Współczesne możliwości szybkiego diagnozowania gruźlicy

Współczesne możliwości szybkiego diagnozowania gruźlicy Ewa Augustynowicz-Kopeć Zakład Mikrobiologii Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc Warszawa

Czego oczekują klinicyści od laboratoriów prątka? 1. potwierdzenia metodami mikrobiologicznymi podejrzenia klinicznego 2. wykonania badania w najkrótszym czasie wstępną diagnostykę należy zakończyć po 2 dniach (bakterioskopia i badanie genetyczne) 21 dni identyfikacja gatunkowa 30 dni test lekooporności pełną diagnostykę

Zał. nr 1 Wykaz czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA 1) z dnia 25 marca 2014 r. w sprawie biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu, wzorów formularzy zgłoszeń dodatnich wyników badań w kierunku biologicznych czynników chorobotwórczych oraz okoliczności dokonywania zgłoszeń

Różna specyficzność i czułość w wykrywaniu prątkowania chorego Bakterioskopia Jakość próbki plwociny ilość prątków wykrywa około połowy wszystkich przypadków czynnej gruźlicy. mniej przydatny u zakażonych HIV i dzieci 10.000 komórek/ 1ml Hodowla (L-J) Nowoczesne systemy > 1.000 komórek / 1ml > 500 komórek / 1ml min 100 kom żywych Długi czas oczekiwania na wynik Czas generacji prątków 24 h Metody genetyczne w hodowli wykrycie obecność DNA M. tbc lub innych gatunków prątków 50-100 komórek / 1ml

Rekomendacja 3 Pneumonol. Alergol.81,4 2013 Na podstawie wyniku bakterioskopii nie można ani potwierdzić ani wykluczyć rozpoznania gruźlicy w dodatnim rozmazie mogą być obecne prątki środowiskowe. przy dodatnim rozmazie należy wykonać badanie genetyczne czułość metody około 45% wg World Health Organization (2012) Fact Sheet No. 104: Tuberculosis. Geneva: WHO = TB

Co oznacza wynik rozmazu? AFB (-) prątki nie obecne w wystarczającej liczbie, aby być widoczne pod mikroskopem silne podejrzeniu gruźlicy >niż trzy materiały zbierane i testowane w różnych dniach nie świadczy o braku prątkowania mała ilość bakterii potwierdzona hodowlą Chorzy HIV + postacie gruźlicy skąpopratkowe zakażenie spowodowane innym czynnikiem etiologicznym niż prątki Behr MA, Warren SA, Salamon H, et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acidfast bacilli. Lancet1999;353:

AFB + wynik 24 h Chory z aktywną postacią TB obficie prątkujący zalecane wykonanie badania genetycznego pomocne w podejmowaniu decyzji o włączeniu leczenia choremu

Metody genetyczne: mogą znacznie przyspieszyć diagnostykę gruźlicy płuc i postaci pozapłucnych nie powinny nigdy zastępować innych metod powinny być ich uzupełnieniem należy wykonywać je wyłącznie w zamkniętych systemach, wyposażonych w kontrolę procesów amplifikacji Gen-Probe ProbeTec GeneXpert- RNA 4h +opracowanie materiału DNA 6h +opracowanie materiału DNA 2h + R- RMP wstępny test diagnostyczny TB MDR zalecenia WHO PCR (home-made ) brakuje kalibracji nie rekomendowany do gruźlicy wykrywanie obcego DNA

Testy genetyczne Najnowsze testy molekularne są bardzo proste w wykonaniu nie wymagają spełniania kryteriów laboratorium molekularnego Czułość zależna o wyniku AFB i Hodowli Dodatni wynik 95-100% w przypadku pozytywnych AFB i hodowli 40-60% ww przypadku ujemnych wyników AFB i hodowli Khandekar P et al. (1994) Evaluation of PCR based test for the detection of Mycobacterium tuberculosis in coded sputum specimens. Indian J Med Res 100 167 71

RMP- R jako marker MDR -TB wg WHO RMP- R jako marker MDRTB Ale wartość predykcyjna wyniku dodatniego testu przekracza 90% gdy częstość występowania RMP R przekracza 15% co jest rzadkością w skali globalnej wynik pozytywnym wymaga testu potwierdzającego

mutacje rpob Leu533Pro, Leu511Pro, Asp516Tyr i His526Leu -mniej popularne, ich częstość występowania może osiągnąć jednak 10 do 22% Oporność na RMP nie zawsze surogatem oporność MDR Potrzeba szybkich testów na INH Kurbatova EV et all. Rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis: susceptibility to isoniazid and other anti-tuberculosis drugs. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2012 16:355 357

m2000 RealTime System testów w kierunku HIV-1 i MTB na tej samej platformie Abbott Introduces New Molecular Test to Aid in the Diagnosis of Tuberculosis - October 08, 2014

Czy wykonując badania molekularnego nadal musimy używać tradycyjnych metod? bezpośrednio w materiałach wykrywanie obecność M. tuberculosis i markerów genetycznych lekooporności RMP Potwierdzenie AFB + chory poddany leczeniu ALE hodowla i/lub AFB -MOTT -test genetyczny ujemny hodowla - identyfikacja M.tbc, test lekooporności hodowla -epidemiologiczne dochodzenia molekularne, śledzenie transmisji, badanie kontaktów

Jakie są korzyści z badań molekularnych? Szybkość uzyskania wyniku - bezpośrednio z materiału od chorego, szybka identyfikacją szczepu prątków włączenie natychmiastowego leczenia przeciwprątkowego, izolację chorych,zapobieganie transmisji, badanie kontaktów Informacja w postaciach skąpoprątkowych ( gruźlica pozapłucna, u dzieci ) w sytuacji kiedy konwencjonalne testy są ujemne np.z AFB (-) i hodowlą Umożliwiają diagnostykę chorego z podejrzeniem TB w sytuacji, materiał został wysłany tylko na badanie hist pat

RAPORT WHO GRUŹLICA OPORNA NA LEKI 2013 Globalnie, 3,6% chorych TB nowowykrytych i 20,2% wcześniej leczonych ma status MDR-TB Na podstawie danych z 92 krajów zakłada się, że 9,6% przypadków MDR-TB ma postać XDR-TB.

Gruźlica lekooporna MDR i XDR na świecie MDR-TB XDR-TB Federacja Rosyjska Peru Indie Chiny TDR TB Płd. Afryka ~480.000 nowych przypadków MDR TB (3.6%) 45 000 XDR TB 9.6 % wśród MDR TB Raporty z XDR TB 58 krajów (2009r), 77 krajów (2011r),92 krajów w 2013 TDR TB Iran 15 chorych (2009 r), Indie-4 chorych (2012 r) Indie Hospital in Andheri Dziecko z TDR (2013)

Koszt leczenia TB $ 500000 450000 400000 554 000 $ 124000 zmniejszenie wydajności w trakcie leczenia 350000 330000 300000 250000 200000 260 000 $ 126000 bezpośrednie koszty leczenia z uwzględnieniem 150000 100000 134000 Leczenie i diagnostyka Zarządzanie i opieka 50000 0 17000 17 000 $ DS-TB MDR-TB XDR-TB leczenie 6-9 m-cy leczenie20-26 m-cy leczenie 32 m-ce Opieka domowa Hospitalizacja http://www.cdc.gov/nchhstp/newsroom 2015

Testy lekooporności U chorych po raz pierwszy diagnozowanych w kierunku gruźlicy należy wykonać badanie bakterioskopowe, molekularne, posiew na pożywkach płynnych i stałych, identyfikację oraz test lekooporności U chorych ze wznową gruźlicy należy uwzględnić możliwość wystąpienia lekooporności prątków i poza badaniami wymienionymi wykonać molekularny test w kierunku lekooporności Pneumonol. Alergol.81,4 2013 Rekomendacja 8

MDR, XDR Testy lekooporności wykonywane na pożywkach płynnych 5 18 dni (mediana 6,8) L-J 28-54 (mediana 29,1) Szczepy prątków gruźlicy zdiagnozowane w laboratoriach regionalnych muszą być weryfikowane w Krajowym Referencyjnym Laboratorium

GenoType Zestawy do oznaczania lekooporności Lekooporności Mycobacterium tuberculosis complex z uzyskanej hodowli lub próbki klinicznej AFB (+) GenoType MTBDRplus (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na RMP i INH) Czas badania 5 godzin GenoType MTBDRsl (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na fluorochinolony, aminoglikozydy i etambutol) Czas badania 5 godzin

Wyniki badań molekularnych lekooporności potwierdzone konwencjonalnymi metodami Dlaczego?? fenotyp lekooporności niewykrywany przez testy molekularne nie wszystkie mutacje powodujące oporność wykrywane w testach mutacja na zewnątrz regionu badanego inne nieznane mechanizmy oporności niektóre mutacje powodują tzw niskie miano oporności np. chinolony lek może być stosowany w wyższych dawkach Sekwencjonowanie całego genomu -porównanie genomu szczepów lekoopornych i wrażliwych wykrycie nowych mutacji

Zastosowanie testów molekularnych w diagnostyce TB Wykrywanie Lekooporność Identyfikacja Wykrycie obecności prątków gruźlicy w badanym materiale Wykrycie oporności na leki przeciwprątkowe, np. INH, RMP Identyfikacja gatunkowa prątków Celem jest wykrycie sekwencji specyficznych dla M. tuberculosis complex Celem jest wykrycie mutacji odpowiedzialnej za oporność na lek, np. mutacje w rpob oporność na RMP Amplifikacja specyficznych sekwencji dla danego gatunku prątków Pozytywny wynik testu świadczy o obecności prątków M. tuberculosis complex w materiale klinicznym Wykrycie mutacji w danym genie świadczy o oporności prątków na badany lek Identyfikacja do gatunku prątków MOTT oraz w obrębie M. tuberculosis complex Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli Bezpośrednio z materiałów klinicznych lub hodowli

National Institute for Materials Science. "A rapid, paper-based diagnostic test for tuberculosis." ScienceDaily. ScienceDaily, 3 October 2013

Spoligotypowanie = metoda przesiewowa 1 2 3 4 SZCZEPY RÓŻNE 1 2 3 4 SZCZEPY IDENTYCZNE Zastosowanie metody bardziej różnicującej Szczepy różne Szczepy różne Szczepy takie same

Wzór molekularny Beiging leczenie gruźlicy mniej skuteczne wobec szczepów genotypu Beinging nie związane z lekooporności. J Infect Dis. (2010) 201 (4): 553-557. W Europie >80% MDR Konferencja TB PAN-NET Mediolan czerwiec 2014

Dlaczego świat boi się prątków Beijing? Szybko nabywają oporności na leki Większa patogenność Łatwo transmitowane Oporne na działanie mechanizmów obronnych człowieka Namnażają się w makrofagach i monocytach Nieprzewidywalna odpowiedź na leczenie

Płeć Wiek Analiza 106 szczepów Beijing wyizolowanych od chorych w Polsce w latach 2000-2014 Obcokrajowcy (%) Liczba szczepów Polacy (%) Ogółem (%) 42 (40) 64 (60) 106 (100) Mężczyźni 31 (29) 55 (53) 86 (82) Kobiety 11 (10) 9 (8) 20 (18) Dorośli 38 (36) 62 (58) 100 (94) Dzieci (0-14) (troje 0-3 lat) 4 (4) 2 (2) 6 (6) Szczepy lekowrażliwe 11(10) 11(10) 22 (20) Szczepy lekooporne 30 (28) 54 (52) 84 (80) Liczba szczepów MDR 18 (17) 53 (50) 71 (67) Wśród MDR pre-xdr XDR 4 (4) 2 (2) 14 (13) 6 (6) 18 (20) 8 (8)

W Polsce w populacji chorych na gruźlicę typu Beijing dominuje postać oporna na leki p/prątkowe (80%) MDR-TB 42% Pre-XDR-TB - 20% XDR-TB 8% Wszystkie szczepy lekooporne izolowane od chorych na gruźlicę w Polsce należy weryfikować metodami genotypowania w celu określenia ich przynależności do rodziny molekularnej Beijing.

Hist - Pat Ziarniniaki nie są strukturą swoistą dla gruźlicy i mogą występować w innych chorobach jak: mykobakterioza sarkoidoza, chłoniaki bruceloza choroba kociego pazura grzybice ziarniniakowatości Wegenera odczyny na ciało obce Znalezienie ziarniniaków nawet z martwicą nie upoważnia do his-pat rozpoznania tbc

Diagnostyka TB Materiały płucne Materiały pozapłucne Plwocina Wydzielina oskrzelowa Popłuczyny oskrzelowe BAL Popłuczyny żołądkowe Płyn mózgowo-rdzeniowy Płyn z opłucnej Płyn z otrzewnej Płyn z osierdzia Węzły chłonne Tkanki Biopsje Mocz Hodowla Badania genetyczne Materiały histopatologiczne

76 materiałów utrwalonych w parafinie badanych metodą genetyczną 51,3% (39) mat. (+) bad. gen. 48,7% (37) mat. (-) bad. Gen.

Wyniki badań 37 mat. hist.-pat. z barwieniem Z-N 37 mat. 23 mat. Z-N (-) 14 mat. Z-N (+) 5 (22%) mat. 18 (78%) mat. 10 (72%) mat. 4 (28%) mat.t Bad. gen.(+) Bad.gen. (-) bad.gen. (+) bad.gen. (-)

Testy IGRA (Interferon-Gamma Release Assay) T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Abingdon, Wielka Brytania) Quanti FERON-TB GOLD (Cellestis, Carnegie, Australia)

Zasada działania testów IGRA ocena produkcji interferonu γ wydzielanego przez limfocyty T krwi obwodowej po stymulacji swoistymi antygenami ESAT-6 (early secretory antigen target 6) i CFP 10 (culture filtrate protein 10) kodowanymi w regionie RD1 (Region of Difference 1) genomu M.tuberculosis brak go w genomie prątków BCG i w większości prątków środowiskowych z wyjątkiem: M. kansasii, M. szulgai, M. marinum

Możliwość zastosowania testu IGRA T-SPOT.TB do identyfikacji aktywnej postaci gruźlicy z materiałów klinicznych: BALf do diagnostyki gruźlicy płuc płyn z opłucnej postaci pozapłucnej

T-SPOT.TB w diagnostyce gruźlicy płuc i postaci pozapłucnej W literaturze ukazały się publikacje dotyczące wykorzystania testu IGRA z płynów do diagnostyki gruźlicy Jafari C. i wsp. (BALf)/ 3 rozmazy plwociny negatywne Losi M. i wsp. (pł.z opłucnej)/czułość 95% i swoistość 76% Trajman i wsp. czułość 89% i swoistość 97%

Test IGRA T-SPOT.TB 71 chorych w IGiChP w latach 2012 13 71 chorych z krwi obwodowej wykrycie LTBI BALf (55), płynów z opłucnej (16) aktywnej gruźlicy Ilość limfocytów T wydzielających interferon gamma w płynie opłucnowym i BALf oznaczano metodą ELISpot (T-SPOT.TB). Równolegle mat. poddano rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej Podstawę rozpoznania TB stanowiły wynik hodowli płynu z opłucnej lub BALf.

LTBI 71 (71 krwi, 55 BALf i 16 płynów z opłucnej) Aktywna TB 10 + T-SPOT.TB z krwi 10 + T-SPOT.TB z płynów ustrojowych 1 + T-SPOT.TB z pł. z opłucnej 9 + T-SPOT.TB z BALf 1 potwierdzony mikrobiologicznie wyhodowano szczep M. tbc 4 potwierdzone mikrobiologicznie wyhodowano szczep M. tbc

Spoligotypowanie = metoda przesiewowa 1 2 3 4 SZCZEPY RÓŻNE 1 2 3 4 SZCZEPY IDENTYCZNE Zastosowanie metody bardziej różnicującej Szczepy różne Szczepy różne Szczepy takie same

Kontaminacja bronchoskopu Obraz kliniczny PACJENTKA 1 PACJENTKA 2 Zmiany wskazujące na proces gruźliczy Brak zmian Data bronchoskopii 13.05.08 15.05.08 AFB +++ - Sonda genetyczna + + Hodowla + + Lekooporność INH R SM R INH R SM R Analiza molekularna wykazała identyczne wzory molekularne szczepów od obu pacjentek

Zakażenia krzyżowe w laboratorium Nr próbki/ pacjenta Wyniki genotypowania szczepów Spoligotyping MIRU-VNTR A B C D 3774 T4_CEU1 39 352633232433335 3776 T4_CEU1 39 352633232433335 4892 * H1 47 323634233232425 4893 * H1 47 323634233232425 4894 H1 47 323634233232425 7511 T2 52 353625232433538 7512 T2 52 353625232433538 562B T1 53 333634242232125 571 T1 53 333634242232125 573 T1 53 333634242232125

Częstość występowania kontaminacji krzyżowych w Laboratorium Prątka w latach 2011 - czerwiec 2014 Liczba materiałów klinicznych od chorych z podejrzeniem gruźlicy 28.308 Liczba wyhodowanych szczepów / liczba chorych z potwierdzeniem TB 598 szczepów / 408 chorych Liczba przypadków podejrzanych o zakażenie krzyżowe / liczba szczepów 12 przypadków / 26 szczepów Liczba przypadków potwierdzonych / liczba szczepów fałszywych 4 przypadki potwierdzonej kontaminacji / 5 szczepów 0.8%

4 przypadki potwierdzonej kontaminacji krzyżowej Przypadek Nr badania Data posiewu AFB Obfitość/czas wzrostu na pożywce stałej Czas wzrostu na pożywce płynnej Wzór DNA szczepu Wynik analizy A B 3774 +++ +++/15 dni NW 352633232433335 Źródło kontaminacji plwocina 27.05.2011 3776 Materiał - +/13dni NW 352633232433335 p.oskrzelowe skontaminowany 4892 ++ ++/18dni +/7dni 323634233232425 Źródło kontaminacji plwocina 4894 02.08.2012 Materiał Plwocina - +/79dni NW 323634233232425 skontaminowany 7511 p.oskrzelowe - +/18dni +/12dni 353625232433538 Źródło kontaminacji C 15.11.2013 7512 p.oskrzelowe - +/46dni +/19dni 353625232433538 Materiał skontaminowany 562B Plwocina +++ +/18 dni +18dni 333634242232125 Źródło kontaminacji D 571 p.oskrzelowe 23.01.2014 - Brak wzrostu +/19dni 333634242232125 573 p.oskrzelowe - Brak wzrostu +/26dni 333634242232125 Materiał skontaminowany Materiał skontaminowany

Podsumowanie Znalezienie czynnika sprawczego gruźlicy i procesem trudnym i wymaga ścisłej współpracy mikrobiologów z klinicystami Wiarygodność mikrobiologicznej diagnostyki gruźlicy wymaga zastosowania najnowszych metod diagnostycznych i powinna być wykonywana w laboratoriach prątka o najwyższym poziomie referencyjności czas wykonania badania!!!!!!

Podsumowanie W ostatniej dekadzie metody szybkiej diagnostyki TB w tym testy oporności umożliwiły wczesne wykrycie chorego z TB i identyfikację lekoopornej gruźlicy Problemem pozostaje czułość wykrywania gruźlicy u dzieci, zakażonych HIV i postaci pozapłucnych