Ćwiczenie U3 Identyfikacja i oznaczenie związku psychotropowego w preparacie farmaceutycznym metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną w zakresie UV
Wprowadzenie Leki stanowią dużą grupę związków, najczęściej organicznych, która stanowi ważny przedmiot sądowej analizy toksykologicznej. Substancje te są identyfikowane i oznaczane zarówno w materiale biologicznym (w płynach ustrojowych krwi, osoczu, moczu oraz w wycinkach narządów wewnętrznych wątrobie, nerce, mózgu) jak i materiale nie biologicznym, np. płynach, proszkach, tabletkach. Te ostatnie materiały (nie biologiczne) często bywają znajdowane przy zwłokach lub wśród rzeczy osobistych osób, które uległy zatruciu. ieraz również całe tabletki lub ich fragmenty są znajdowane w treści pokarmowej żołądka. Wspomniane materiały są zabezpieczane wraz z materiałem biologicznym do badań sądowych, gdyż wyniki ich analizy niejednokrotnie stanowią cenną wskazówkę, jaką (-ie) truciznę (-y) (np. leki) spożyła osoba zatruta i tym samym pozwalają ukierunkować dalszy tok analizy materiału biologicznego. Do leków będących szczególnym przedmiotem zainteresowania toksykologów sądowych należą leki psychotropowe z grupy pochodnej fenotiazyny (PHE) oraz z grupy trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych (TCA). Związki te bowiem są powszechnie stosowane w terapii chorób psychicznych i często są przyczyną śmiertelnych zatruć. ajczęściej stosowanymi metodami w analizie toksykologicznej leków są metody chromatograficzne (chromatografia gazowa (GC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z różnymi metodami detekcji oraz chromatografia cienkowarstwowa (TLC)), a także, metody immunologiczne (immunoassays) i spektrofotometria w zakresie UV-VIS. Od ostatniego dziesięciolecia ubiegłego wieku, w analizie leków w płynach ustrojowych i w preparatach farmaceutycznych znaczącą rolę zaczęła odgrywać metoda elektroforezy kapilarnej (CE), a szczególnie jej dwa warianty separacyjne, tj. strefowa elektroforeza kapilarna (CZE) i micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (MECC). Metody te są jednak wciąż na etapie rozwoju, zwłaszcza jeśli chodzi o ich rutynowe zastosowanie w analizie toksykologicznej. Trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne ogólna charakterystyka Trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne (TCA), spośród których można wymienić amitryptylinę, imipraminę, doksepin, nortryptylinę, dezypraminę
i klomipraminę należą do pochodnych: dibenzodiazepiny (np. imipramina, dibenzocykoheptadienu (np. amitryptylina) oraz dibenzoksepiny (np. doksepin). Właściwości fizykochemiczne ww. leków zebrano w tabeli 1. Podchodne dibenzepiny Imipramina (Imipramine C 19 H 24 2 HCl Klomipramina (Clomipramine C 19 H 24 Cl 2 HCl Cl Dezypramina (Desipramine C 18 H 22 2 HCl Opipramol (Opipramol C 23 H 29 3 O HCl H OH Pochodne dibenzocykoheptadienu Amitryptylina (Amitryptyline C 20 H 23 HCl ortryptylina (ortryptyline C 19 H 21 HCl H
Pochodne dibenzoksepiny Doksepina (Doxepin C 19 H 21 O HCl O Tabela 1 Właściwości fizykochemiczne wybranych trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych azwa związku Masa molowa (m. molowa soli) [g/mol] Amitryptylina 277,4 (313,9) Dezypramina 266,4 (302,8) Doksepina 279,4 (315,8) Imipramina Klomipramina ortryptylina Opipramol 280 (316,9) 314,9 (351,3) 263,4 (299,8) 363,5 (436,4) T.top. soli [ o C] pk a Położenie maksimum pasm abs. w UV [nm] 195-199 9,42 239 214 10,2 250 185-191 9,0 292 170-174 9,5 251 252 ok. 192 251 215-220 9,7 239 210 3,8 253 Postać fizyczna soli bezbarwne kryształy lub biały proszek biały proszek krystaliczny biały proszek krystaliczny biały lub lekko żółty proszek krystaliczny biały lub lekko żółty proszek krystaliczny biały proszek lekko żółty krystaliczny proszek, czerwieniejący na świetle Rozpuszczalność woda, etanol, chloroform woda, etanol, chloroform, praktycznie nierozp. w eterze woda, etanol, chloroform woda, etanol, chloroform, praktycznie nierozp. w eterze woda, etanol, chloroform woda, etanol b.dobrze w wodzie, etanol TCA działają przeciwdepresyjnie, silnie pobudzają psychomotorycznie lub przeciwdepresyjnie uspokajająco, znoszą uczucie lęku, nieprzyjemnego napięcia psychicznego. Mechanizm działania TCA nie jest całkowicie poznany, uważa się jednak, że hamują one wychwyt uwolnionej z neuronu noradrenaliny i 5-hydroksytryptaminy, zwiększając stężenie tych amin wokół receptora. Leki te należą do najczęściej stosowanych w terapii schorzeń psychicznych o charakterze depresji. Dawkowanie TCA oraz ich stężenia spotykane we krwi zebrano w tabeli 2.
TCA silnie wiążą się z tkankami (87-96%), co powoduje, że stężenie w tkankach jest znacznie wyższe niż we krwi. Metabolizowane są w wątrobie poprzez procesy demetylacji, -oksydacji i hydroksylacji, a następnie ulegają sprzęgnięciu z kwasem glukuronowym. Charakterystyczne dla tej grupy leków jest to, iż ich metabolity (np. nortryptylina metabolit amitryptyliny oraz dezypramina- metabolit imipraminy) również wykazują działanie farmakologiczne. Poziomy stężeń TCA we krwi w przypadkach zatruć wynoszą zwykle powyżej 1 µg/ml. Tabela 2 Dawki dobowe oraz zakresy stężeń terapeutycznych i toksycznych wybranych leków psychotropowych azwa leku Stężenia Stężenia Maksymalna dobowa dawka 1 Okno terapeutyczne 1 terapeutyczne toksyczne [mg] (krew) 2 (krew) 2 [mg] [µg/ml] [µg/ml] Amitryptylina 300 150-200 0,05-0,2 0,5-2,0 Dezypramina 200 100-150 0,075-0,25 0,5 Doksepina 300 100-200 0,1-0,25 0,5-2,0 Imipramina 300 150-200 0,045-0,15 0,4-0,5;L=2 Klomipramina 300 150-200 0,05-0,15 0,4 ortryptylina 300 150-200 0,05-0,14 0,2 osocze 3 osocze 3 Opipramol 300 150-200 b.d. b.d. brak danych; L stężenie spotykane w przypadkach zatruć śmiertelnych * - stężenie wyjściowe w początkowym okresie 0,115 osocze 3 Wysokosprawna chromatografia cieczowa aparatura oraz podstawy teoretyczne Chromatografia jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod instrumentalnych w chemii analitycznej, a w analizie związków organicznych zajmuje pozycję lidera. Zapewnia ona możliwość identyfikacji substancji oraz ich ilościowej analizy, nawet w niskich stężeniach w obecności innych związków. Możliwość rozdzielania chromatograficznego substancji wynika z faktu, że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie niemieszające się fazy, przy czym jedna z tych faz jest ruchoma (tzw. eluent), a druga stanowi nieruchome wypełnienie kolumny chromatograficznej (faza stacjonarna). Różnica we współczynnikach podziału (K) składników mieszaniny 1 Pużyński S. (1996) Leki psychotropowe. Podręczny poradnik terapii, Springer PW, Warszawa 2 Uges D. R. A. (1996) Therapeutic and Toxic drug concentrations, Bull. Int. Assoc. of Forensic Toxicol., 26:1 (Suppl.) 3 Brandys J. (1999) Toksykologia wybrane zagadnienia, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
pomiędzy fazę ruchomą i fazę stacjonarną warunkuje rozdzielenie tych substancji. K jest wielkością charakteryzującą daną substancję i zależy od fazy stacjonarnej. Między liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej, ustala się równowaga dynamiczna. aturalne przemieszczanie się substancji rozdzielanych w kolumnie następuje tylko w fazie ruchomej, tj. za pośrednictwem gazu nośnego (chromatografia gazowa) lub eluentu (chromatografia cieczowa). Efekt rozdzielenia chromatograficznego wykreślony jest w postaci krzywej elucji (chromatogramu), przedstawiającego zależność sygnału analitycznego od czasu retencji lub objętości retencji. Czas retencji oznacza czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie. Do wykonania analiz techniką chromatografii cieczowej kolumnowej służy chromatograf cieczowy. W skład aparatu wchodzi: zbiornik lub zbiorniki z rozpuszczalnikami tworzącymi fazę ruchomą kolumna wypełniona fazą stacjonarną, zazwyczaj umieszczona w termostacie w celu utrzymania stałej temperatury procesu separacji dozownik, który umożliwia wprowadzenie próbki do układu, umieszczony między pompą a kolumną detektor wykrywający rozdzielone na kolumnie składniki próbki komputer (rzadziej integrator) rejestrujący sygnał z detektora w postaci piku chromatograficznego Literatura obowiązkowa 1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PW, 2002 2. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WT, 2002 3. P. Kościelniak, Problematyka kalibracji w analizie chemicznej w: Chemia Środowiska cz.2, str. 294-297 oraz Informacje zawarte w Instrukcji do ćwiczenia
ĆWICZEIE U3 Identyfikacja i oznaczenie związku psychotropowego w preparacie farmaceutycznym techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) Cel ćwiczenia 1. Przeprowadzenie analizy materiału dowodowego techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej na obecność substancji psychotropowych. a. Przygotowanie próbki do analizy. b. Kalibracja. c. Wykonanie pomiarów 2. Zapoznanie się z poprawnym sporządzeniem sprawozdania z przeprowadzonych oględzin badanego materiału dowodowego i jego analizy chemicznej oraz sformułowaniem wniosków z badań, dla celów opinii sądowej. Zakres materiału naukowego Podstawowe wiadomości na temat struktury chemicznej, własności fizykochemicznych i farmakologicznych leków z grupy trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych Podstawy teoretyczne chromatografii cieczowej oraz budowa aparatu do HPLC. Metody detekcji stosowane w chromatografii cieczowej. W jakich dziedzinach analizy sądowej można wykorzystywać chromatografię cieczową? Co to jest standard (wzorzec) wewnętrzny, jakie musi spełniać warunki i w jakim celu się go stosuje? Odczynniki, materiały, aparatura Materiał badany: materiał dowodowy pobrany z miejsca zdarzenia Odczynniki i materiały: metanolowe roztwory (stężenie 1mg/ml) leków (w postaci chlorowodorków): amitryptyliny, imipraminy, doksepiny, nortryptyliny, dezypraminy, acetonitryl, bufor fosforanowy ph=7,1 (10mM K 2 HPO 4 ), metanol.
Aparatura: chromatograf cieczowy, LaChrom, (Merck, USA), kolumna RP Select-B o długości 12,5 cm, średnicy 4,6 mm, średnica ziarna 5 µm. Dodatkowy sprzęt: waga analityczna, moździerz, wytrząsarka typu vortex, kolby miarowe (25 i 10 ml), pipety automatyczne, lejek, naczyńko wagowe, naczyńka szklane (4 ml), naczynie szklane (20 ml), zlewki, plastikowe pipety Pasteura. Sposób wykonania: I Przeprowadzić dokładne oględziny materiału przeznaczonego do badania (dowodu rzeczowego) oraz sporządzić jego opis (uwzględnić sposób zabezpieczenia dowodu, odpisać treść na ewentualnej przywieszce). Zapoznać się z pytaniami zawartymi w piśmie lub postanowieniu, skierowanym do biegłego. Jeśli jest to potrzebne przeprowadzić wstępne czynności analityczne, np. zważyć badany materiał, określić zapach, zmierzyć ph roztworu, itp. Przykładowe przygotowanie tabletki dowodu zabezpieczonego na miejscu zdarzenia II Pobrać reprezentatywną próbkę dowodu i przygotować ją do badań. Wziąć jedną tabletkę i zważyć ją na wadze analitycznej. Jeśli tabletka jest powleczona zewnętrzną warstwą usunąć ją używając wody z kranu, przepłukać tabletkę wodą destylowaną i wysuszyć. astępnie tabletkę rozetrzeć w moździerzu i pobrać ok. połowę proszku do analizy. Pobraną część proszku odważyć w naczyńku wagowym na wadze analitycznej i przenieść ilościowo za pomocą metanolu do kolbki na 25 ml. Kolbkę uzupełnić metanolem do kreski, a jej zawartość dokładnie i energicznie wymieszać. Przelać część roztworu do naczynia szklanego (20 ml) (wypełnić roztworem w ok. ½ pojemności), zatkać naczynie parafilmem i umieścić w wirówce. Wirówkę wyważyć drugim takim samym naczyniem, wypełnionym tą samą objętością wody i wirować przez 5 minut, przy obrotach 4000 rpm. astępnie pobrać 1 ml supernatantu i rozcieńczyć go 10 razy mieszaniną acetonitrylu i fazy wodnej (1:1, v/v). III Sporządzić roztwór wzorca wewnętrznego o stężeniu 0,05 mg/ml w mieszaninie acetonitrylu i buforu fosforowego ph=7,1 (1:1 v/v). astępnie sporządzić mieszaninę wzorcową pięciu leków z grupy TCA: nortryptyliny, dezypraminy, amitryptyliny, imipraminy i doksepinu. Przygotować próbkę zawierającą wzorce badanych leków w stężeniu 5µg/ml. W tym celu pobrać pipetą takie ilości
metanolowych roztworów leków o stężeniu 1mg/ml, odparować metanol w strumieniu azotu i suchą pozostałość rozpuścić w 1ml przygotowanego roztworu wzorca wewnętrznego. IV Wykonać analizę skryningową (przesiewową). Przygotowaną mieszaninę wzorcową leków i próbkę nieznana umieścić w przystawce automatycznego podajnika próbek chromatografu i przeprowadzić analizę chromatograficzną wzorców stosując program elucji gradientowej, prędkość przepływu fazy ruchomej 2 ml/min, objętość próbki wprowadzonej do kolumny 10µl. Czas[min.] Bufor fosforanowy (%) Acetonitryl (%) 0 45 55 8 45 55 15 35 65 18 35 65 20 45 55 25 45 55 a podstawie czasów retencji i widm UV badanych związków umieszczonych w bazie danych przyporządkować piki otrzymane na chromatogramie mieszaniny wzorcowej leków. Porównać chromatogramy dla mieszaniny wzorcowej oraz badanej tabletki i wstępnie zidentyfikować (na podstawie czasów retencji) związek czynny w tabletce. V Przeprowadzić analizę ilościową substancji czynnej w tabletce. W celu oznaczenia substancji czynnej w tabletce sporządzić 3-punkową krzywą kalibracyjną, stosując odpowiednio stężone wzorcowe roztwory tego leku z takim samym dodatkiem (stężeniem) wybranego standardu wewnętrznego. Do badanego roztworu tabletki również dodać ten standard wewnętrzny w takim samym stężeniu. Dla każdego roztworu (wzorcowych i badanego) wykonać pomiar. VI Opracować wyniki analizy i zinterpretować je. Zidentyfikować substancje czynne w tabletce na podstawie czasu retencji i widma UV. astępnie wykreślić odpowiednią krzywą kalibracji dla zidentyfikowanej substancji czynnej, w ten sposób, że na osi rzędnych odłożyć stosunek pola pod powierzchnią odpowiedniego piku do pola pod powierzchnią piku wzorca wewnętrznego (S x / S IS ), a na osi odciętych -
stężenie oznaczanej substancji (c x ). Wyznaczyć równanie krzywej wzorcowej i policzyć z niego stężenie leku. Uzyskany wynik stężenia przeliczyć na masę całej tabletki i podać go w mg. Sporządzić opinię dla Sądu wg następujących punktów: 1. awiązać w 1-2 zdaniach do otrzymanego pisma i postanowienia Prokuratury. 2. Podkreślić cel przeprowadzenia zleconych badań. 3. Sporządzić dokładny opis badanego dowodu rzeczowego 4. apisać zwięzłą część sprawozdawczą z przeprowadzonych badań (w tym również uwzględnić sposób przygotowania dowodu do badań). 5. W części dotyczącej wykonania analiz podać dokładnie zastosowaną metodę analityczną (nazwę i parametry doświadczalne metody), a także model i firmę stosowanego aparatu. 6. Podać końcowy wynik zarówno analizy jakościowej jak i ilościowej. Jeżeli nie można kategorycznie wypowiedzieć się na temat uzyskanego wyniku (na przykład była dostępna tylko jedna metoda i technika analityczna, dysponowano niewystarczającą ilością materiału do badań, itd.) należy to podkreślić. Zawsze należy pamiętać, iż uzyskany wynik jedną metodą analityczną należy potwierdzić przynajmniej jeszcze drugą metodą o podobnej czułości i odmiennym mechanizmie fizykochemicznym. Szczególnie dotyczy to analiz sądowych! 7. a końcu opinii podać w zwięzły i logiczny sposób wnioski wyciągnięte z przeprowadzonych analiz i oględzin badanego materiału. 8. W ostatnim zdaniu podać informację, czy pozostała jakaś reszta materiału po badaniach oraz gdzie i do jakiego terminu będzie przechowywana. 9. Ostatecznie złożyć swój podpis pod sporządzoną opinią.