Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Monika Kozińska 1, Anna Brzostek 2, Dorota Krawiecka 3, Małgorzata Rybczyńska 4, Zofia Zwolska 1, Ewa Augustynowicz-Kopeć 1 1 Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie Kierownik: prof. nadzw. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć 2 Pracownia Genetyki i Fizjologii Mycobacterium, Instytut Biologii Medycznej PAN w Łodzi 3 Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej, Kujawsko-Pomorskie Centrum Pulmonologii w Bydgoszczy 4 Specjalistyczny Szpital Gruźlicy Chorób Płuc i Rehabilitacji w Tuszynie Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach MDR, pre-xdr and XDR drug-resistant tuberculosis in Poland in Praca finansowana z grantu nr R Abstract Introduction: Tuberculosis (TB) is a curable disease and its spread can be prevented by using appropriate diagnostic methods and effective treatment. The obstacle to the rapid eradication of the disease from a population may be strainsresistant to essential and most effective antibiotics. In many places in the world MDR, pre-xdr and XDR-TB was reported. These forms of TB do not respond to the standard six-month treatment with first-line anti-tb drugs and the therapy should be conducted two years or more with drugs that are less potent, more toxic and much more expensive. Material and methods: This study included MDR-TB strains isolated from 297 patients in To determine the XDR-TB population structure, the 19 isolates were genotyped by spoligotyping and MIRU-VNTR (mycobacterial interspersed repetitive units-variable number of tandem repeats) method. Results: Among 297 MDR-TB cases, 36 (12.1%) were pre-extensively drug-resistant (pre-xdr), 19 (6.4%) were XDR and 1 (0.3%) was pre-totally drug-resistant (pre-tdr). Four of the 19 XDR isolates exhibit a unique spoligopattern, while the rest 15 belonged to one of 5 clusters. The MIRU-VNTR analysis reduced the number of clustered isolates to 11. Conclusions: The study documented the emergence of pre-extensively and extensively drug-resistant tuberculosis in Poland among patients with multidrug-resistant TB. Genotyping methods showed clonal similarity among XDR strains and may suggest the possible transmission among patients with newly diagnosed and with recurrent TB. Key words: MDR-TB, pre-xdr-tb, XDR-TB, spoligotyping, MIRU-VNTR Pneumonol. Alergol. Pol. 2011; 79, 4: Streszczenie Wstęp: Gruźlica jest chorobą wyleczalną i można zapobiegać jej rozprzestrzenianiu się, stosując odpowiednie metody diagnostyczne oraz skuteczną terapię. Zagrożeniem dla szybkiej i skutecznej eliminacji choroby z populacji są szczepy oporne na podstawowe i najbardziej skuteczne leki przeciwprątkowe. Coraz częściej szczepy typu MDR nabywają dodatkowej oporności i osiągają postać o oporności pre-xdr oraz XDR. Takie przypadki są już rejestrowane w wielu miejscach na świecie. Gruźlica wielolekooporna jest trudniejsza do wyleczenia niż gruźlica lekowrażliwa. Chorzy nie wracają do zdrowia po zastosowaniu standardowego 6-miesięcznego schematu leczenia, ale muszą być poddani długotrwałej terapii opartej na przyjmowaniu leków mniej skutecznych, bardziej toksycznych i droższych. Materiał i metody: Poddano analizie 297 chorych na gruźlicę, od których w latach wyhodowano szczepy o oporności MDR. Genomowe DNA tych szczepów wykorzystano do analizy molekularnej, w której zastosowano dwie metody genotypowania: spoligotyping oraz MIRU-VNTR. Adres do korespondencji: prof. nadzw. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć, Zakład Mikrobiologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc, ul. Płocka 26, Warszawa, tel./faks: , e.kopec@igichp.edu.pl Praca wpłynęła do Redakcji: r. Copyright 2011 Via Medica ISSN

2 Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach Wyniki: Wśród badanych 297 chorych na gruźlicę MDR zidentyfikowano u 36 chorych (12,1%) na gruźlicę pre-xdr, 19 (6,4%) na gruźlicę XDR i jednego chorego (0,3%) na gruźlicę pre-tdr. Spośród 19 szczepów o oporności XDR 4 posiadały odmienne wzory molekularne w analizie spoligotyping, a 15 szczepów tworzyło 5 grup, z których każda miała charakterystyczny, odrębny spoligotyp. Dalsze typowanie metodą MIRU-VNTR szczepów o oporności XDR wykazało, że można wyodrębnić tylko 3 grupy o tym samym wzorze DNA utworzyło je 11 analizowanych szczepów. Wnioski: Niniejsza praca dowiodła obecności na terenie Polski szczepów o oporności pre-xdr i XDR. Wykorzystane metody typowania wskazały, że wśród 19 szczepów XDR 11 (57,9%) posiadało te same wzory DNA. Wśród chorych, od których wyizolowano jednakowe szczepy prątków, były przypadki wznowy gruźlicy i zachorowania nowe, co może świadczyć o aktywnej transmisji oporności XDR w Polsce. Słowa kluczowe: MDR-TB, pre-xdr-tb, XDR-TB, spoligotyping, MIRU-VNTR Pneumonol. Alergol. Pol. 2011; 79, 4: Wstęp Wyniki badań epidemiologicznych wykazały, że wśród czynników zwiększających ryzyko zakażenia prątkiem gruźlicy lub zachorowania na gruźlicę po zakażeniu są czynniki społeczno-ekonomiczne, w tym przede wszystkim bieda i związane z nią złe warunki mieszkaniowe i niedożywienie, a także bezdomność, uzależnienia (alkohol, papierosy, narkotyki), oraz czynniki biologiczne: podeszły wiek, choroby prowadzące do osłabienia odpowiedzi immunologicznej, leczenie immunosupresyjne. Szczególnie wysokie ryzyko zachorowania na gruźlicę występuje u zakażonych wirusem HIV [1, 2]. Obecnie, mimo dostępności nowoczesnych metod prewencji obejmujących diagnostykę i leczenie, największym niebezpieczeństwem w realizacji programów zwalczania tej choroby jest zjawisko lekooporności prątków. Coraz częściej szczepy typu MDR (multidrug-resistant) nabywają dodatkowej oporności i osiągają postać o oporności pre-xdr (pre-extremely drug-resistant) oraz XDR (extremely drug-resistant) [3, 4]. Definicje gruźlicy wielolekoopornej podano w tabeli 1. Gruźlicę wywołaną przez prątki wielolekooporne należy podejrzewać w każdym przypadku niepowodzenia leczenia standardowego [5, 6]. Przyczyną lekooporności MDR jest monoterapia, spowodowana na przykład dodaniem pojedynczego leku w przypadkach nieskuteczności wcześniejszego leczenia oraz nieregularne, okresowe przyjmowanie leków przeciwprątkowych, co skutkuje zbyt niskim stężeniem poszczególnych leków w tkankach chorego. Stężenia suboptymalne leków przeciwprątkowych uniemożliwiają ich działanie bójcze na populację prątków w zmianach chorobowych, co sprzyja mnożeniu się zmutowanych prątków opornych na działanie tych leków. Obecnie trwają badania, które mają sprawdzić hipotezę, czy pewne wzory molekularne prątków gruźlicy predysponują je do szybszego nabywania mutacji związanych z lekoopornością. Rozprzestrzenianiu się gruźlicy wielolekoopornej na świecie sprzyja imigracja ludności głównie z krajów rozwijających się oraz transmisja Tabela1. Definicje gruźlicy lekoopornej Table 1. Definitions of drug-resistant tuberculosis Oporność Mycobacterium tuberculosis na leki Mycobacterium tuberculosis drug resistance Typ oporności Type of resistance INH + RMP INH + RMP + SM MDR INH + RMP + EMB INH + RMP + SM + EMB MDR + fluorochinolon + jeden z leków podawanych iniekcyjnie (amikacyna lub kanamycyna lub kapreomycyna) XDR MDR + fluoroquinolone + one of the injectable drugs (amikacin or kanamycin or kapreomycin) MDR + fluorochinolon lub MDR + jeden z leków podawanych iniekcyjnie (amikacyna lub kanamycyna lub kapreomycyna) pre-xdr MDR + fluoroquinolone or MDR + one of the injectable drugs (amikacin or kanamycin or kapreomycin) INH + RMP + SM + EMB + fluorochinolon + aminoglikozyd + polipeptyd + tioamid + cykloseryna + kwas paraaminosalicylowy TDR INH + RMP + SM + EMB + fluoroquinolone + aminoglycoside + polypeptide + tioamide + cycloserine + paraaminosalicylic acid) 279

3 Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony w tak zwanych populacjach zamkniętych, do których należą więźniowie, bezdomni, pensjonariusze domów opieki społecznej oraz chorzy zakażeni wirusem HIV [7 12]. Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, World Health Organization) szacuje się, że w 2008 roku na świecie było prawie przypadków zachorowań na gruźlicę wielolekooporną (MDR-TB, multidrug-resistant tuberculosis) co stanowiło około 3,6% wszystkich chorych na gruźlicę. Wśród MDR-TB zarejestrowano 5,4% przypadków gruźlicy z lekoopornością wielolekową o rozszerzonej oporności prątków (XDR-TB, extensively drug-resistant tuberculosis), a obecność szczepów o tej oporności odnotowano do 2009 roku w 58 krajach na świecie. Największy udział w gruźlicy MDR miały kraje nieuprzemysłowione (85% wszystkich chorych MDR-TB), a wśród nich prawie 50% zachorowań miało miejsce w Chinach i Indiach. W grupie szczepów o oporności MDR odnotowano w 2007 roku w Chinach 7,2% szczepów XDR, w 2008 roku w Estonii i Japonii odpowiednio 12,5% i 14,8%, a w 2009 roku 21% w Tadżikistanie [13]. W Polsce pierwszy przypadek z XDR-TB zarejestrowano w 2000 roku [3, 14]. Celem niniejszej pracy była analiza częstości występowania gruźlicy o oporności pre-xdr i XDR w Polsce w latach oraz odpowiedź na pytanie, czy szczepy XDR są transmitowane między chorymi w Polsce. Materiał i metody Badania miały charakter retro- i prospektywny. Programy realizowano według protokołu WHO i obejmowały one ponad chorych na gruźlicę badanych w latach (tab. 2). Poza szczepami ujętymi w tabeli 2, analizie poddano pochodzące od 51 chorych na MDR-TB, otrzymane z laboratoriów regionalnych. Ogółem liczba analizowanych szczepów MDR wynosiła 297. W latach wśród 297 chorych na gruźlicę MDR potwierdzoną mikrobiologicznie wskazano 19 chorych (6,4%) wydalających prątki o oporności XDR i 36 (12,1%) wydalających prątki pre-xdr. Z 55 badanych chorych 9 mieszkało w województwie mazowieckim, po 8 osób w województwie lubelskim, kujawsko-pomorskim i łódzkim, 6 osób w śląskim, 3 osoby w dolnośląskim, 4 osoby w podlaskim, po 2 osoby w województwie podkarpackim, wielkopolskim, lubuskim, warmińskomazurskim, małopolskim i jedna osoba województwie świętokrzyskim. W badanej grupie było 10 kobiet w wieku lat oraz 45 mężczyzn w wieku lat, 52 Polaków i 3 obcokrajowców. Chorych nowo wykrytych było 19, a wcześniej leczonych 36. Wszystkie szczepy należały do gatunku Mycobacterium tuberculosis i wyhodowano je według standardowych metod. Wykonano identyfikację gatunkową metodą chromatograficzną (HPLC, high pressure liquid chromatography) i molekularną (spoligotyping) oraz oznaczono lekooporność [15]. Analiza molekularna metodą spoligotyping oraz MIRU-VNTR (mycobacterial interspersedrepetitive units variable number tandem repeat) objęła 19 szczepów XDR-TB. Metodę spoligotyping opisywano już w poprzednich artykułach, a MIRU- VNTR po raz pierwszy w Polsce zastosowano w niniejszej pracy [16, 17]. Metoda MIRU-VNTR Sekwencje MIRU po raz pierwszy na świecie opisano w 1997 roku, a w roku 2001 zaproponowano ich wykorzystanie do typowania prątków gruźlicy [18, 19]. Typowanie MIRU-VNTR opiera się na identyfikacji 41 wysoce polimorficznych sekwencji mikrosatelitarnych w genomie M. tuberculosis. Każda z sekwencji może występować w kilku lub kilkunastu powtórzeniach w genomie różnych szczepów M. tuberculosis, co daje liczbę przekraczającą Tabela 2. Liczba szczepów wyhodowanych od badanych chorych w ramach trzech programów WHO Drug Resistance Surveillence Table 2. Number of strains isolated from patients covered by the three programs of the WHO Drug Resistance Surveillence Program WHO/WHO program Liczba badanych szczepów Liczba szczepów MDR (%) Number of strains Number of MDR strains (%) (2,4) (1,6) (2,2) Ogółem/Total (2,1) 280

4 Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach potencjalnych kombinacji. W niniejszej pracy wykorzystano analizę 15 najbardziej polimorficznych loci o długości nukleotydów. W 15 reakcjach amplifikacji wykorzystano 15 par sekwencji starterowych komplementarnych do regionów sąsiadujących z sekwencjami MIRU. Produkty polymerase chain reaction (PCR) rozdzielano w 2-procentowych żelach agarozowych w stosunku do wzorca, w celu identyfikacji liczby powtórzeń sekwencji MIRU w poszczególnych loci. Uzyskane wyniki zobrazowano jako układ liczb (kod) reprezentujących liczbę powtórzeń kolejnych sekwencji MIRU [20]. Szczepy wzorcowe M. tuberculosis H 37 Rv oraz M. bovis BCG pochodziły z kolekcji własnej Zakładu Mikrobiologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc. Wyniki Wśród 297 szczepów o oporności MDR zidentyfikowano 36 szczepów pre-xdr (12,1%) oraz 19 szczepów XDR (6,4%). Zestawienie wzorów lekooporności wśród analizowanej puli szczepów przedstawiono w tabeli 3. Wśród szczepów o oporności pre-xdr i XDR dominował wzór oporności na 4 podstawowe leki streptomycynę (SM), izoniazyd (INH), rifampicynę (RMP), etambutol (EMB), odpowiednio 14 (38,9%) i 15 (78,9%) szczepów. Analizując oporność na leki dodatkowe stwierdzono, że w badanej puli szczepów o oporności XDR najliczniejsza grupę stanowiły szczepy oporne na wszystkie 3 leki dodatkowe ofloksacynę (OFL), amikacynę (AMC) i kapreomycynę (CAP) 13 szczepów (68,4%). Wśród szczepów pre-xdr największy odsetek stanowiły szczepy oporne na OFL 23 szczepy (63,7%). Wśród 19 szczepów XDR zidentyfikowano 11 szczepów (58%) opornych na SM, INH, RMP, EMB, OFL, AMC, CAP i przeanalizowano ich wzory oporności na cykloserynę (CS) i etionamid (ETA) leki, na które oporne są szczepy TDR (totally drug resistant). Wyniki przedstawiono w tabeli 4. W badanej puli zidentyfikowano jednego chorego wydalającego prątki oporne na ETA (tab. 4.) Był to chory nowo wykryty, zarejestrowany w Centralnym Rejestrze Gruźlicy w 2000 roku. Nie stwierdzono szczepów opornych na CS. Na dalszych etapach pracy wszystkie szczepy XDR (19) poddano dwuetapowej analizie molekularnej. Pierwszy etap stanowiło typowanie metodą spoligotyping. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 5. Zidentyfikowano 9 spoligotypów. Dwa z nich były nowymi wzorami niezarejestrowanymi dotąd w Spoligotyping Database (SpolDB4) dla 7 wzorów molekularnych znaleziono oznaczenie w rejestrze. Najliczniejsza była rodzina T1 1558, do której należało 5 szczepów (26,3%). Do rodziny T4_CEU1 39 należały 4 szczepy, a do rodziny Beijing 1, T1 53 oraz H3 180 po 2 szczepy (10,5%). Zidentyfikowano również po jednym szczepie w rodzinie molekularnej U(likelyH) 46, T3 442 oraz w dwóch nowych rodzinach niezarejestrowanych w bazie SpolDB4. Następnie wszystkie szczepy o oporności XDR poddano analizie molekularnej MIRU- VNTR. Wyniki przedstawiono w tabeli 6. Zidentyfikowano 11 różnych wzorów DNA. Analiza wykluczyła pokrewieństwo molekularne dla 8 szczepów XDR (42,4%). W grupie tej były dwa szczepy Beijing 1 jeden z nich wyizolowany od obcokrajowca z województwa mazowieckiego, a drugi od Polaka mieszkającego w województwie Tabela 3. Analiza wzorów lekooporności szczepów XDR oraz pre-xdr wyhodowanych od chorych w Polsce w latach Table 3. Analysis of patterns of drug resistance XDR and pre-xdr strains isolated from patients in Poland in Oporność na leki dodatkowe Oporność na leki podstawowe/liczba szczepów (%) Ogółem Additional drug resistance Primary drug resistance/number of strains (%) Total S + I + R + E S + I + R I + R + E I + R pre-xdr O 11 (30,5) 5 (13,8) 2 (5,6) 5 (13,8) 23 (63,7) A 1 (2,8) 4 (11,1) 0 3 (8,4) 8 (22,3) K 1 (2,8) 1 (2,8) (5,6) 36 A + K 1 (2,8) 2 (5,6) (8,4) XDR O + A 4 (21) 0 1 (5,3) 0 5 (26,3) O + K (5,3) 1 (5,3) 19 O + A + K 11 (57,8) 2 (10,6) (68,4) Ogółem Total R szczep lekooporny/drug-resistant strain S szczep lekowrażliwy/drug-sensitive strain 281

5 Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony Tabela 4. Analiza wzorów oporności na leki dodatkowe wśród 11 szczepów XDR opornych na SM, INH, RMP i EMB Table 4. Analysis of patterns of additional drug resistance among 11 XDR strains resistant to SM, INH, RMP and EMB L.p. Rok wyhodowania szczepu N * /W ** Oporność na leki dodatkowe Date of culture Additional drugs resistance OFL AMC CAP ETA CS N R R R R S N R R R S S W R R R S S W R R R S S W R R R S S W R R R S S W R R R S S W R R R S S N R R R S S W R R R S S W R R R S S *N chory nowo wykryty/patient newly detected **W chory wcześniej leczony/patient previously treated S streptomycyna; I izoniazyd; R rifampicyna; E etambutol; O ofloksacyna; A amikacyna; K kapreomycyna Objaśnienia pozostałych skrótów w tekście/other abbreviations in the text Tabela 5. Spoligotypy 19 szczepów XDR Table 5. Spoligotypes of 19 XDR strains L.p. Spoligotyp Liczba szczepów (%) Spoligotype Number of strains (%) 1 T (26,3) 2 T4_CEU (21,0) 3 T (10,5) 4 H (10,5) 5 Beijing 1 2 (10,5) 6 U(likelyH) 46 1 (5,3) 7 T (5,3) (5,3) (5,3) 19 (100) lubelskim, dwa szczepy z rodziny T1 53 wyizolowane od Polaków z województwa podkarpackiego, szczep U(likelyH) 46, szczep T3 442, szczep o spoligotypie oraz jeden z 4 szczepów należących do rodziny T4_CEU1 39. Dla pozostałych 11 szczepów stwierdzono 3 wzory MIRU-VNTR. Najliczniejszą rodzinę molekularną tworzyło 6 szczepów (31,6%) posiadających kod numeryczny Wśród nich 5 (26,3%) prezentowało spoligotyp T1 1558, a jeden szczep (5,3%) posiadał spoligotyp nierejestrowany dotąd w bazie SpolDB4. Trzy szczepy z rodziny T4_CEU1 39 miały wzór , a dwa szczepy należące do rodziny H3 180 posiadały wzór Zestawienie wzorów molekularnych i fenotyp oporności szczepów w trzech zidentyfikowanych grupach chorych przedstawiono w tabeli 7. Od 2 chorych z grupy A wyizolowano szczepy należące do rodziny molekularnej H Chorzy zamieszkiwali województwo mazowieckie i dolnośląskie. Jeden z nich był wcześniej leczony z powodu gruźlicy w 2004 roku, z kolei drugi, nowo wykryty, zachorował po raz pierwszy w 2007 roku. Szczepy wyizolowane od nich miały identyczne profile molekularne i wzory oporności. W grupie B było 3 mieszkańców województwa łódzkiego, 2 z nich było wcześniej leczonych, jeden chory był nowo wykryty. W 2008 roku od każdego z tych chorych wyizolowano prątki o tym samym wzorze molekularnym i fenotypie lekooporności. Grupę C stanowiło 6 chorych z województwa kujawsko-pomorskiego. Najwcześniejsza rejestracja pochodziła z 2000 roku, 3 z 2007 roku i 2 z 2008 roku. Trzech chorych było zarejestrowanych jako nowo wykryci, a 3 jako wcześniej leczeni. Prątki izolowane od tych chorych miały identyczne profile DNA i wzory oporności, z wyjątkiem szczepu C3 wrażliwego na EMB i szczepu C2 wrażliwego na CAP. 282

6 Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach Tabela 6. Wzory MIRU-VNTR 19 szczepów XDR Table 6. MIRU-VNTR patterns of 19 XDR strains L.p. Wzór MIRU-VNTR Spoligotypy szczepów posiadających ten sam wzór MIRU-VNTR Liczba szczepów (%) MIRU-VNTR pattern Spoligotypes of strains clustered in MIRU-VNTR analysis Number of strains (%) T (26,3) (5,26) T4_CEU (15,80) H (10,53) Beijing 1 1 (5,3) Beijing 1 1 (5,3) T (5,3) T (5,3) U(likelyH) 46 1 (5,3) T (5,3) (5,3) T4_CEU (5,3) 19 (100) Tabela 7. Dane epidemiologiczne, wzory molekularne i fenotyp oporności szczepów M. tuberculosis w trzech grupach chorych, wśród których stwierdzono transmisję gruźlicy Table 7. Epidemiological data, molecular patterns and resistance phenotypes of M. tuberculosis strains isolated from patients belonging to epidemiological groups Grupa chorych Group of patients A B C Chory/Patient N*/W** W N W W N N N W W W W Województwo Dolno- Mazo- Łódzkie Kujawsko-pomorskie Province śląskie wieckie Rok hodowli Date of culture Spoligotyp H3 180 T4_CEU1 39 T Spoligotype Wzór MIRU-VNTR MIRU-VNTR pattern Lekooporność na leki podstawowe SM R INH R RMP R EMB R SM R INH R RMP R EMB R SM R INH R RMP R EMB R*** Primary drug resistance Lekooporność na leki dodatkowe OFL R AMC R CAP S OFL R AMC R CAP R OFL R AMC R CAP R **** Additional drug resistance *N chory nowo wykryty/patient newly detected **W chory wcześniej leczony/patient previously treated ***Szczep C3 wrażliwy na EMB/C3 strain sensitive to EMB ****Szczep C2 wrażliwy na CAP/C2 strain sensitive to CAP 283

7 Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony Dyskusja Z problemem gruźlicy lekoopornej zmagają się te kraje, gdzie między innymi trudne warunki społeczno-ekonomiczne, niepoprawna diagnostyka chorych, niewłaściwe schematy leczenia oraz koincydencja z zakażeniem wirusem HIV ograniczają eliminację choroby ze społeczeństwa. Wczesne wykrycie i zdiagnozowanie chorych na tę postać gruźlicy umożliwia włączenie odpowiedniego zestawu leków oraz zapobiega transmisji szczepów lekoopornych w środowisku [21 24]. Analiza lekooporności szczepów MDR wyizolowanych w Polsce w latach pozwoliła na ocenę sytuacji epidemiologicznej chorych na gruźlicę o oporności XDR i pre-xdr. W grupie 297 chorych na gruźlicę MDR stwierdzono 19 XDR i 36 pre-xdr. Pierwszy przypadek XDR-TB został zarejestrowany w 2000 roku i od tego czasu, jak wykazała niniejsza analiza, co roku w Polsce zwiększała się liczba chorych nowo wykrytych i wcześniej leczonych z tą postacią gruźlicy [25]. W 2004 roku zidentyfikowano dwa szczepy XDR, w 2005 i w 2006 roku po jednym, w 2007 roku 4 szczepy, w 2008 roku 8 i w 2009 roku kolejne 2 szczepy. Wśród 19 chorych na XDR-TB zarejestrowanych w Polsce w latach dominowała oporność na 4 leki podstawowe zidentyfikowano 15 chorych (78,9%). W tej grupie 13 chorych (68,4%) wydalało prątki oporne jednocześnie na OFL i CAP. Analiza oporności szczepów XDR na leki dodatkowe wykazała, że w Polsce nie zarejestrowano dotychczas chorego z gruźlicą TDR jednak w puli 11 szczepów XDR opornych na 4 podstawowe leki SM, INH, RMP i EMB, które warunkują oporność TDR, zidentyfikowano jeden szczep XDR oporny dodatkowo na ETA. W związku z tym można określić go szczepem o oporności pre-tdr. Zidentyfikowany szczep był wrażliwy na cykloserynę warunkującą w połączeniu z ETA i kwasem paraaminosalicylowym (PAS, para-aminosalicylic acid) oporność TDR. Jak dotąd, w Polsce nie zarejestrowano oporności na CS, a PAS nie jest lekiem stosowanym w testach oporności. Wśród analizowanych 19 szczepów XDR stwierdzono brak krzyżowej oporności między RMP. Dziesięć szczepów (53%) było jednocześnie opornych na RMP i ryfabutinę, 9 szczepów (47%) było wrażliwych na ryfabutinę, ale nie wykazywało oporności na RMP. Takie dane odpowiadają doniesieniom opartym na badaniach O Brien oraz badaniach przeprowadzonych w Polsce przez Augustynowicz-Kopeć [25 27]. Analiza wzorów oporności ujawniła, że od 2 chorych wyhodowano w różnym czasie po 2 szczepy prątków gruźlicy o różnych wzorach oporności. W pierwszym przypadku była to 40-letnia kobieta, od której w 2004 roku wyizolowano szczep pre-xdr, a w 2008 szczep XDR, natomiast drugi chory 75-letni mężczyzna, od którego w 2008 roku wyhodowano szczep pre-xdr, a w 2009 XDR. Analiza molekularna szczepów wykazała, że prątki izolowane od chorych w różnym czasie i o różnych wzorach oporności, posiadały identyczne wzory DNA. Tym samym można stwierdzić, że w obu przypadkach przyczyną wznowy choroby był ten sam szczep M. tuberculosis, który w trakcie leczenia zmienił fenotyp lekooporności. Szczep wyizolowany od chorej w 2004 roku był oporny na INH, RMP, OFL i był typem pre-xdr, a szczep wyizolowany od tej chorej w 2008 był szczepem o oporności XDR. Szczep wyizolowany od drugiego chorego w 2008 roku był typem pre-xdr opornym na SM, INH, RMP, AMC i CAP, a rok później był szczepem o oporności XDR. Przykładem ponownego zachorowania na gruźlicę spowodowanego zakażeniem egzogennym jest chory z województwa kujawsko-pomorskiego. Po raz pierwszy był on zarejestrowany w 2001 roku jako chory nowo wykryty, wydalający szczep wrażliwy na wszystkie leki. Ponownie podjęto u niego leczenie w styczniu 2008 roku. Wyniki badań mikrobiologicznych potwierdziły lekowrażliwość szczepu taką samą jak w 2001 roku. Ponieważ stan kliniczny chorego po włączeniu leczenia nie poprawiał się, a wyniki mikrobiologiczne, bakterioskopia i posiewy dawały pozytywne wyniki, wykonano ponownie test lekooporności w kwietniu 2008 roku i na jego podstawie zidentyfikowano XDR-TB. Analiza wzorów DNA szczepów wyhodowanych w styczniu i kwietniu 2008 roku wykluczyła ich pokrewieństwo molekularne i wykazała, że doszło do zakażenia egzogennego prątkami o oporności XDR i rozwoju nowej postaci gruźlicy. Dochodzenie epidemiologiczne ujawniło, że w tym samym czasie w szpitalu, w sali obok, przebywał pacjent wydalający prątki o oporności XDR z takim samym fenotypem oporności. Wyniki badań genetycznych potwierdziły, że szczepy te były identyczne. Biorąc pod uwagę bliski kontakt oraz podobieństwo genetyczne wyhodowanych szczepów, można przypuszczać, że doszło do transmisji gruźlicy XDR między chorymi. Te dwa przykłady wskazują na praktyczne zastosowanie molekularnych badań epidemiologicznych. Poprzez genotypowanie szczepów prątków wykazano, że kolejne zachorowanie na gruź- 284

8 Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach licę nie zawsze jest wynikiem endogennej reaktywacji choroby. Chory na gruźlicę w przeszłości może zachorować kolejny raz w wyniku nowego zakażenia innym szczepem prątków, czyli z przyczyny egzogennej [28]. Jak w sytuacji ponownego zachorowania spowodowanego szczepem o nowym wzorze molekularnym zdefiniować przypadek dla celów rejestracji? Czy jest to chory nowo wykryty czy chory wcześniej leczony? Jeżeli pod uwagę wziąć częstotliwość rejestracji z powodu zachorowania na gruźlicę, wówczas będzie to chory wcześniej leczony. Z kolei biorąc pod uwagę fakt, że zachorowanie nastąpiło na skutek zakażenia innym szczepem w opisanym przypadku szczepem o oporności XDR jest to lekooporność pierwotna, a w związku z tym chory jest pacjentem nowo wykrytym. Niniejsza analiza posłużyła do określenia skali zjawiska rozprzestrzeniania się szczepów lekoopornych oraz wskazała na prawdopodobieństwo ich transmisji wśród chorych w Polsce. Typowanie molekularne prątków jest jednym z podstawowych narzędzi identyfikujących zjawisko transmisji gruźlicy w populacji. Najbardziej narażone na zachorowanie są osoby przebywające w otoczeniu chorego, przede wszystkim mieszkające razem i utrzymujące z nim częste kontakty. Istnieje wiele doniesień o udowodnionej transmisji gruźlicy w małych społecznościach, takich jak wiezienia, domy opieki społecznej, przedszkola i szkoły [29 32]. Literatura opisuje zjawisko transmisji między personelem szpitala a pacjentami, a także między osobami podróżującymi środkami komunikacji publicznej i w środowisku osób bezdomnych [33, 34]. Jeżeli w wymienionej populacji znajduje się osoba prątkująca, wówczas może dojść do rozprzestrzeniania się źródła zakażenia. Dlatego ważne jest, aby podjąć odpowiednie kroki w celu identyfikacji wszystkich chorych i jak najszybciej przerwać łańcuch transmisji. Podobieństwo szczepów obserwuje się nie tylko wśród ludzi pozostających ze sobą w bliskich kontaktach, ale również u chorych bez udowodnionych epidemiologicznych powiązań [35, 36]. W takiej sytuacji prześledzenie drogi, jaką rozprzestrzeniało się źródło zakażenia jest bardzo trudne. Jedynym wiarygodnym dowodem transmisji jest wynik molekularnej analizy epidemiologicznej wskazujący na identyczność wzorów DNA wyhodowanych szczepów. Aby pewnie wskazać genetyczne pokrewieństwo prątków stosuje się wystandaryzowane metody typowania o wysokim potencjale dyferencyjnym [37 40]. Niniejsza praca jest przykładem takiej analizy. Molekularne dochodzenie epidemiologiczne przeprowadzone w niej pozwala przypuszczać, że w badanych 3 grupach chorych mogło dojść do niedawnej transmisji gruźlicy XDR lub w przeszłości źródło zakażenia w poszczególnych grupach było wspólne. W grupie dwóch chorych wydalających prątki należące do rodziny H3 180, jeden chory wcześniej leczony został zidentyfikowany w 2004 roku, a chory nowo wykryty w 2007 roku. Nie udało się ustalić, czy chorzy kontaktowali się ze sobą i czy istnieje pomiędzy nimi jakieś powiązanie epidemiologiczne. Nic również nie wiadomo o ewentualnym wspólnym źródle zakażenia. Mimo to nie można wykluczyć transmisji gruźlicy między tymi chorymi. W drugiej grupie chorych, od których izolowano prątki o tym samym profilu DNA byli 3 mieszkańcy województwa łódzkiego, jeden chory nowo wykryty w 2008 roku z gruźlicą XDR i dwóch chorych wcześniej leczonych jeden wykryty w 2005 roku, wydalający prątki wrażliwe na wszystkie leki, a w 2008 roku z gruźlicą o oporności XDR, a drugi w 2006 roku z gruźlicą MDR i w 2008 roku z gruźlicą XDR. W 2008 roku od każdego z tych chorych wyizolowano prątki o tych samych wzorach molekularnym i lekooporności. Na podstawie wywiadu ustalono, że w 2008 roku chorzy byli hospitalizowani w tym samym czasie w jednym z łódzkich szpitali i prawdopodobnie tam doszło do transmisji szczepu prątków z opornością XDR. Z analizy wzorów lekooporności wynika, że źródłem zakażenia mógł być chory wydalający prątki MDR w 2006 roku, który na skutek przerwania leczenia w 2008 roku wydalał prątki o oporności XDR. Trzecią grupę epidemiologiczną stanowiło 6 chorych z województwa kujawsko-pomorskiego. Najwcześniej zarejestrowany chory pochodził z 2000 roku, kolejnych 3 zachorowało po raz pierwszy w 2007 roku, a 2 w 2008 roku. Trzy osoby były już wcześniej leczone, a 3 osoby należały do grupy chorych nowo wykrytych. Szczepy prątków izolowane od tych chorych miały identyczne profile DNA. Nie udało się ustalić, czy chorzy mogli mieć ze sobą kontakt i czy zaistniały okoliczności sprzyjające transmisji prątków między nimi. Mimo to, podobnie jak w pierwszej badanej grupie, nie można wykluczać zjawiska transmisji. Przeprowadzona w pracy analiza molekularna posłużyła do wskazania potencjalnych grup epidemiologicznych wśród chorych na gruźlicę wielolekooporną oraz pozwoliła ocenić przydatność zastosowanych metod. W analizie posłużono się dwiema metodami genotypowania w pierwszym etapie zastosowano spoligotyping, a w drugiej kolejności MIRU-VNTR. 285

9 Pneumonologia i Alergologia Polska 2011, tom 79, nr 4, strony Na podstawie doniesień z literatury światowej uważa się, że spoligotyping jest metodą przesiewową i wymaga uzupełnienia o dodatkowe typowanie metodą pozwalającą zróżnicować profile DNA szczepów o tym samym spoligotypie. Do takich metod zalicza się między innymi analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP, restriction fragment length polymorphism) oraz MIRU-VNTR [37, 38]. Wyniki licznych badań przeprowadzonych w ostatnich latach wykazały, że analiza epidemiologiczna szczepów M. tuberculosis metodą MIRU- VNTR jest równie skuteczna jak analiza RFLP, a w przypadku szczepów zawierających niewielką liczbę kopii IS6110 (insertion sequence 6110) posiada wyższy potencjał różnicujący. Metoda ta jest znacznie tańsza i mniej pracochłonna w porównaniu z RFLP, a do jej przeprowadzenia wystarcza niewielka ilość DNA [39]. Typowanie metodą spoligotyping pozwoliło na identyfikację wśród 19 szczepów XDR 5 rodzin molekularnych (spoligotypów), do których należało 15 szczepów. Z kolei analiza MIRU-VNTR zredukowała liczbę szczepów o podobnych wzorach DNA do 11 i wskazała ich przynależność do 3 rodzin o charakterystycznym kodzie MIRU. Taki wynik świadczy o przesiewowym charakterze typowania metodą spoligotyping i wskazuje na konieczność uzupełnienia dochodzeń molekularnych metodą o wyższym potencjale różnicującym, która może posłużyć do analizy szczepów o tych samych spoligotypach [37, 38]. Wnioski 1. Na podstawie analizy oporności szczepów wyizolowanych od 297 chorych na MDR-TB wskazano 19 chorych (6,4%) wydalających prątki XDR i 36 chorych (12,1%) wydalajacych prątki pre-xdr. 2. W badanej populacji nie stwierdzono chorych na gruźlicę wydalających prątki o wzorze oporności TDR. 3. Analiza molekularna pozwoliła na identyfikację wśród chorych na XDR-TB trzech potencjalnych grup epidemiologicznych. Podobieństwo molekularne szczepów wyhodowanych od chorych w poszczególnych grupach może świadczyć o prawdopodobnej transmisji gruźlicy lub wspólnym źródle zakażenia. Piśmiennictwo 1. Davies P.D. Risk factors for tuberculosis. Monaldi. Arch. Chest Dis. 2005; 63: Kolappan C., Gopi P.G., Subramani R., Narayanan P.R. Selected biological and behavioural risk factors associated with pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2007; 11: Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs worldwide, MMWR Morb. Mortal Wkly Rep. 2006; 55: Valayati A., Masjedi M. Emergence of new forms of totally drugresistant tuberculosis bacilli. Chest 2009; 136: Mahmoudi A., Iseman M.D. Pitfalls In the care of patients with tuberculosis. Common errors and their association with the acquisition of drug resistance. JAMA 1993; 270: Sharma S.K., Turaga K.K., Balamurugan A. i wsp. Clinical and genetic risk factors for the development of multi-drug resistant tuberculosis in non-hiv infected patients at a tertiary care center in India: a case-control study. Infect. Genet. Evol. 2003; 3: Casal M., Vaquero M., Rinder H. i wsp. A case-control study for multidrug-resistant tuberculosis: risk factors in four European countries. Microb. Drug Resist. 2005; 11: Faustini A., Hall A.J., Perucci C.A. Risk factors for multidrug resistant tuberculosis in Europe: a systematic review. Thorax 2006; 61: Centers for Disease Control and Prevention Trends in tuberculosis United States MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2008; 57: Gilad J., Borer A., Riesenberg K., Peled N., Schlaeffer F. Epidemiology and ethnic distribution of multidrug-resistant tuberculosis in Southern Israel : the impact of immigration. Chest 2000; 117: Hersi A., Elwood K., Cowie R., Kunimoto D., Long R. Multidrug-resistant tuberculosis in Alberta and British Columbia Can. Respir. J. 1999; 6: Lomtadze N., Aspindzelashvili R., Janjgava M. i wsp. Prevalence and risk factors for multidrug-resistant tuberculosis in the Republic of Georgia: a population-based study. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2009; 13: WHO Multidrug and extensively drug-resistan TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response. Geneva, Switzerland: World Health Organization. WHO/HTM/ /TB/ Augustynowicz-Kopeć E., Zwolska Z. Gruźlica wywołana prątkami o oporności XDR w Polsce. Badania mikrobiologiczne i molekularne. Pneumonol. Alergol. Pol. 2007; 75: Zwolska Z., Augustynowicz-Kopeć E., Klatt M. Pierwotna i nabyta lekooporność prątków gruźlicy w Polsce. Pneumonol. Alergol. Pol. 1999; 67: Warren R., Streicher E., Chjaralambous S. Use of spoligotyping for accurate classification of recurrent tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: Augustynowicz-Kopeć E., Jagielski T., Kozińska M., Zabost A., Zwolska Z. The significance of spoligotyping method in epidemiological investigations of tuberculosis. Pneumonol. Alergol. Pol. 2007; 75: Supply P., Magdalena J., Himpens S., Locht C. Identification of novel intergenic repetitive units in a mycobacterial two-component system operon. Mol. Microbiol. 1997; 26: Supply P., Lesjean S., Savine E., Kremer K., van Soolingen D., Locht C. Automated high-throughput genotyping for study of global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: Alonso-Rodriguez N., Martinez-Lirola M., Herranz M. Evaluation of new advanced 15-loci MIRU-VNTR genotyping tool in Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology studies. BMC Microbiology 2008; 8; Banerjee R., Allen J. Extensively drug-resistant tuberculosis in California, Clin. Infect. Dis. 2008; 47:

10 Monika Kozińska i wsp., Gruźlica lekooporna typu MDR, pre-xdr i XDR w Polsce w latach Kwon Y., Kim Y., Suh G. Treatment outcomes for HIV-uninfected patients with multidrug-resistant and extensively drug- -resistant tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 2008; 47: Mitrzyk B. Treatment of extensively drug-resistant tuberculosis and role of the pharmacist. Pharmacotherapy 2008; 28; Cox H., McDermid Ch. XDR tuberculosis can be cured with aggressive treatment. Lancet 2008; 372: Augustynowicz-Kopeć E. Gruźlica lekooporna w Polsce. Analiza epidemiologiczna, mikrobiologiczna i genetyczna. Rozprawa habilitacyjna. Akademia Medyczna w Warszawie, Warszawa O Brien R., Lyle M., Snider D. Jr. Rifabutin (ansamycin LM427): a new rifamycin-s derivative for the treatment of mycobacterial diseases. Rev. Infect. Dis. 1987; 9: Zwolska Z, Augustynowicz-Kopeć E., Klatt M. Primary and acquired drug resistance in Polish tuberculosis patients: results of a study of the national drug resistance surveillance programme. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000; 4: Feng Z., Castillo-Chavez C., Capurro A. A model for tuberculosis with exogenous reinfection. Theor. Popul. Biol. 2000; 57: Baussano I., Williams B.G., Nunn P., Beggiato M., Fedeli U., Scano F. Tuberculosis inciedence in prisons: a systematic review. PloS Med. 2010; 7: Askew G.L., Finelli L., Hutton M. i wsp. Mycobacterium tuberculosis transmission from pediatrician to patients. Pediatrics 1997; 100: Puneet K., Dewman., Banouvong H. i wsp. A tuberculosis outbreak in a private-home family child care center in San Francisco Pediatrics 2006; 117: Kumar S., Radhakrishna, Chadha V.K. i wsp. Prevalence of tuberculous infection among school children in Kerala. Indian J. Tuber. 2009; 56: Moore M., Valway S.E., Ihle W., Onorato I.M. A train passenger with pulmonary tuberculosis: evidence of limited transmission during travel. Clin Infect. Dis. 1999; 28: Lofy K.H., Mc Elroy P.D., Lake L. i wsp. Outbreak of tuberculosis in a homeless population involving multiple sites of transmission. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2006; 10: Afanas ev M.V., Ikryannikova L.N., Il ina E.N. i wsp. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis circulated in Moscow, Russian Federation. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011; 30: Parissa-Farnia, Masjedi M.R., Varahram M. i wsp. The recent-transmission of Mycobacterium tuberculosis strains among Iranian and Afghan relapse cases: a DNA-fingerprinting Rusing RFLP and spoligotyping. BMC Infect. Dis. 2008; 8: Sola C., Filliol I., Legrand E. i wsp. Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics. Infect. Genet. Evol. 2003; 3: Kwara A., Schiro R., Cowan L. i wsp. Evaluation of the epidemiologic utility of secondary typing methods for differentiation of Mycobacterium tuberculosis isolates. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: Cowan L., Mosher L, Diem L, Massey J., Crawford J. Variablenumber tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110 by using mycobacterial interspersed repetitive units. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: Allix-Béguec C., Harmsen D., Weniger T., Supply P., Niemann S. Evaluation and strategy for use of MIRU-VNTRplus, a multifunctional database for online analysis of genotyping data and phylogenetic identification of Mycobacterium tuberculosis complex isolates. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: