki do wzrostu większości drobnoustrojów, najczęściej są to podłoża na wyciągach naturalnych, np. bulion odżywczy dla bakterii czy brzeczka słodowa dla grzybów. Wybiórcze umożliwiają wzrost określonych grup, podczas gdy wzrost niepożądanych drobnoustrojów zostaje zahamowany na stałe lub częściej okresowo. Przygotowuje się je dodając do pożywki składnik eliminujący daną grupę drobnoustrojów lub usuwając z podłoża składnik odżywczy niezbędny do wzrostu niepożądanej grupy drobnoustrojów. 4. Biorąc pod uwagę funkcję, jaka ma pełnić pożywka wyróżnia się: Namnażające lub namnażająco-wybiórcze stosujemy wówczas, gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka lub poszukiwany drobnoustrój występuje z inną mikroflorą towarzyszącą. Są to zwykle 9
podłoża płynne, np. zbuforowana woda peptonowa dla pałeczek Salmonella, pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek z typu coli, Selektywne zawierają składniki wybiórcze (oprócz składników odżywczych), hamujące wzrost drobnoustrojów przeszkadzających bez wpływu na pożądane, Różnicujące zawierają składniki wpływające na rodzaj wzrostu lub wywołują taką zmianę, która pozwala na zróżnicowanie pomiędzy poszczególnymi grupami (typami) bakterii, często pełnią rolę podłoży wybiórczych i wzbogaconych. Są to podłoża stałe, np. agar z krwią, agar SS, Endo, Testowe służą do oznaczania witamin, aminokwasów i antybiotyków przy pomocy mikroorganizmów; zwykle mają bardzo złożony i specyficzny skład, a testowany czynnik nie występuje w podłożu co jest podstawą oznaczenia, Do oznaczania ilości bakterii, np. w mleku lub w wodzie, Identyfikacyjne (diagnostyczne) na nie przesiewa się kolonie drobnoustrojów z poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację wyizolowanych szczepów w zależności od potrzeb gatunku, rodzaju czy określonej grupy, na podstawie określonych reakcji biochemicznych zachodzących pod wpływem danego mikroorganizmu. Na przykład I szereg identyfikacyjny dla drobnoustrojów z rodzaju Salmonella jest następujący: a) woda peptonowa z tryptofanem b) podłoże z mocznikiem c) podłoże Kliglera d) podłoże z 10% laktozą. 5. Podłoża pod względem konsystencji dzielimy na: Płynne powinny być klarowne, a wiec składniki musza być całkowicie rozpuszczone, np. brzeczka, bulion płynny, Półpłynne z dodatkiem 0,1-0,8% agaru, Stałe zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na płytce Petriego w postaci jednolitej, przejrzystej, gładkiej warstwy bądź też w postaci słupka lub skosu w probówce. Część praktyczna: 1. Posiew metodą odciskową wybranych przez studentów obiektów (szalka Petriego z agarem odżywczym). a) Studenci otrzymują sterylne szalki Petriego (1 szalka na 2 osoby) z zestalonym agarem odżywczym b) praca odbywa się w warunkach sterylnych (30 cm strefa jałowa wokół zapalonego palnika), nie wolno otwierać szalek w warunkach niesterylnych! c) metodą odciskową (przyłożenie obiektu do pożywki i jego odciśnięcie bez naruszenia struktury podłoża) wykonują odcisk wybranych przedmiotów (palce, monety, włosy, itp.) d) po posiewie zamknąć szalki, opisać i odłożyć w wyznaczone miejsce do inkubacji w cieplarce w 32ºC przez 24 godziny. 10