POSTÊPY METODA BIOLOGII MLPA KOMÓRKI ORAZ JEJ ZASTOSOWANIE W DIAGNOSTYCE TOM 36 2009 GENETYCZNEJ NR 4 (555 563) 555 METODA MLPA ORAZ JEJ ZASTOSOWANIE W DIAGNOSTYCE CHORÓB UWARUNKOWANYCH GENETYCZNIE MLPA AND ITS APPLICATION IN DIAGNOSTICS OF GENETIC DISEASES Izabela ACZMAÑSKA 1, ukasz ACZMAÑSKI 2 1 Katedra i Zak³ad Genetyki i 2 Katedra i Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Leczenia Izotopami, Akademia Medyczna we Wroc³awiu Streszczenie: Rozwój technik biologii molekularnej umo liwi³ poznanie podstaw wielu chorób genetycznych, w tym chorób warunkowanych delecjami i duplikacjami fragmentów genomowego DNA CNV (ang. Copy Number Variants), stanowi¹cych oko³o 5,5% opisanych dotychczas patogennych zmian w genomie. Jedn¹ z metod badania delecji i duplikacji fragmentów genomu jest MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), opisana po raz pierwszy w 2002 roku. Jest to technika molekularna oparta na ligacji i PCR, która umo liwia wzglêdn¹ iloœciow¹ ocenê równoczeœnie 40 45 ró nych sekwencji nukleotydowych w jednej reakcji. W MLPA u ywane s¹ specyficzne sondy hybrydyzuj¹ce do komplementarnych badanych odcinków DNA. Sondy te skonstruowane s¹ z dwóch fragmentów, które po hybrydyzacji do badanego obszaru, ulegaj¹ ligacji i s³u ¹ nastêpnie jako jedna matryca dla polimerazy DNA. Po przeprowadzeniu PCR z u yciem znakowanych starterów nastêpuje ocena iloœci produktu zale na bezpoœrednio od iloœci matrycy, co widoczne jest jako zmiana intensywnoœci fluorescencji podczas rozdzia³u w elektroforezie kapilarnej w stosunku do prób kontrolnych, które stanowi¹ normê i punkt odniesienia dla prób badanych. Liczne pozycje œwiatowej literatury naukowej s¹ dowodem na u ytecznoœæ i du ¹ skutecznoœæ metody MLPA w diagnostyce mikrodelecji i mikroduplikacji, aneuploidii oraz w badaniach nowotworów zarówno w wykrywaniu delecji i duplikacji krytycznych obszarów, jak i w badaniu poziomu metylacji. Jej niskie koszty, krótki czas analizy, niskie wymagania dotycz¹ce sprzêtu oraz mo liwoœæ badania wielu sekwencji w jednej reakcji sprawiaj¹, e jest to metoda o du ym potencjale i szerokim zastosowaniu. S³owa kluczowe: MLPA, delecje, duplikacje, diagnostyka genetyczna. Summary: The development of molecular biology methods opened a new area in genetic diagnosis and thus, allowed to reveal small deletions and duplications of the genomic DNA fragments (CNV Copy Number Variants) which constitute about 5,5% of all pathogenic alterations. MLPA Multiplex Ligationdependent Probe Amplification which was first described in 2002, is one of the most powerful methods for detection of microaberrations (deletions and/or duplications). This method is also useful in studies on aneuploidy and also copy number variation analyses and methylation profiling in cancers. MLPA is a molecular technique based on ligation and PCR that enables analysis of 40 45 different genomic sequen-

556 I. ACZMAÑSKA,. ACZMAÑSKI ces in one reaction. Specific probes are used to hybridize to target DNA sequences. Each probe consists of two oligonucleotides which, after hybridization to a complementary sequence in patient's DNA, are ligated and subsequently used as a template for the polymerase in PCR. After PCR with fluorescently labeled primers products are separated by capillary electrophoresis and relative quantification of the fluorescence intensity of amplified products according to control probes is prepared. Thanks to low costs and short time for analysis as well as possibility of simultaneous analysis of many probes in one reaction, MLPA has become one of most widely applied methods in genetic studies. Key words: MLPA, deletions, duplications, genetic diagnostics. WSTÊP Rozwój technik diagnostycznych, jaki obserwowany jest od kilkudziesiêciu lat, umo liwi³ poznanie podstaw genetycznych wielu chorób, zarówno warunkowanych aberracjami chromosomowymi, zmianami na poziomie molekularnym, jak i epigenetycznym oraz stworzenie licznych testów diagnostycznych. Zale nie od rodzaju badanej zmiany w genomie w diagnostyce chorób genetycznych stosowane s¹ ró norodne techniki laboratoryjne, pocz¹wszy od technik cytogenetycznych, cytogenetyki molekularnej a po techniki molekularne [9, 10]. Delecje i duplikacje fragmentów genomowego DNA CNV (ang. Copy Number Variants) s¹ przyczyn¹ wielu chorób o pod³o u genetycznym i stanowi¹ oko³o 5,5% opisanych dotychczas patogennych zmian w genomie [5]. Zmiany te dotycz¹ 12% ludzkiego genomu, s¹ zwykle wiêksze ni 1 Kpz i wystêpuj¹ zarówno w sekwencjach koduj¹cych, jak i regulatorowych [12]. Efekt fenotypowy CNV mo e byæ ró ny, od neutralnego do patogennego zale nie od rozmiaru oraz lokalizacji zmiany [8]. Wykrywanie delecji oraz duplikacji fragmentów genów, szczególnie tych obejmuj¹cych ca³e egzony, zwykle nie jest mo liwe przy u yciu PCR czy sekwencjonowania ze wzglêdu na wielkoœæ badanej zmiany. Diagnostyka takich mutacji mo e byæ prowadzona przy u yciu techniki Southern blot lub FISH, ale metody te równie maj¹ swoje ograniczenia pierwsza wymaga pracy z substancjami radioaktywnymi, druga ma rozdzielczoœæ od 40 Kpz do 250 Kpz w przypadku analizy j¹der interfazalnych, a wybór sondy badawczej w obu przypadkach zale y od rozpoznania postawionego przez lekarza. Rozwi¹zaniem mo e byæ zastosowanie CGH do mikromacierzy array-cgh (ang. Array-Comparative Genomic Hybridization) lub mikromacierzy SNP o wysokiej gêstoœci (ang. high-density SNP array), które pozwalaj¹ na screening ca³ego genomu, ale wymagaj¹ zastosowania specjalistycznego sprzêtu, wysoko wykwalifikowanego personelu i s¹ kosztowne [8]. MLPA Alternatywn¹ metod¹ w przypadku badania delecji i amplifikacji fragmentów genomu mo e byæ MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Jest to jedna z nowych metod molekularnych opracowana w 2002 przez

METODA MLPA ORAZ JEJ ZASTOSOWANIE W DIAGNOSTYCE GENETYCZNEJ 557 firmê MRC Holland oparta na ligacji i PCR, która umo liwia wykrywanie delecji i duplikacji/amplifikacji pojedynczych egzonów, a tak e np. badanie poziomu mrna, ocenê poziomu metylacji badanych fragmentów, a nawet badanie zmian pojedynczych nukleotydów [1, 14]. Niew¹tpliw¹ zalet¹ MLPA jest to, e nie wymaga ona stosowania specjalnego sprzêtu, jak np. w przypadku mikromacierzy. Do przeprowadzenia reakcji potrzebny jest termocykler, a do rozdzia³u produktów po PCR, np. sekwenator kapilarny, które s¹ zwykle podstawowym wyposa eniem laboratorium molekularnego. Niezbêdnym sprzêtem jest tak e komputer i oprogramowanie (udostêpniane miêdzy innymi przez producenta odczynników) umo liwiaj¹ce obróbkê uzyskanych danych oraz wygenerowanie wyniku [1]. Obecnie dostêpne s¹ liczne zestawy (kity) do MLPA, zawieraj¹ce odpowiednie mieszaniny sond s³u ¹cych do diagnostyki m.in. nowotworów, zespo³ów mikrodelecyjnych, zmian w rejonach subtelomerowych, aneuploidii, a tak e wielu chorób warunkowanych delecjami lub amplifikacjami fragmentów genów oraz badañ farmakogenetycznych. Nale y jednak zaznaczyæ, e testy produkowane przez MRC Holland nie maj¹ atestów CE (ang. CE Mark) i nie mog¹ byæ u ywane do celów diagnostycznych. Brak atestów nie wyklucza zastosowania MLPA jako wstêpnego badania przesiewowego o stosunkowo niskich kosztach, jednak wymagane jest przeprowadzenie walidacji* metody lub potwierdzenie uzyskanych wyników diagnostycznych inn¹, niezale n¹ technik¹ [1, 10]. Do badania technik¹ MLPA potrzeba 50 200 ng DNA pacjenta, co pozwala na wzglêdn¹ iloœciow¹ ocenê równoczeœnie 40 45 ró nych sekwencji nukleotydowych w jednej reakcji. Czas badania t¹ metod¹ wynosi 2 dni, ale samo wykonanie badania nie jest czasoch³onne: procedura zaczyna siê od denaturacji (zwykle genomowego) DNA. Kolejnym krokiem jest hybrydyzacja matrycy z sondami, co trwa oko³o 16 godzin (najd³u szy etap MLPA prowadzony przez noc), a nastêpnie ligacja sond przy pomocy enzymu ligazy. Drugim etapem jest PCR z u yciem wspólnych starterów (z których jeden jest znakowany fluorescencyjnie). Podczas PCR dochodzi do amplifikacji DNA sond, których fragmenty uleg³y ligacji. Ostatnim krokiem jest rozdzia³ produktów w warunkach denaturuj¹cych np. na sekwenatorze kapilarnym (ryc. 1) [1, 8, 10]. W technice MLPA u ywane s¹ specyficzne sondy hybrydyzuj¹ce do komplementarnych badanych odcinków DNA. Sondy te skonstruowane s¹ z dwóch fragmentów tzw. sondy po³ówkowe (ang. half-probes), które po hybrydyzacji do badanego obszaru, ulegaj¹ ligacji i s³u ¹ nastêpnie jako jedna matryca dla polimerazy DNA. Koñce 3' jednego fragmentu sondy i 5' drugiego fragmentu sondy s¹ sekwencjami komplementarnymi dla starterów wspólnych dla wszystkich sond stosowanych w jednej reakcji. Jeden ze starterów jest znakowany fluorescencyjnie, co umo liwia wykrywanie produktu PCR podczas elektroforezy kapilarnej [1,8]. Badana sekwencja, docelowa dla sondy, musi byæ sekwencj¹ unikatow¹ w genomie (tak eby nie dochodzi³o do hybrydyzacji sond z innymi fragmentami *Walidacja polega na okreœleniu szeregu parametrów opisuj¹cych jakoœæ sprawdzanego testu. W przypadku walidacji pe³nej s¹ to: czu³oœæ, specyficznoœæ, powtarzalnoœæ, odtwarzalnoœæ, granica oznaczalnoœci, solidnoœæ.

558 I. ACZMAÑSKA,. ACZMAÑSKI RYCINA 1. Schemat reakcji MLPA wg www.mlpa.com., zmodyfikowano, opis w tekœcie FIGURE 1. MLPA reaction outline according to www.mlpa.com with modifications, description in the text genomu) i nie mo e zawieraæ powtórzeñ, polimorfizmów pojedynczego nukleotydu SNPs (ang. Single Nucleotide Polymorphisms) ) i innych polimorfizmów. Sondy s¹ tak projektowane, aby ró nice w ich wielkoœci, a nastêpnie wielkoœci produktów PCR, umo liwi³y ich identyfikacjê podczas rozdzia³u ze wzglêdu na ró ne tempo migracji [8].

METODA MLPA ORAZ JEJ ZASTOSOWANIE W DIAGNOSTYCE GENETYCZNEJ 559 Je eli nie dojdzie do hybrydyzacji jednego lub dwóch fragmentów sondy ze wzglêdu na obecn¹ w badanym DNA mutacjê (np. delecjê czêœci lub ca³ego badanego regionu), nie dochodzi do ligacji, a co za tym idzie nie powstaje fragment ograniczony sekwencjami komplementarnymi dla starterów. Nie jest wiêc mo liwe uzyskanie produktu PCR dla badanego fragmentu DNA pacjenta (ryc. 1,2) [1, 8]. Poniewa wiêkszoœæ mutacji wystêpuje w uk³adzie heterozygotycznym, brak ligacji na jednym allelu nie wp³ywa na ligacjê i PCR dla drugiego allelu. Zmniejsza siê natomiast iloœæ produktu po PCR zale na bezpoœrednio od iloœci matrycy, co widoczne jest jako zmniejszenie intensywnoœci fluorescencji podczas rozdzia³u w elektroforezie kapilarnej w stosunku do prób kontrolnych, które stanowi¹ normê i punkt odniesienia dla badanych próbek (ryc. 2) [1, 8]. Sonda z wolnym koñcem 5' jest zwykle krótka (40 50 nukleotydów), natomiast ta z wolnym koñcem 3', zawieraj¹ca dodatkow¹ sekwencjê (ang. stuffer sequence) ma d³ugoœæ powy ej 440 nukleotydów. Uzyskanie odpowiedniej d³ugoœci sondy jest mo liwe poprzez regulowanie d³ugoœci jednego z dwóch fragmentów sondy w czêœci niehybrydyzuj¹cej z sekwencj¹ docelow¹, najczêœciej na 3' koñcu przed sekwencj¹ dla startera (ryc. 1) [8]. D³ugie sondy uzyskiwane s¹ drog¹ klonowania w specjalnych wektorach M13, co umo liwia otrzymanie, po ligacji i PCR, oko³o 40 ró nych fragmentów o d³ugoœci od 130 do 480 nukleotydów, ró ni¹cych siê miêdzy sob¹ o 6 9 nukleotydów. Produkcja sond do MLPA jest jednak na tyle trudna i czasoch³onna, e badanie to jest praktycznie mo liwe do wykonania tylko przy u yciu komercyjnie dostêpnych zestawów. Ogranicza to wybór osobie planuj¹cej badanie do oko³o 200 ró nych zestawów produkowanych przez MRC Holland [8]. Alternatywn¹ metod¹ jest uzyskiwanie sond za pomoc¹ syntezy chemicznej, co ogranicza jednak wielkoœæ po³ówkowych sond do oko³o 100 nukleotydów. Aby mo liwe by³o badanie w jednej reakcji wielu prób, ró nice w wielkoœci produktów PCR wynosz¹ 2 4 nukleotydy. Mo e to prowadziæ do niedok³adnego rozdzia³u podczas elektroforezy kapilarnej, dlatego dla produktów o podobnej wielkoœci stosuje siê dwa ró ne fluorochromy. W takim przypadku jednak zestaw sond wybarwionych danym fluorochromem wymaga w³asnej próby kontrolnej i jest analizowany oddzielnie [8]. Ze wzglêdu na to, e MLPA jest metod¹ porównawcz¹ (wynik dla próby badanej porównywany jest z wynikiem dla prób kontrolnych), istotn¹ spraw¹ jest normalizacja wyników. Porównywane wyniki musz¹ byæ uzyskane dla DNA izolowanego jedn¹ metod¹ i przygotowane podczas jednego eksperymentu z u yciem jednego zestawu [1]. Ka dy zestaw do MLPA zawiera tzw. fragmenty referencyjne syntetyczne sondy, pozwalaj¹ce na ocenê, czy zasz³a pe³na denaturacja i ligacja i czy u yto wystarczaj¹cej iloœci DNA (ang. DNA denaturation control fragments, D-fragments), a tak e porównanie intensywnoœci fluorescencji zale nej od iloœci matrycy, a wiêc i stê enia DNA, a niezale nej od ligacji (ang. DNA Quantity fragments, Q-fragments). Wprawdzie przed przygotowaniem reakcji powinna byæ dokonana ocena stê enia DNA, ale przy u yciu 50 100 ng DNA generowany b³¹d, wynikaj¹cy np. z pipetowania czy niehomogennoœci u ytego roztworu DNA, mo e byæ znacz¹cy [1].

560 I. ACZMAÑSKA,. ACZMAÑSKI Aby stwierdziæ delecjê/amplifikacjê danego obszaru, nale y porównaæ wysokoœæ piku lub pole powierzchni piku uzyskanego dla danej sondy próby badanej z danymi dla tej samej sondy w próbie kontrolnej. Porównanie to najproœciej przeprowadziæ przy pomocy odpowiedniego oprogramowania do analizy MLPA, np. udostêpnianego przez producenta zestawów. Prawid³owy stosunek wysokoœci danego piku uzyskanego dla RYCINA 2. Elektroforeza kapilarna produktów PCR dla zestawu SALSA MLPA P064B MR1. Oœ x wielkoœæ produktu PCR, oœ y intensywnoœæ fluorescencji. Trójk¹tami zaznaczono krytyczne piki dla zespo³u Pradera-Willego, kó³kami dla zespo³u Williamsa. Porównanie wysokoœci (intensywnoœci fluorescencji) pików uzyskanych dla próby badanej z wysokoœci¹ pików uzyskanych dla próby kontrolnej pozwala zauwa yæ (nawet bez analizy przy pomocy programu komputerowego) ró nice w ich wielkoœci, wynikaj¹ce z delecji (przypadek 1) oraz duplikacji (przypadek 2) badanego fragmentu DNA pacjenta FIGURE 2. The capillary electrophoresis of the PCR products for SALSA MLPA P064B MR1. The x axis the size of the PCR product, the y axis the fluorescence intensity. The triangles mark probes critical for Prader-Willi syndrome, circles for Williams syndrome. Peaks illustrating fluorescence intensity differ in size therefore represent the result of the deletion (case 1) and duplication (case 2) of the critical DNA fragments

METODA MLPA ORAZ JEJ ZASTOSOWANIE W DIAGNOSTYCE GENETYCZNEJ 561 próby badanej oraz piku dla próby kontrolnej wynosi 1 +/ 0,3. Wynik poni ej tej wartoœci oznacza delecjê, a powy ej amplifikacjê badanego fragmentu DNA [1, 8]. Obecnie istniej¹ dwie modyfikacje podstawowej techniki MLPA: MLPA z odwrotn¹ transkrypcj¹ RT-MLPA (ang. Reverse Transcriptase MLPA) oraz MLPA specyficzne dla metylacji MS-MLPA (ang. Methylation Specific MLPA). RT-MLPA jest u ywane do okreœlania poziomu mrna. Dodatkowym krokiem w tej metodzie jest przepisanie mrna na cdna podczas odwrotnej transkrypcji, poniewa ligaza nie potrafi ³¹czyæ fragmentów sondy hybrydyzuj¹cej z RNA. Obecnie dostêpne s¹ dwa komercyjne zestawy do badania profilu ekspresji genów metod¹ MLPA [1]. MS-MLPA pozwala, obok standardowej oceny delecji/amplifikacji, na sprawdzenie obecnoœci metylacji w badanym fragmencie. W tym celu konieczne jest zastosowanie metylowra liwej endonukleazy, która nie trawi fragmentów metylowanych, natomiast trawi niemetylowane kompleksy DNA-sonda, rozdzielaj¹c tym samym dwa startery i uniemo liwiaj¹c zastosowanie tego fragmentu jako matrycy dla PCR. Skutkuje to innym profilem fragmentów rozdzielonych podczas elektroforezy kapilarnej. MS-MLPA u ywana jest do badania wzoru metylacji np. w zespo³ach Angelmana i Pradera-Willego, Beckwitha-Wiedemanna, a tak e zmian profilu metylacji w materiale pochodz¹cym z komórek nowotworowych [1]. Metoda MLPA, jak ka da z metod molekularnych, ma swoje ograniczenia. Oprócz wymienionych powy ej: koniecznoœci stosowania zestawów komercyjnych, koniecznoœci potwierdzania wyniku inn¹ metod¹, jeœli jest to wynik diagnostyczny, jedn¹ z najwa niejszych wad MLPA jest zale noœæ iloœci produktu PCR (a co za tym idzie intensywnoœci fluorescencji) od takich czynników, jak: stê enie i czystoœæ DNA, metody jego izolacji (próbki badane i kontrolne powinny byæ izolowane t¹ sam¹ metod¹), rodzaju roztworu, w którym jest rozpuszczone, czasu przechowywania i stopnia degradacji DNA, obecnoœci innych zwi¹zków w roztworze, takich jak: bia³ka, RNA, sole. Wp³yw tych czynników na wynik badania mo na zmniejszyæ standaryzuj¹c metody izolacji i przechowywania DNA, co nie zawsze jest jednak wykonalne, szczególnie, jeœli DNA jest pozyskiwane z ró nych oœrodków [8]. Wa nym elementem jest tak e sprawnoœæ i dok³adnoœæ pipetowania i doœwiadczenie laboratoryjne osoby wykonuj¹cej badanie, szczególnie przy wiêkszej liczbie próbek. ZASTOSOWANIE MLPA Liczne pozycje œwiatowej literatury naukowej s¹ dowodem na u ytecznoœæ i du ¹ skutecznoœæ metody MLPA np. w diagnostyce niepe³nosprawnoœci intelektualnej o nieznanej etiologii [7, 11, 13, 15], diagnostyce aneuploidii [3], badaniach nowotworów zarówno delecji i duplikacji krytycznych obszarów, jak i badaniu poziomu metylacji [2, 4, 6]. Dostêpne zestawy do badania pacjentów z niepe³nosprawnoœci¹ intelektualn¹ MR (ang. Mental Retardation) umo liwiaj¹ diagnostykê przesiewow¹ wybranych zespo³ów, np.: 1p36, Williamsa, Smith-Magenisa, Millera-Diekera, DiGeorgea, Alagille'a, Seathre-Chotzena i Sotosa (zestaw MR1), Wolfa-Hirschhorna, Cri du Chat, WAGR, Langera-Giedon'a, i Rubinstein-Tybiego (zestaw MR2) oraz niepe³nosprawnoœci

562I. ACZMAÑSKA,. ACZMAÑSKI intelektualnej zwi¹zanej z chromosomem X (zestaw MRX). Zestawy te pozwalaj¹ na wykrycie zarówno mikrodelecji badanych regionów, jak i ich mikroduplikacji [1]. Dostêpny jest tak e zestaw do badania mikrodelecji i mikroduplikacji regionów subtelomerowych (zestaw P070-A2 Human Telomere-5), który jest tañsz¹ i szybsz¹ alternatyw¹ dla FISH z zestawem sond subtelomerowych, pozwalaj¹c¹ na ocenê wiêkszej liczby prób w krótszym czasie. Pozytywny wynik uzyskany technik¹ MLPA potwierdzony FISH z zastosowaniem odpowiedniej wybranej sondy ma pe³n¹ wartoœæ diagnostyczn¹ [1, 11]. Zastosowanie MLPA w diagnostyce dystrofii Duchenne'a/Beckera pozwala na przeanalizowanie 79 egzonów genu DMD, co niew¹tpliwie upraszcza diagnostykê tych chorób [1]. Panel zestawów do diagnostyki nowotworów obejmuje np. diagnostykê du ych mutacji genów BRCA1 i BRCA2 dziedziczny rak piersi i jajnika, MLH1, MLH2, MSH6 i PMS2, HNPCC dziedziczny niepolipowaty rak jelita grubego, APC, FAP rodzinna polipowatoœæ jelit, RB1 retinoblastoma, TP53 zespó³ Li-Fraumeni, NF1 neurofibromatoza i innych, a tak e badania delecji/duplikacji w genach supresorach nowotworów oraz protoonkogenach, zarówno ze œwie ych tkanek nowotworowych jak i skrawków parafinowych [1, 8]. Dostêpne s¹ tak e zestawy do badania DNA mitochondrialnego (zestaw Mito) [1]. Mimo braku certyfikatu CE (ang. CE Mark) i koniecznoœci potwierdzenia wyniku MLPA w przypadku wyników diagnostycznych, metoda ze wzglêdu na swoj¹ cenê oraz czas analizy umo liwia badania przesiewowe na skalê, jaka nie jest mo liwa przy zastosowaniu konwencjonalnych technik, a tak e w wielu przypadkach jest jedyn¹ mo liwoœci¹ diagnostyki pacjenta, która bez u ycia MLPA najczêœciej nie by³aby wykonana (np. diagnostyka delecji genu MeCP2 w zespole Retta, delecji eksonów BRCA1 w zespole dziedzicznego raka piersi i jajnika). Koszt sekwencjonowania ca³ego krytycznego genu jest wci¹ bowiem bardzo wysoki i wymaga du ego nak³adu pracy. Wstêpne postawienie rozpoznania dziêki badaniu technik¹ MLPA, nawet z zastrze eniem, e jest to badanie naukowe, jest cenn¹ informacj¹ dla lekarza prowadz¹cego. PODSUMOWANIE Liczba publikacji dotycz¹cych metody MLPA lub opisuj¹cych eksperymenty z wykorzystaniem tej techniki stale roœnie. W roku 2009, do lipca, opublikowano 111 prac indeksowanych w bazie PubMed dotycz¹cych tej techniki, a liczba wszystkich prac wynosi dotychczas 529. MLPA obok PCR, CGH i Southern Blottingu jest u yteczn¹ technik¹ laboratoryjn¹ analizy genomu i niew¹tpliwie doskonale uzupe³nia tê grupê technik. LITERATURA [1] http://www.mlpa.com [2] FRANCO-HERNÁNDEZ C, MARTÍNEZ-GLEZ V, DE CAMPOS JM, ISLA A, VAQUERO J, GUTIÉRREZ M, CASARTELLI C, REY JA. Allelic status of 1p and 19q in oligodendrogliomas and glioblastomas: multiplex ligationdependent probe amplification versus loss of heterozygosity. Cancer Genet Cytogenet 2009; 190: 93 96.

METODA MLPA ORAZ JEJ ZASTOSOWANIE W DIAGNOSTYCE GENETYCZNEJ 563 [3] GERDES T, KIRCHHOFF M, BRYNDORF T. Automatic analysis of multiplex ligation-dependent probe amplification products (exemplified by a commercial kit for prenatal aneuploidy detection). Electrophoresis 2005; 26: 4327 4332. [4] HESS CJ, ERRAMI A, BERKHOF J, DENKERS F, OSSENKOPPELE GJ, NYGREN AO, SCHUURHUIS GJ, WAISFISZ Q. Concurrent methylation of promoters from tumor associated genes predicts outcome in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 2008; 49: 1132 1141. [5] JANKOWSKI S, CURRIE-FRASER E, XU L, COFFA J. Multiplex ligation-dependent probe amplification analysis on capillary electrophoresis instruments for a rapid gene copy number study. J Biomol Tech 2008; 19: 238 243. [6] JEUKEN J, CORNELISSEN S, BOOTS-SPRENGER S, GIJSEN S, WESSELING P. JeukenMultiplex ligation-dependent probe amplification: a diagnostic tool for simultaneous identification of different genetic markers in glial tumors. J Mol Diagn 2006; 8: 433 443. [7] KIRCHHOFF M, BISGAARD AM, BRYNDORF T, GERDES T. MLPA analysis for a panel of syndromes with mental retardation reveals imbalances in 5.8% of patients with mental retardation and dysmorphic features, including duplications of the Sotos syndrome and Williams-Beuren syndrome regions. Eur J Med Genet 2007; 50: 33 42. [8] KOZLOWSKI P, JASINSKA AJ, KWIATKOWSKI DJ. New applications and developments in the use of multiplex ligation-dependent probe amplification. Electrophoresis 2008; 29: 4627 4636. [9] KOZ OWSKA J, ACZMAÑSKA I. Badania cytogenetyczne i molekularne wykorzystywane w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie. Diagnostyka laboratoryjna 2008; 44: 379 382. [10] ACZMAÑSKA I, PESZ K, ACZMAÑSKI. Application of Selected Methods Based on the Polymerase Chain Reaction in Medical Molecular Diagnostics. Adv Clin Exp Med 2009; 18: 85 92. [11] PALOMARES M, DELICADO A, LAPUNZINA P, ARJONA D, AMIÒOSO C, ARCAS J, MARTINEZ BERMEJO A, FERNÁNDEZ L, LÓPEZ PAJARES I. MLPA vs multiprobe FISH: comparison of two methods for the screening of subtelomeric rearrangements in 50 patients with idiopathic mental retardation. Clin Genet 2006; 69: 228 233. [12] REDON R, ISHIKAWA S, FITCH KR, FEUK L, PERRY GH, ANDREWS TD, FIEGLER H, SHAPERO MH, CARSON AR, CHEN W, CHO EK, DALLAIRE S, FREEMAN JL, GONZÁLEZ JR, GRATACÓS M, HUANG J, KALAITZOPOULOS D, KOMURA D, MACDONALD JR, MARSHALL CR, MEI R, MONT- GOMERY L, NISHIMURA K, OKAMURA K, SHEN F, SOMERVILLE MJ, TCHINDA J, VALSESIA A, WOODWARK C, YANG F, ZHANG J, ZERJAL T, ZHANG J, ARMENGOL L, CONRAD DF, ESTIVILL X, TYLER-SMITH C, CARTER NP, ABURATANI H, LEE C, JONES KW, SCHERER SW, HURLES ME.Global variation in copy number in the human genome. Nature 2006; 444: 444 454. [13] ROOMS L, REYNIERS E, WUYTS W, STORM K, VAN LUIJK R, SCHEERS S, WAUTERS J, VAN DEN ENDE J, BIERVLIET M, EYSKENS F, VAN GOETHEM G, LARIDON A, CEULEMANS B, COURTENS W, KOOY RF. Multiplex ligation-dependent probe amplification to detect subtelomeric rearrangements in routine diagnostics. Clin Genet 2006; 69: 58 64. [14] SCHOUTEN JP, MCELGUNN CJ, WAAIJER R, ZWIJNENBURG D, DIEPVENS F, PALS G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 2002 ; 30: 57 [15] STEGMANN AP, JONKER LM, ENGELEN JJ. Prospective screening of patients with unexplained mental retardation using subtelomeric MLPA strongly increases the detection rate of cryptic unbalanced chromosomal rearrangements. Eur J Med Genet 2008; 51: 93 105. Otrzymano:21.05. 2009 r. Przyjêto: 30.07. 2009 r. Dr n. med. Izabela aczmañska, Katedra i Zak³ad Genetyki Akademia Medyczna we Wroc³awiu, Marcinkowskiego 1, 50-368 Wroc³aw, tel. 71 784 12 56, fax: 71 784 00 63, e-mail: lacz@gen.am.wroc.pl Redaktor prowadz¹cy Maria Olszewska