dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG

Metody amplifikacji kwasów nukleinowych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej pj j w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Amplifikacja matrycy PCR Polymerase Chain Reaction Łańcuchowa reakcja polimerazy; Amplifikacjaoparta p o transkrypcję (NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification, TAS Transcription based Amplification System, 3SR Self sustained sequence Replication, TMA Transcription Mediated Amplification); SDA Strand Displacement Amplification Amplifikacja przemieszczającej się nici, MDA Multiple Displacement Amplification Amplifikacja sondy LCR Ligase Chain Reaction Łańcuchowa reakcja ligazy QBR Q beta replikacja Amplifikacja sygnału MetodabDNA bdna, Hybrid Capture

Amplifikacja matrycy

PCR (ang. g Polymerase Chain Reaction) Łańcuchowa reakcja polimerazy to reakcja in vitro, która naśladuje reakcję replikacji DNA w komórkach Służy do selektywnej amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro w milionowych ilościach jego kopii w przeciągu kilku godzin

Profil temperaturowo czasowy reakcji PCR. Każdy cykl złożony z 3 etapów: denaturacji (D), przyłączaniastarterów (A) i syntezy DNA (S). Początkowa denaturacja Cykl 1 Cykl 2 Cykl 3 94 D D D itd. Te emperatura a (C ) 72 S S S 55 A A 20 Teoretycznie po n cyklach otrzymuje się 2 do potęgi n, dwuniciowych cząsteczek DNA, czyli ich ilość wzrasta logarytmicznie. Wszystkie one powinny być wiernymi kopiami sekwencji oskrzydlanej przez startery. Cykli w zasadzie przeprowadza się od 20-40. Zatem z jednej matrycy DNA po 20 cyklach uzyskuje się amplifikację rzędu około 1 048 576, a po 30 cyklach rzędu 1 073 741 824. czas

Zastosowanie PCR Specjalnościś Diagnostyka chorób dziedzicznych Diagnostyka niektórych typów chorób nowotworowych Badania poziomu ekspresji genów Diagnostyka chorób infekcyjnych i inwazyjnych ludzi, zwierząt iroślin Badania epidemiologiczne (epidemie, endemie, pandemie) Genetyka Onkologia Wirusologia, bakteriologia, mykologia, parazytologia Epidemiologia Ustalenie zgodności tkankowej Ustalanie pokrewieństwa, badanie śladów biologicznych Transplantologia Medycyna sądowa Diagnostyka preparatów i leków farmaceutycznych Nauki farmaceutyczne Badania pokrewieństwa i przynależności taksonomicznej Systematyka (taksonomia), drobnoustrojów, analiza filogenetyczna ewolucjonizm Badania populacyjne drobnoustrojów Mikrobiologia środowiskowa genetyka populacyjna Badania zanieczyszczeń c eń mikrobiologicznych ch żywności i linii Mikrobiologia żywności technologicznych w systemie HACCP

NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification Opracowana w pod koniec lat 80.; po raz pierwszy zastosowana do diagnostyki w 1991 roku do wykrywania HIV NASBA naśladuje replikację wirusową

NASBA naśladuje replikację wirusową target 41 C starter1 starter2 Odwrotna transkryptaza RNase H Polimeraza RNA z faga T7 amplifikacja Aktualności biomerieux nr 44 Marzec 2008

NASBA do wykrywania cząsteczek RNA ssrna dntp RNA-DNA dsdna matryca dla fazy cyklicznej rntp Z każdej matrycowej cz DNA powstaje 100-1000 kopii RNA Rys. Aktualności biomerieux nr 44 Marzec 2008

NASBA w systemie real-time http://www.biomerieux diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinicaldiagnostics/dynpage?doc=cnl_prd_cpl_g_prd_cln_75

NASBA zastosowanie do wykrywania wirusów RNA (np. HIV 1) i DNA (np. HPV, HSV, enterowirusów) Dowykrywania pasożytów i bakterii np. Plasmodium falciparum, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella spp.

Izotermalna Amplifikacja SDA (ang. Strand Displacement Amplification) i MDA (ang. Multiple Displacement Amplification) jej zastosowanie w diagnostyce Polimeraza DNA Phi29 i TermoPhi w diagnostyce molekularnej l

SDA Strand Displacement Amplification M1 M2 S1 M1 Denaturacja i hybrydyzacja starterów (S) M2 S2 ( ) Polimeryzacja z zastosowaniem dntp i dntp αs S1 S2 Polimeraza bez aktywności egzonukleolitycznej wytwarza dsdna Nacięcie na jednej nici przez odpowiedni enzym restrykcyjny Polimeryzacja i odsuwanie nici (SDA) M2 M1 H b d j ó SDA d Hybrydyzacja starterów SDA do odsuniętych nici

Polimeraza Phi29 nie jest stosowana do PCR!!!!!!! Przeprowadza amplifikację typu protein primed ddna bazująca na mechanizmie i replikacji DNA faga Phi29 z Bacillus subtilis

Wykorzystanie właściwości polimerazy Phi29 zastosowanie do amplifikacji dużych kolistych matryc DNA (plazmidowe, wirusowe, bakteryjne) i amplifikacji genomowegodnaliniowego (również ludzkiego) nie jest potrzebna znajomość sekwencji matrycy w MDA w przeciwieństwie do metod opartych na PCR długość produktu może sięgać 10 40 kb przy zastosowaniu techniki SDA z polimerazą Phi29 Do amplifikacji można użyć minimalne ilości plazmidowego DNA 0.01 ng, natomiast genomowego DNA 1 5 ng; wysoki poziom amplifikacji 1 5 μg w krótkim czasie (4 godziny) pozwala a na amplifikację ację kolistych ostyc cząsteczek e bezpośrednio ed o z koloni oo bakteryjnej, ej, stoków glicerolowych, z krwi, łysinki czy wymazów eliminuje potrzebę hodowli nocnych, tylko po prostej lizie bez oczyszczania, wytwarzając wysokiej jakości matryce do sekwencjonowania, sondowania (hybrydyzacji), analizy chromosomalnej (mutacji, rearanżacji)

Zastosowanie polimeraz Phi29i i termophi Produkują wysoko cząsteczkowe DNA plazmidowe, fagowe, genomowe (do 6.5 Mb), DNA i cdna, mt DNA bezpośrednio z koloni, łysinki, wymazówek (dla organizmów niehodowalnych) liniowe, i kli koliste, jd jednoniciowe ii lub bdwuniciowe, i tandemowo powtórzone kopie matrycy, które można bezpośrednio wykorzystać do sekwencjonowania,trawienia enzymami restrykcyjnymi, klonowania, sondowania, reakcji PCR itp. Wysoka aktywność korektorska chroni przed błędami podczas amplifikacji możliwość analizy STR i SNP Dostępne kity diagnostyczne

Amplifikacja sygnału Wzrost sygnału wytwarzanego z sondy molekularnej jest teoretycznie możliwy, jeżeli grupa reporterowa będzie występowała w większej liczbie niż sonda, bądź jeżeli intensywność sygnału wytwarzanego przez cząsteczkę reporterową wzrośnie.

bdna (ang. branched DNA) opracowana przez Chiron Corporation Multimer amplifikacyjny sonda złożona Rozgałęziona strukura bdna tworzy wiele miejsc hybrydyzacji dla cząsteczek reporterowych związanych z enzymem Zastosowanie do wykrywania wirusów: Hepatitis B i C, HIV 1, cytomegalowirusa; czułość 10 4 10 5 cząsteczek bdna

Legenda Sonda capture (przechwytywacz) Sonda extender (przedłużacz) Matryca ss DNA bdna Hybrydyzacja sond do celu molekularnego i fazy stałej Hybrydyzacja bdna (amplifikacyjny multimer) Denaturacja DNA Hybrydyzacja sondy zwyznakowanej enzymem do bdna Dodanie substratu t (np. dioksoetanu) i mierzenie chemiluminescencji

Hybrid Capture Sonda RNA DNA targetowe A Hybryd RNA:DNA B Przeciwciała wychwytujące związane ą z fazą ą stałą ą (ang. capture antibody) Przeciwciała związane z AP Amplifikacja sygnału do 3000 x C

Kliniczne aplikacje Test ang. HbidC Hybrid Capture (HC) jest tk komercyjnie dostępny do detekcji wirusa HPV (papilomawirus), Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis oraz cytomegalowirusa (CMV) i wirusa białaczki ł HBV we krwi. HBV jest testem jakościowym, podczas gdy CMV test HC jest testem ilościowym. Ilość sygnałów wytwarzanych w teście jest proporcjonalna do ilości obecnego drobnoustroju. W porównaniu do PCR, technologia HC jest mniej czuła o 1.5 2.0 15 20log; specyficzność PCR i HC wynosi odpowiednio 100% i 93.8%.

F CTP ang. Cycling Probe Technology sonda A. DNA RNA DNA Q B. F kwas nukleinowy będący celem molekularnym dla sondy Hybryd Q wzmacnianie sygnału poprzez zastosowanie sond cyklicznych reakcja zachodzi w warunkach izotermalnych RNAza H C. F Q D. F Q

Amplifikacja sondy

A B D C Dodanie 4 oligonukleotydów A, B, C I D jako starterów i ligazy polinukleotydowej T4; A i D są ufosforylowane, Łańcuchowa reakcja ligazy (LCR, Gap LCR) Cel molekularny amplifikacji + Matryca typu dzikiego lub Denaturacja w 94 C Hybrydyzacja starterów do matrycy w 65 C X DNA z mutacja punktową (x) A B A B C D Reakcja ligacji zachodzi jeżeli oligonukleotydy są komplementarne z DNA matrycy C D Ligacja starterów A+B & C+D A+B C+D Brak ligacji i amplifikacji celu molekularnego z powodu niesparowania zasad Denaturacja w 94 C Hybrydyzacja starterów do matrycy w 65 C A B C D Termostabilna DNA ligaza (Ampligase) A+B C+D A B Cykle powtórzone np. 40 razy C+D A+B

Amplifikacjasondyoparta oparta na QB replikazie (RNA zależna polimeraza RNA bakteriofaga QB); Zastosowanie: detekcja Chlamydia trachomatis, N. gonorrhoae, cytomegalowirus, HIV 1, Plasmodium falciparum.

Metoda Amplifikacja matrycy: PCR Charakterystyka termiczna sondy/startery denaturacja w cyklach 2 Wymagane enzymy NASBA, 3SR, TMA TAS izotermalna denaturacja 2 polimeraza DNA odwrotna transkryptaza, RNAzaH, polimeraza RNA SDA, MDA Amplifikacja sondy: LCR Ligase Chain Reaction, Gap LCR) Q beta replikaza (QBR) izotermalna 4 polimeraza DNA, enzymy restrykcyjne denaturacja w cyklach 4 ligaza DNA, izotermalna 2 QB replikaza faga QB; polimeraza DNA