WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNE TŁUSZCZÓW 1. Rozpuszczalność barwników w tłuszczach Substancje podobne pod względem budowy chemicznej do tłuszczów, tj. związki, których drobiny nie mają wcale lub posiadają niewiele grup hydroksylowych, są dobrze rozpuszczalne w tłuszczach. Barwnik o dużej masie cząsteczkowej Sudan III, stosowany do wybarwiania tłuszczu w preparatach histologicznych, zawiera tylko jedną grupę hydrofilową i długi, niepolarny łańcuch węglowodorowy dzięki temu jest dobrze rozpuszczalny w tłuszczach. Wykonanie: Do 2 ml wody dodać nieco barwnika Sudan III. Barwnik nie rozpuszcza się. Wprowadzić następnie 0,5 ml oleju i zmieszać zawartość probówki. Barwnik rozpuszcza się. 2. Zmydlanie tłuszczów Tłuszcze jako estry łatwo ulegają hydrolizie, dając w zależności od czynnika wywołującego hydrolizę różne produkty. Jeżeli hydroliza zachodzi pod wpływem pary wodnej, powstaje glicerol i mieszanina kwasów tłuszczowych. Jeżeli natomiast czynnikiem powodującym hydrolizę są alkalia lub węglany potasowców, wówczas nie otrzymuje się wolnych kwasów tłuszczowych lecz ich sole, czyli mydła oraz glicerol. Wykonanie: W parowniczce porcelanowej ogrzać około l g smalcu. Dodać następnie l,5 ml 30% roztworu NaOH, potem l ml etanolu i mieszać, ogrzewając łagodnie, aż do utworzenia się jednolitej masy (mydła). Do otrzymanego mydła wprowadzić 40 ml wrzącej wody i ogrzewać do całkowitego rozpuszczenia się mydła. a) Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego Mydła w zależności od rodzaju wchodzącego w ich skład metalu dzielą się na rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie. Sole baru, wapnia i ołowiu (metali dwuwartościowych) w przeciwieństwie do sodu i potasu (metali jednowartościowych) nie rozpuszczają się w wodzie - tworzą mydła nierozpuszczalne. Wykonanie: Do probówek zawierających po 2 ml roztworu mydła wprowadzić kroplami 1% roztworu CaCl 2. Wytrąca się osad mydła, który nie rozpuszcza się po dodaniu wody. b) Wysalanie mydła Micele koloidowe mydła utrzymują się w roztworze dzięki ochronnemu działaniu otaczającego je płaszcza wodnego. Dodanie do takiego układu elektrolitu o większym powinowactwie do wody (NaCl) niż mydło powoduje odwodnienie miceli. Duży nadmiar jonów w środowisku zobojętnia ponadto ładunki elektryczne na powierzchni. Cząsteczki koloidu (fazy rozproszonej) pozbawione otoczki wodnej i odpychającego działania jednoimiennych ładunków, wypadają z roztworu. Wykonanie: Do 5 ml roztworu mydła dodać NaCl w stanie stałym, aż do wysycenia. Wypada osad wysolonego mydła, który oddziela się przez dekantację. c) Wydzielanie wolnych kwasów Mydła są solami słabych kwasów i mocnych zasad. Pod wpływem mocnych kwasów nieorganicznych następuje cofnięcie dysocjacji grupy karboksylowej kwasu tłuszczowego, w wyniku czego powstają niezdysocjowane, nierozpuszczalne w wodzie kwasy tłuszczowe. Wykonanie: Do 5 ml roztworu mydła dodać po kropli stężonego H 2 SO 4, aż do otrzymania kwaśnego środowiska. Roztwór mętnieje z powodu wydzielania się wolnych kwasów tłuszczowych.
3. Odróżnianie kwasów tłuszczowych od tłuszczów obojętnych Wykonanie: a) Do roztworu z ćw. 2c dodać 3 ml eteru. Następnie do probówki zawierającej l ml 0,002M NaOH, zabarwiony fenoloftaleiną na różowo, dodać kroplami eterowy roztwór kwasów tłuszczowych. Zawartość probówki odbarwia się. b) Ogrzewać kwasy tłuszczowe z krystalicznym KHSO 4. Nie wydziela się charakterystyczny zapach akroleiny, powstający z tłuszczów w przypadku ogrzewania z KHSO 4. 4. Wykazanie obecności kwasów nienasyconych w tłuszczach Pod wpływem substancji utleniających, np. KMnO 4 dochodzi do rozerwania łańcucha węglowego w miejscu podwójnych wiązań, z równoczesnym utlenieniem atomów węgla do grup karboksylowych. Analizując produkty rozpadu, można określić położenie wiązania podwójnego w cząsteczce kwasu. Równocześnie z utlenieniem kwasu nienasyconego zachodzi redukcja utleniacza. W środowisku obojętnym mangan redukuje się ze stopnia utlenienia +7 na +4. Wykonanie: Do probówki zawierającej 2 krople oleju dodać 5 ml IM Na 2 CO 3. Zawartość probówki lekko ogrzać i wytrząsając dodawać po kropli 0,01M roztworu KMnO 4, aż do trwającego około 2 minuty różowego zabarwienia. 5. Wykrywanie tłuszczów za pomocą reakcji akroleinowej Tłuszcze zawierające glicerol, ogrzewane z KHSO 4 dają dodatnią reakcję akroleinową. Podczas ogrzewania glicerolu w obecności krystalicznego KHSO 4 dochodzi do odciągnięcia dwóch cząsteczek wody z glicerolu. Powstaje aldehyd nienasycony tzw. akroleina, której pary mają ostry duszący zapach przypominający zapach formaliny. Akroleinę można wykryć również reakcją lustra srebrnego, gdyż jako aldehyd ma ona właściwości redukujące. Wykonanie: Do kropli oleju jadalnego w suchej probówce dodać szczyptę KHSO 4. Zawartość probówki ogrzewać przez kilka minut. Wydziela się przykry, drażniący zapach akroleiny. 6. Rozpuszczalność tłuszczów Tłuszcze rozpuszczają się dobrze w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak benzen, chloroform, aceton, toluen i eter, a w mniejszym stopniu także w etanolu i metanolu. Wykonanie: Do probówek zawierających po 1 ml rozpuszczalników organicznych (etanol, chloroform, aceton) dodać odrobinę tłuszczu. Zaobserwować różnicę w stopniu rozpuszczalności tłuszczu w poszczególnych rozpuszczalnikach organicznych. 7. Tworzenie emulsji tłuszczu w obecności emulgatora Tłuszcz nie rozpuszczają się w wodzie. W przypadku silnego wytrząsania z wodą rozbija się na drobne kropelki i po chwili wypływa ponownie na powierzchnię wody. Jeżeli do wody doda się emulgatora (środka zmniejszającego napięcie powierzchniowe na granicy faz tj. siłę, która przeciwstawia się zwiększeniu powierzchni granicznej między wodą i tłuszczem), po wytrząsaniu małe kropelki tłuszczu bardzo długo będą utrzymywać się w wodzie, nie łącząc się wzajemnie. Powstaje biała,,,mleczna ciecz, tzw. emulsja tłuszczu Wykonanie: Do 2 probówek, zawierających po 4 ml wody dodać kilka kropli oleju. Do jednej z nich wprowadzić 0,5 ml roztworu mydła. Zawartość obu probówek silnie wstrząsnąć. W probówce zawierającej środek emulgujący tworzy się trwała emulsja tłuszczu w wodzie.
Ekstrakcja lecytyn z żółtka jaja Lecytyny występują w dużych ilościach w żółtku jaja, skąd mogą być wyekstrahowane etanolem na gorąco. Ich rozpuszczalność w alkoholu jest uwarunkowana obecnością grup hydrofilowych: reszty kwasu fosforowego i IV-rzędowej zasady - choliny. Po odparowaniu z ekstraktu etanolu pozostaje mazisty osad lecytyny podbarwiony żółto ekstrahującymi się równocześnie związkami karotenowymi. Wykonanie: Żółtko jaja zalać w zlewce 40 ml etanolu, wymieszać. Zlewką przykryć szkiełkiem zegarkowym i ogrzewać 10 minut w gorącej łaźni wodnej, uważając aby alkohol nie odparował. Wytrąca się osad zdenaturowanych białek i niektórych lipidów. Osad ten odsączyć i przepłukać na sączku niewielką ilością etanolu. Przesącz i popłuczyny zawierające rozpuszczalną lecytynę odparować w parowniczce na łaźni wodnej. Uzyskany preparat lecytyny zachować do badania właściwości tłuszczów oraz identyfikacji substancji wchodzących w skład lecytyn. Analiza składu chemicznego lecytyn 1. Próba na fosfor Wykonanie: Niewielką ilość osadu lecytyn stopić w suchym tygielku porcelanowym z 3-krotną ilością mieszaniny spalającej (KNO 3 i Na 2 CO 3 w stosunku 2:3). Stop rozpuścić w gorącej wodzie i przesączyć. Do przesączu dodać stężony roztwór HNO 3 i 5% roztwór molibdenianu amonu. Po zagotowaniu wytrąca się żółty, krystaliczny osad fosforomolibdenianu amonowego. 2. Próba na azot Wykonanie: Osad lecytyn ogrzać w probówce z równą ilością wapna sodowanego (mieszanina Ca(OH) 2 i NaOH w stosunku 1:1). Wydziela się amoniak, który poznaje się po zapachu lub zmianie zabarwienia zwilżonego papierka lakmusowego, trzymanego nad probówką.. 3. Próba na glicerol Wykonanie: Z częścią otrzymanego osadu lecytyn wykonać próbę akroleinową na glicerol. Zapach akroleiny wydzielający się pod wpływem ogrzewania lecytyn z KHSO 4 świadczy o tym, że komponentem alkoholowym lecytynach jest glicerol. 4. Zmydlanie lecytyn Wykonanie: Osad lecytyn ogrzewać z 5 ml 30% NaOH w obecności 2,5 ml 30% etanolu. Obserwuje się powstanie mydła. Pod wpływem ogrzewania z ługiem ulegają hydrolizie estrowe połączenia glicerolu i kwasów tłuszczowych występujących w lecytynach. 5. Próba na cholinę Wykonanie: Grudkę lecytyny zalać w parowniczce 4 ml 2M roztworu NaOH, ogrzewać łagodnie stale mieszając i uzupełniając ubytek odparowanej wody. Roztwór utrzymywać we wrzeniu przez 5 minut. Następnie dodać 80% roztworu kwasu octowego do wystąpienia odczynu kwaśnego wobec papierka lakmusowego. Wytrącone kwasy tłuszczowe odsączyć. Kroplę przesączu przenieść na szkiełko podstawowe, dodać kroplę stężonego roztworu jodu. Nakryć szkiełkiem nakrywkowym i oglądać w małym powiększeniu mikroskopu. Po upływie minuty powstają pryzmatyczne, brunatne kryształy jodku choliny.
WYKRYWANIE WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH Uwaga!!! Reakcje dla witamin przeprowadzać wyłącznie w suchych probówkach i bezwzględnie pod dygestorium! Witamina A Wykrywanie witaminy A metodą Carra-Price a - reakcja z chlorkiem antymonu(iii) Witamina A i karotenoidy dają niebieskie zabarwienie z nasyconym roztworem trójchlorku antymonu. Witaminę A z materiału biologicznego ekstrahujemy za pomocą chloroformu. Ekstrakt chloroformowy służyć może nie tylko do wykrywania, ale również do ilościowego oznaczania witaminy A, poprzez pomiar absorbancji produktu reakcji z SbCl 3. Wykonanie: Do 1 ml roztworu, zawierającego badaną substancję dodać 2 ml 30% chloroformowego roztworu SbCl 3. Powstaje niebieskie, szybko zanikające zabarwienie. Reakcja jest również charakterystyczna dla karotenoidów i niektórych steroli Uwaga: Wszystkie użyte do analizy odczynniki powinny być wolne od domieszek wody i alkoholu Witamina E Wykrywanie witaminy E (tokoferoli) Tokoferole, tzn. witamina E, to grupa pokrewnych związków występujących w olejach roślinnych, wywodzących się od tokolu a różniących się między sobą liczbą i położeniem grup metylowych. W celu identyfikacji poszczególnych tokoferoli należy je przedtem rozdzielić, czy też oddzielić od towarzyszących im związków. Można tu wykorzystać różnicę w polarności poszczególnych związków. Tokoferole związane estrowo lub w roztworach tłuszczów trzeba najpierw uwolnić przez zmydlanie. Grupą funkcyjną nadającą im właściwości redukcyjne jest grupa OH w pozycji 6. Metody oznaczania tokoferoli są oparte na wykorzystaniu tych właściwości w reakcjach chemicznych. Reakcja Further-Meyera Wykonanie: Do 1 ml badanej substancji dodać 0,2 ml stężonego kwasu azotowego(v). Ogrzewać mieszaninę na łaźni wodnej w temp. 75 0 C przez 15 minut. Powstaje związek o głęboko czerwonym zabarwieniu ponieważ utlenianie tokoferoli kwasem azotowym powoduje powstawanie ortochinonów o zabarwieniu czerwonym, tzw. czerwień tokoferolowi. Reakcja Naira-Mogara Wykonanie: Zmieszać 1 cm 3 etanolowego roztworu badanej substancji z 0,5 cm 3 1/2% roztworu kwasu molibdenofosforowego w kwasie octowym. Pojawienie się żółtozielonego zabarwienia świadczy o obecności związku redukującego Reakcja Emmerie-Engla (z chlorkiem żelaza(iii) i -dwupirydylem) Wykonanie: Do 1ml etanolowego roztworu badanej substancji dodać 0,5 ml 0,2% etanolowego roztworu FeCl 3, a następnie 1 ml 0,5% etanolowego roztworu etanolu -dwupirydylu. Powstaje intensywnie czerwone zabarwienie od soli -dwupirydylowej tokoferolu z jonami żelaza(iii).
Witaminy z grupy D Wykrywanie witamin D2 i D3 (ergokalcyferolu i cholekalcyferolu) Reakcja z bezwodnikiem octowym w obecności stężonego kwasu siarkowego Wykonanie: Do 1ml roztworu zawierającego badaną substancję dodać 0,1 ml bezwodnika octowego oraz 0,1 ml stężonego H2SO4 i całość intensywnie wymieszać. Pojawia się zabarwienie czerwone, szybko przechodzące w fioletowe i często błękitne, a potem zielone (zależnie od zawartości witamin w próbce) Reakcja z chlorkiem antymonu(iii) Wykonanie: Do 1 ml roztworu zawierającego badaną substancję dodać 2 ml 30 % chloroformowego roztworu chlorku antymonu(iii). Pojawia się pomarańczowożółte zabarwienie, które po krótkim czasie staje się bardziej intensywne. Reakcja z sacharozą w obecności stężonego kwasu siarkowego (VI) Wykonanie: Do 1 ml etanolowego roztworu badanej substancji dodać 1ml etanolowego roztworu sacharozy i kilka kropli stężonego kwasu siarkowego(vi). Pojawia się czerwone zabarwienie, a podczas dodawania większej ilości kropli tego odczynnika może pojawić się barwa niebieska. Reakcja z bromem Wykonanie: Do 1 cm 3 chloroformowego roztworu badanej substancji dodać 5 kropli roztworu bromu w chloroformie. Powstaje zielone zabarwienie roztworu. Materiał teoretyczny do ćwiczenia obejmuje zagadnienia wykładowe oraz wiadomości z podręcznika Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko Stefanowicz, rozdz. 8.1, tzn. Lipidy i lipoproteiny, str. 306-320.