Komentarz do artykułu "Biomerkery w niewydolności serca" Biomerkery w niewydolności serca to temat szczególny. Jak słusznie zauważają Autorzy artykułu, rozległość badań jakie prowadzone są u chorych z niewydolnością serca jest ogromna i odzwierciedla wagę kliniczną problemu. Ta intensywność jest przyczyną odkrywania coraz to nowych substancji biochemicznych mogących dostarczać wiedzy o toczącym się procesie patologicznym. Substancja taka dołącza do długiej listy związków, których użyteczność jako biomarker jest przedmiotem analizy. W artykule Autorzy umieścili tabelę zawierającą wybór najczęściej badanych substancji. Nie jest to oczywiście lista kompletna, a i sam podział dokonany w artykule jest podziałem arbitralnym. Nie umniejsza to oczywiście walorów dokonanego przeglądu, myślę jednak iż na kanwie przedstawionego opracowania warto pokusić się o kilka uwag szerzej dotyczących biomarkerów w niewydolności serca. Ograniczę się przy tym do biomarkerów biochemicznych, inne markery nie będą dyskutowane. Nie będę także odnosił się szczegółowo do markerów wymienionych przez Autorów. Ich szczegółowa analiza byłaby zbyt rozległa. Proszę pozwolić mi najpierw zwrócić uwagę na często występujące nieporozumienie (Autorzy nie podnoszą tego tematu, więc moje uwagi nie dotyczą opracowania). W literaturze często przewija się termin biomarker czyli wskaźnik biologiczny oraz mediator. Bywa, iż terminy te używane są zamiennie. Nie zawsze jest to uprawnione i warto pojęcia te przybliżyć. Zgodnie z przytaczaną przez Autorów definicją wskaźnika mówiącą, iż jest to cecha, którą można w sposób obiektywny zmierzyć i która dostarcza informacji o procesach biologicznych, patologicznych lub o odpowiedzi organizmu na działania terapeutyczne, idealnemu wskaźnikowi biologicznemu można przypisać następujące cechy: proces biologiczny (fizjologiczny czy też obecny tylko w warunkach patologii), dzięki któremu wskaźnik jest obecny w płynach ustrojowych jest w pełni opisany i zrozumiany (np. uwalnianie troponiny z komórek miokardium), stężenie czy aktywność wskaźnika pozostaje w zależności statystycznej, najlepiej proporcjonalnej do toczącego się procesu lub jego skutków (wzrost liczby uszkodzonych miocytów przekłada się wprost na stężenie troponiny), wskaźnik jest swoisty dla danego procesu (np. uszkodzenie komórek innych mięśni nie powoduje wzrostu stężenia troponin), czynniki wpływające na stężenie lub aktywność wskaźnika, a które nie mają związku z procesem charakteryzowanym przez wskaźnik, są dobrze poznane i mogą być uwzględnione w analizie (np. wpływ na stężenie troponiny wielkości filtracji kłębuszkowej), nasilanie się lub wygasanie procesu powoduje proporcjonalne zmiany stężenia czy aktywności wskaźnika w płynach ustrojowych (np. wzrost stężenia troponin wraz ze wzrostem masy uszkodzonych komórek), 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 1/7
stosowana terapia znajduje odzwierciedlenie w zmianach stężenia czy aktywności wskaźnika i pozwala na ocenę przebiegu procesu, poznany jest czas pojawiania i zanikania wskaźnika w płynach ustrojowych po zadziałaniu czynnika indukującego proces i w związku z jego wygaszaniem (np. czas pojawienia się troponin we krwi od chwili zamknięcia tętnicy wieńcowej), w przypadku procesów patologicznych wielkość stężenia czy aktywności wskaźnika oraz jego zmiany w czasie są ściśle związane z rokowaniem (chorobowość czy śmiertelność), w końcu, powinny istnieć wystandaryzowane testy diagnostyczne, które pozwalają na powtarzalny pomiar wskaźnika w płynach ustrojowych. Oczywiście jest to zestaw wymogów, które spełniają nieliczne substancje, większość wykorzystywanych w medycynie biomarkerów ma jedynie niektóre z wymienionych cech i świadomość takich ograniczeń musi być ostatnią cechą stosowanego wskaźnika biologicznego. Pomiędzy stężeniem wskaźnika a nasileniem procesu fizjologicznego czy patologicznego istnieje zależność statystyczna. Nie przesądza to o istnieniu związku przyczynowo - skutkowego. Nawet bardzo wysoka korelacja pomiędzy stężeniem wskaźnika a przebiegiem procesu nie wyklucza dużych rozbieżności pomiędzy nimi. Może to mieć bardzo poważne znaczenie na płaszczyźnie klinicznej, gdzie wyciągane na podstawie stężenia wskaźnika wnioski mogą powodować błędne decyzje diagnostyczne czy lecznicze. W odróżnieniu od wskaźnika biologicznego, który mówiąc potocznie jest jedynie świadkiem wydarzeń, mediatorem jest substancja obecna w płynach ustrojowych, która jest aktywnym uczestnikiem procesu patologicznego. Między aktywnością procesu a stężeniem substancji mediatorowej istnieje zależność przyczynowo - skutkowa. Dostrzegana w trakcie analiz zależność statystyczna jest jej odzwierciedleniem, a brak ścisłej zależności funkcyjnej spowodowany jest działaniem czynników zakłócających zależność i niedokładnościami pomiaru. Najlepiej jest oczywiście gdy wskaźnik biologiczny jest równocześnie mediatorem. Mamy w takiej sytuacji pewność, iż poza czynnikami wynikającymi z niedoskonałości pomiaru i czynnikami biologicznymi modyfikującymi stężenie mediatora, zmiany jego stężenia czy aktywności w płynach pozostają w związku przyczynowym z zasadniczym procesem. Analizując wybrany związek pożyteczna jest odpowiedź na pytanie, czy mamy do czynienia z mediatorem, czy też wybrany związek jest jedynie wskaźnikiem analizowanego procesu. Stężenie troponin jest uznanym wskaźnikiem uszkodzenia miokardium i spełnia większość podanych powyżej postulatów. Nie jest jednak wolne od ograniczeń wynikających z obecności czynników modyfikujących ich stężeniem. Przykładem sytuacji, w której ma to znaczenie jest rozpoznawanie ostrego zespołu wieńcowego (i wdrażanie odpowiednich procedur) na podstawie nieznacznego zwiększenia stężenia troponin u osoby z mocznicą lub po spożyciu alkoholu w przypadku braku jakichkolwiek innych przesłanek klinicznych i elektrokardiograficznych uzasadniających takie podejrzenie. Obecność podwyższonego stężenia troponin dowodzi uszkodzenia miokardium i ma znaczenie prognostyczne, jednakże nie musi dawać podstaw wykonywania koronarografii. 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 2/7
Wskaźnikiem i jednocześnie mediatorem jest natomiast stężenie cholesterolu LDL. Modyfikując stężenie cholesterolu LDL statyną mamy pewność ingerencji w proces miażdżycowy i - co wiemy z dużych badań klinicznych - wpływamy na chorobowość i śmiertelność pacjentów. Autorzy słusznie podkreślają, iż wskaźniki biologiczne znajdują szerokie zastosowanie. Warto uświadomić sobie, iż badanie markerów które w toku dalszego procesu poznawczego okazują się być mediatorami stanowi od zarania dociekań biologicznych fundament rozwoju współczesnej wiedzy. Każde badanie biochemiczne, które jest wykonywane w laboratoriach naukowych czy klinicznych jest badaniem markera / mediatora. Jeżeli zadać sobie pytanie do czego służą badania biomarkerów we współczesnej nauce, możemy wymienić przynajmniej 4 wielkie obszary: 1. badanie przebiegu procesów fizjologicznych, 2. badanie historii naturalnej procesów patologicznych, 3. poprzez badanie odpowiedzi danego procesu (stężenia odpowiedniego markera / mediatora) na czynnik o charakterze diagnostycznym lub terapeutycznym, można dokonywać oceny skuteczności i bezpieczeństwa interwencji, 4. poprzez obserwację zachowania się biomarkerów w ramach historii naturalnej procesu patologicznego lub zachowania się ich w ramach diagnostycznej czy terapeutycznej interwencji, możliwe jest budowanie modeli, na podstawie których przewiduje się przebieg procesu. Stwarza to również możliwość monitorowania przebiegu interwencji (np. leczenia) i wprowadzania bieżących poprawek. Niewydolność serca jest zespołem chorobowym, którego historia naturalna rozpoczyna się w oczywiście w sercu lub wielkich naczyniach, ale w dalszej kolejności obejmuje nieprawidłowości funkcji praktycznie wszystkich istotnych narządów i układów. Zgodnie z koncepcją ciągłości zjawisk patofizjologicznych zaproponowaną w początku obecnego stulecia przez American Heart Association, na zagadnienie należy jednak spojrzeć szerzej. Niewydolność serca to konsekwencja ewolucji od czynników ryzyka (klasa A), poprzez obecność uszkodzenia serca bez objawów klinicznych niewydolności (klasa B), aż do okresu kiedy objawy niewydolności są okresowo (klasa C) lub stale u chorego obecne (klasa D). Jeśli odnieść do tej ewolucji wymienione powyżej 4 obszary wykorzystania biomarkerów to widać, że dla badań z zakresu niewydolności serca możemy wykorzystywać wszystkie z wyjątkiem pierwszego. I tak, zastosowanie w diagnostyce znajdują liczne biomarkery pozwalające szacować ryzyko rozwoju niewydolności serca. Wymieńmy chociażby wspominany już cholesterol LDL, którego zwiększone stężenie wiąże się z ryzykiem rozwoju miażdżycy, ostrego zespołu wieńcowego i uszkodzenia serca. Biomerkerem szeroko wykorzystywanym w tym celu może być na przykład stężenie glukozy, kreatyniny i inne.zasadniczym zagadnieniem jest jednak zbudowanie modeli, które pozwolą kategoryzować ryzyko rozwoju uszkodzenia serca a w dalszej ewolucji rozwoju niewydolności serca u danego chorego. O zagadnieniu tym mowa będzie w dalszej części. Rozpoznanie uszkodzenia serca to oczywiście nowe wyzwanie diagnostyczne. Tutaj również jest miejsce dla biomarkerów i ich zastosowanie w diagnostyce, na przykład ostrego zespołu wieńcowego jest powszechnie znane. Każdy z wymienionych przez Autorów marker: troponiny I i T, sercowe białko wiążące kwasy tłuszczowe (są inne np. wątrobowe i jelitowe), czy łańcuchy 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 3/7
lekkie miozyny mogą znaleźć swoje zastosowanie. Nie są one jednak tożsame i ich wybór zależy od tego jakie zagadnienie chcemy badać. Należy zdać sobie sprawę, iż związki te różnią się w zakresie czasu pojawiania się we krwi po uszkodzeniu, specyficzności dla uszkodzenia miokardium, stopnia przebadania u chorych z niewydolnością serca (troponiny > sercowe białka wiążące kwasy tłuszczowe > łańcuchy lekkie miozyny typu 1), a przed wszystkim dostępności wystandaryzowanych narzędzi do ich oznaczania. To ostatnie może przesądzać o wiarygodności danych i możliwości ich porównań pomiędzy różnymi eksperymentami. Jeżeli zależy nam na możliwie najwcześniejszym uwidocznieniu uszkodzenia po zadziałaniu szkodliwego bodźca, albo chcemy uwidocznić możliwie najmniejsze uszkodzenie specyficzne dla miokadium nasz wybór markera powinien być odmienny. Poza jednorazowym incydentem uszkodzenia (w zawale) lub pod działaniem długotrwałego czynnika szkodliwego (zapalenie, alkohol, leki, nadciśnienie tętnicze) w patogenezie niewydolności serca zasadnicze znaczenie odgrywa patologiczna przebudowa jego struktur. Mniej lub bardziej wiarygodne śledzenie tego procesu jest dzisiaj możliwe poprzez analizę zachowania się licznych związków produkowanych przez komórki obecne w samym sercu. Część z nich - a wiemy to z licznych badań eksperymentalnych u zwierząt i ludzi - ma charakter mediatorów, część jest tylko markerem toczącego się procesu. Wśród mediatorów wymienić można związki wytwarzane wyłącznie miejscowo w sercu w odpowiedzi na pojawienie uszkodzenia, część produkowana jest zarówno lokalnie jak i miejscowo jako wyraz ogólnoustrojowej adaptacji do zmienionych warunków krążenia. Wśród pierwszych wymienić można metaloproteinazy i ich inhibitory modulujące proces przebudowy serca, wśród drugich angiotensynę II, noradrenalinę, aldosteron, wazopresynę, endotelinę i szereg innych. Świadków zjawisk zachodzących w sercu znamy także cały szereg. Na pierwszym miejscu wymienić można peptydy natriuretyczne typu A i B oraz adrenomedulinę. Umieszczenie peptydów natriuretycznych i adrenomeduliny w klasie markerów nie mediatrów prawdziwe jest jedynie w odniesieniu do zjawisk w samym sercu. Wymienione związki wywierają swój biologiczne działania poza sercem Przykładem może być lipolityczne działanie peptydów natriuretycznych, które przyczynia się do wyniszczenia i poprzez zwiększenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych we krwi do insulinooporności i cukrzycy. Są to mniej poznane działania peptydów natriertycznych, o innych działaniach na poziomie nerek i w licznych układach endokrynnych nie będziemy tutaj wspominać. Peptydy natriuretyczne pozostają złotym standardem diagnostycznym w różnicowaniu przyczyn duszności i mogą być pomocne w uchwyceniu chwili, kiedy ewolucja naturalna choroby serca doprowadza do przejścia z fazy bezobjawowego uszkodzenia (B) do fazy objawowej (C). Uszkodzenie serca i przejście do fazy objawowej odbywa się najczęściej drogą destabilizacji krążenia z akumulacja i nieprawidłową (centralną) dystrybucją płynu zewnątrz komórkowego. Dla nieprawidłowej dystrybucji wystarczy zmiana funkcji samego serca i wtórna wazokonstrykcja. Akumulacja płynu wymaga adaptacyjnej zmiany funkcji nerek. Tutaj otwiera się obszar badań i wykorzystania biomarkerów nie wspominany przez Autorów. Współcześnie funkcję nerek możemy badać w o wiele szerszym zakresie niż jeszcze przed dekadą. Dysponujemy nieźle przebadanymi markerami ostrego uszkodzenia nerek, jak NGAL (lipokaina skojarzona z żelatynazą leukocytów), 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 4/7
KIM-1 (molekuła uszkodzenia nerek typu 1) czy cystyna C oraz markerami czynności wydalniczej nerek jak cystatyna C. Pierwsza dekompensacja krążenia i przejście niewydolności w fazę objawową niezwykle komplikuje patofizjologię zespołu chorobowego. Po raz pierwszy mamy do czynienia z klinicznie istotnymi zmianami czynności licznych narządów. Dla scharakteryzowania sytuacji potrzebujemy licznych biomarkerów: opisujących uszkodzenie miokardium, jego metabolizm i obciążenie hemodynamiczne, niezbędne są wskaźniki odzwierciedlające funkcje wątroby, nerek, endokrynną regulację układu krążenia i wiele innych. Ich znaczenie może być całkowicie różne zależnie od postaci klinicznej dekompensacji krążenia (wstrząs kardiogenny, kardiogenny obrzęk płuc etc.) oraz od zakresu uszkodzenia narządów. Czemu służą wskaźniki biologiczne na tym etapie? Prawidłowo wykorzystywane pozwalają racjonalizować proces diagnostyczny, dawać podstawy do wyboru optymalnej terapii i umożliwiają jej monitorowanie oraz dostarczają narzędzi prognostycznych w zakresie różnych aspektów chorobowości oraz w zakresie śmiertelności. Biorąc pod uwagę wielokierunkowość zastosowań łatwo zauważyć, iż jeden biomarker nie może spełniać tak różnorodnych ról. Istota każdego wyboru klinicznego (diagnostycznego, terapeutycznego) opiera się na szacowaniu ryzyka wybranej procedury wobec potencjalnych korzyści z jej przeprowadzenia. Wsparciem dla dokonania racjonalnej decyzji jest prognozowanie. Prognozowanie może dotyczyć bardzo różnych zagadnień. W pierwszej kolejności prognozowanie winno dotyczyć ryzyka wybranej procedury diagnostycznej. Ryzyko estymowane na podstawie odpowiednio dobranego biomarkera lub biomarkerów musi być oceniane w świetle potencjalnych korzyści. Kolejny krok to decyzje terapeutyczne. Ponownie ich racjonalny wybór może być dokonany z pomocą biomarkera lub biomarkerów, a zasada podejmowania decyzji opiera się na ważeniu zagrożenia stosowaną terapią wobec je potencjalnych korzyści. Aby dostarczyć wiarygodnych informacji w jednym z wymienionych obszarów decyzji klinicznych niezbędny jest wybór odpowiedniego wskaźnika lub wskaźników. Wybór ten niejednokrotnie nie jest łatwy. Aby dokonać go w sposób racjonalny warto pamiętać, iż wybrany wskaźnik powinien spełniać określone kryteria, a jego wartość we wspomaganiu decyzji klinicznej powinna być właściwie udokumentowana. Co to oznacza? Wstępnym etapem takiej analizy musi być wykazanie związku statystycznego (a lepiej przyczynowo - skutkowego) pomiędzy stężeniem czy aktywnością potencjalnego markera w płynach ustrojowych a zjawiskiem, której ryzyko ma ów marker przewidywać. Ustalenie takiej zależności daje przesłanki do dalszych testów. Dla przykładu, jeżeli chcemy ustalić ryzyko wystąpienia uszkodzenia nerek po podaniu kontrastu winniśmy posłużyć się markerem, o którym wiemy iż wiarygodnie opisuje czynność wydalniczą nerek (stężenie kreatyniny, estymowana filtracja kłębuszkowa, cystatyna C). Wybór optymalnego biomarkera opierać się winien na wykonanych wcześniej prospektywnych badaniach kohortowych, w których zbadano zmian odpowiedniego wskaźnika z ryzykiem zjawiska, które badamy. Przez ryzyko rozumie się wystąpienie w prospektywnej obserwacji zdarzenia, którego prawdopodobieństwo zamierzamy modelować na podstawie biomarkera. Tym zdarzeniem może 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 5/7
być wystąpienie uszkodzenia nerek rozumiane jako określona zmiana markera. Mogą być to jednak inne zdarzenia, takie jak: śmierć z wszystkich przyczyn, śmierć ze ściśle zdefiniowaną przyczyną - na przykład nagła śmierć sercowa, czy różne aspekty chorobowości. Taką chorobowością może być zawał serca, konieczność rewaskularyzacji, hospitalizacja z każdej lub też wcześniej określonej przyczyny i dowolne inne. Możliwe jest także zdefiniowanie tak zwanych złożonych punktów końcowych, takich jak na przykład: zawał serca lub udar mózgu. Podejście to ma jednak słabość, która ujawnia się w przypadku gdy związek badanego markera z zawałem i udarem jest odmienny. W tym przypadku wartość wskaźnika dla przewidywania tak określonego punktu końcowego ulega osłabieniu nawet wtedy, gdy statystyczny związek z tak zdefiniowanym markerem jest bardzo istotny. Przewidywanie ryzyka na podstawie biomarkera wymaga stworzenia modelu, w którym zdarzenia przypisywane są określonym wartościom wskaźnika. Wiarygodność takiego modelu dla skutecznego przewidywania zdarzeń w przyszłości (czyli dla określania ryzyka zdarzenia) w pierwszej mierze warunkowana jest liczbą zarejestrowanych zdarzeń a nie liczebnością obserwowanej populacji. Mała liczebność zdarzeń w dużej populacji badanych oznacza małe ryzyko zdarzenia i trudność w ich modelowaniu na podstawie wskaźnika. Liczebność zdarzeń można zwiększyć poprzez wydłużenie czasu obserwacji. W przypadku jednak gdy ryzyko zmienia się w czasie może to prowadzić do zafałszowania związku pomiędzy ryzykiem a markerem. Przykładem takiej sytuacji może być analiza wartości NTproBNP w przewidywaniu ryzyka nagłej śmierci sercowej u chorych z niewydolnością serca, których część w trakcie obserwacji została poddana zabiegowi implantacji ICD. U tej części badanej grupy ryzyko nagłego zgonu zmniejszyło się bez związku z wyjściowym stężeniem biomarkera, ale w odpowiedzi na interwencję. Nie uwzględnienie tego faktu w tworzeniu statystycznego modelu powoduje zmniejszenie skuteczności dyskryminacyjnej modelu. Bardzo ważnym etapem w ocenie wartości badanego wskaźnika jest utworzenie i porównanie surowego i adjustowanego modelu ryzyka. O co chodzi? Badając związek statystyczny pomiędzy stężeniem na przykład BNP a ryzykiem zgonu osoby z niewydolnością serca w przeprowadzonym prospektywnym badaniu kohortowym stwierdzamy, iż u pacjentów zmarłych stężenia te były wyższe niż u żyjących. Staramy się zbudować teraz model matematyczny, w którym stężenie BNP jest zmienną wyjaśniającą (niezależną) punkt końcowy obserwacji, czyli zgon. Czyniąc to dla krótkiego okresu obserwacyjnego lub dla ściśle zdefiniowanego dla każdej osoby okresu obserwacji, na przykład 1 roku, wykorzystujemy zwykle model regresji logistycznej, dla grupy osób o zróżnicowanym okresie obserwacji posługujemy się modelowaniem proporcjonalnego hazardu Coxa. Efektem tworzenia takiego modelu jest podanie względnego ryzyka z zakresem ufności, czyli liczby mówiącej jak zmienia się prawdopodobieństwo zdarzenia (śmierci) wraz ze wzrostem stężenia BNP. Zwykle prawdopodobieństwo to podaje się w przeliczeniu na jednostkową zmianę biomarkera, na przykład na 1 odchylenie standardowe. Tak tworzy się model surowy - jednoczynnikowy. Mamy jednak świadomość, iż poza domniemanym związkiem BNP ze śmiertelnością także inne cechy chorych w badanej grupie mogą mieć taki związek. Są nimi oczywiście wiek, płeć, ale także etiologia niewydolności serca. Musimy ponadto sprawdzić czy wartość naszego biomarkera w modelu przewidującym ryzyko utrzymuje się po uwzględnieniu w nim innych typowych markerów ryzyka, takich jak: klasa NYHA, wielkość frakcji wyrzutowej lewej komory, stopień jej rozstrzeni itd. 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 6/7
Im więcej parametrów opisujących ryzyko uwzględnimy w takim adjustowanym modelu tym większą będziemy mieli pewność, iż w przypadku potwierdzenia istotności modelu, badany przez nas wskaźnik będzie,,dodawał" zdolność predykcyjną modelu. Nie wdając się szczegółowe narzędzia statystyczne stosowane w tym celu należy podkreślić, iż wykazanie zdolności wskaźnika do zwiększania zdolności predykcyjnej modelu daje do podstawy do uznania go wartościowe, nowe narzędzie diagnostyczne. Od zasady tej mogą być jednak wyjątki. Może się zdarzyć, że nowy badany wskaźnik nie poprawia zdolności predykcyjnej modelu, jest jednak tańszy i prostszy do zastosowania. Są to okoliczności, które mogą uzasadnić dołączenie go do arsenału nowych wskaźników biologicznych. Jak w kontekście poruszonych powyżej zagadnień ocenić zestaw biomarkerów omawianych przez Autorów? Wiedza na temat tych markerów jest niezwykle zróżnicowana. O wielu spośród nich nie wiemy czy są markerem czy są równocześnie mediatorem. Większość z nich nie wyszła poza etap badań zmierzających do ustalenia ich znaczenia w patofizjologii niewydolności serca. Jedynie o kilku (peptydy natriuretyczne, troponina T, kwas moczowy i TNF) możemy powiedzieć, iż osiągnęły etap predykatorów pozwalających modelować prawdopodobieństwa różnych zdarzeń klinicznych. Biomarkery w medycynie, w tym w niewydolności serca to niezwykle ważnych obszar badań podstawowych i codziennej diagnostyki klinicznej. W niniejszym komentarzy starałem się uświadomić jednak, iż wybór biomarkera do bieżącego zadania klinicznego powinien być poprzedzony dogłębną analizą jego cech. Wybór dokonany bez takiej analizy może prowadzić do rozczarowujących wyników i być jedynie marnotrawieniem czasu, energii i środków. 2000-2016 Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 7/7