Chemia Analityczna Chromatografia Tłumaczyła: inż. Karolina Hierasimczyk Korekta: dr hab. inż. Waldemar Wardencki, prof. nadzw. PG prof. dr hab. inż. Jacek Namieśnik Część II Terminy i definicje. Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska 2002 1
SPIS TREŚCI Wprowadzenie 1. Co to jest chromatografia? 1.1. Proces chromatograficzny 1.2. Podział metod chromatograficznych 1.3. Co to jest chromatografia gazowa? 2. Terminy i definicje...ii/2 2.1. Czas retencji (t R )...II/3 2.2. Współczynnik retencji (k)...ii/3 2.3. Indeks retencji (I)...II/12 2.4. Współczynnik rozdzielenia...ii/14 2.5. Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny...ii/14 2.6. Rozdzielczość (R S )...II/17 2.7. Stosunek faz (β)...ii/21 3. Kolumny kapilarne do chromatografii gazowej 3.1. Fazy stacjonarne 3.1.1. Polisiloksany 3.1.2. Glikole polietylenowe 4. Gazy nośne 5. Dozowniki 5.1. Dozowniki wykorzystujące odparowanie 5.2. Dyskryminacja związków dozowanych 5.3. Opłukiwanie membrany 5.4. Dozowanie na kolumnę typu Megabore 5.5. Dozowniki z dzieleniem strumienia gazu (split) 5.6. Dozownik bez podziału strumienia gazu 6. Detektory w GC 6.1. Detektor cieplno-przewodnościowy (TCD) 6.2. Detektor płomieniowo jonizacyjny (FID) 6.3. Detektor wychwytu elektronów (ECD) 6.4. Detektor azotowo fosforowy (NPD) 6.5. Detektor płomieniowo fotometryczny (FPD) 6.6. Detektor fotojonizacyjny (PID) 6.7. Spektrometr mas (MS) 7. Analiza ilościowa 2
2. Terminy i definicje 2.1. Czas retencji (t R ) Czas retencji (t R ) jest to czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę. Czas retencji przypisany jest pikowi odpowiadającemu danej substancji. Czas zatrzymania składnika jest miarą ilości czasu jaki substancja rozpuszczona spędza w kolumnie. Jest sumą czasu spędzonego w fazie stacjonarnej i w fazie ruchomej. Czas retencji nie zatrzymywanego związku Czas retencji substancji nie zatrzymywanej lub czas martwy (t M lub t O ) to czas w jakim nie zatrzymywany związek przechodzi przez kolumnę. Nie zatrzymane cząsteczki substancji rozpuszczonej nie oddziałują z fazą stacjonarną, lecz przemieszczają się w dół kolumny z tą samą szybkością z jaką przemieszcza się strumień gazu nośnego. Jest to równoważne z czasem jaki związek spędza w fazie ruchomej. Czas martwy piku otrzymany jest poprzez dozowanie substancji nie zatrzymywanych i określeniu ich czasu retencji. 2.2. Współczynnik retencji (k) Współczynnik retencji (k) jest inną miarą retencji. Jest to stosunek ilości czasu jaki substancja rozpuszczona spędza w fazie stacjonarnej i ruchomej (gaz nośny). 3
Obliczony jest za pomocą równania 1. Współczynnik retencji wcześniej nazywany był współczynnikiem podziału lub współczynnikiem pojemnościowym. Ponieważ wszystkie substancje rozpuszczone spędzają tę samą ilość czasu w fazie ruchomej, współczynnik retencji jest miarą retencji przez fazę stacjonarną. Jest pomiarem względnym i ma charakter liniowy. Na przykład, substancja o k = 6 jest podwójnie tak zatrzymana przez fazę stacjonarną (nie przez kolumnę) jak substancja o k = 3. Współczynnik retencji nie dostarcza wszystkich informacji o zatrzymaniu składnika; dostarcza informacje o względnej retencji. Dla nie zatrzymywanej substancji k = 0. Współczynnik retencji (k) k = (t R t M ) / t M = t R / t M (1) t R = czas retencji t R = redukowany czas retencji t M = czas retencji związku nie zatrzymywanego KSZTAŁT PIKU Dyfuzja jest powszechnie obserwowanym zjawiskiem. Jakakolwiek część niezwiązanych cząsteczek będzie dążyć do rozproszenia w zajmowanej objętości. Jeżeli tak się dzieje to następuje spadek ich stężenia i wzrasta ich entropia. Dlatego spełnione jest jedynie drugie prawo termodynamiki. Mówiąc o dyfuzji, często myśli się o cząsteczkach poruszających się z obszaru o wysokim stężeniu do obszaru o niskim stężeniu. Takie założenie, z góry przyjmuje, iż cząsteczki są świadome obszarów o wysokim i niskim stężeniu. W rzeczywistości dyfuzja odbywa się we wszystkich kierunkach ponieważ ruchy cząsteczek są przypadkowe. Ostatecznie jednak, obszar o niższym stężeniu cząsteczek zostanie w nie wzbogacony a obszar o wyższym stężeniu ulegnie zubożeniu. Więcej cząsteczek popłynie z obszaru o wyższym stężeniu do obszaru o niższym stężeniu, i nastąpi ogólne wyrównanie poziomu stężenia. Na początku profile substancji rozpuszczonej mają kształt symetrycznych pików, profile stężenia jednak ulegają w czasie zmianom i przybierają odpowiednie kształty: 4
IZOTERMA SORPCJI Ilość poszczególnej substancji zasorbowanej przez fazę stacjonarną zależy od stężenia w fazie ruchomej. Stosunek pomiędzy ilością zasorbowaną a stężeniem w fazie ruchomej, przy stałej temperaturze, nazywany jest izotermą sorpcji. Sorpcja jest ogólnym pojęciem obejmującym kilka mechanizmów, takich jak, proces adsorpcji (np. oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami substancji rozpuszczonej a powierzchnią ciała stałego), podział (rozcieńczenie cząsteczek substancji rozpuszczonej w cieczy), wymianę jonową (wymiana jonów substancji rozpuszczonej z jonami w fazie stacjonarnej) i wykluczanie (ograniczenie dyfuzji cząsteczek substancji rozpuszczonej poprzez porowatą fazę stacjonarną). Izoterma sorpcji i kształt piku Poniższe rysunki przedstawiają przebieg izotermy gdy stosunek pomiędzy stężeniem badanej substancji w fazie stacjonarnej (Cs) i stężeniem substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej (Cm) jest liniowy. Stosunek Cs / Cm określa nachylenie krzywej. 5
Jest on określony jako współczynnik podziału K. System chromatograficzny, w którym relacja ta jest liniowa opisany jest jako chromatografia liniowa, której efektem jest rozdzielenie substancji i uzyskanie pików typu gaussowskiego. Powyższe rysunki ukazują izotermę liniową i charakterystykę pasma chromatograficznego z którym jest związana. Retencja w chromatografii Poniższy rysunek przedstawia sytuację, w której próbka wprowadzona jest do kolumny w fazie ruchomej. W praktyce, faza stacjonarna będzie rozproszona całkowicie w kolumnie ale dla wygody możemy wyobrazić sobie, że zajmuje ona połowę kolumny i że faza ruchoma zajmuje drugą połowę kolumny. Gdy próbka (niesiona przez fazę ruchomą) zetknie się z fazą stacjonarną, rozdzieli się miedzy te dwie fazy zgodnie z wartościami ich współczynników podziału (K D lub K). Jest to równoważne z separacją w pierwszym lejku separacyjnym. Jednakże w przeciwieństwie do lejka separacyjnego, nie trzeba czekać aby otworzyć zawór lejka i pozwolić próbce przepłynąć do drugiego lejka. Nie musimy także czekać aż próbka osiągnie równowagę pomiędzy dwoma fazami zanim przejdzie do drugiego kroku separacji. Oznacza to, że jeżeli równowaga ma być osiągnięta, musi to nastąpić natychmiastowo. Gdy już jest rozdzielona pomiędzy dwie fazy, próbka pozostająca w fazie ruchomej będzie poruszać się dalej w dół kolumny napotykając nową fazę stacjonarną. Próbka ponownie poruszać się będzie z fazy 6
ruchomej do fazy stacjonarnej (proces ten zwany jest sorpcją) aż ponownie zostanie osiągnięta równowaga. Ponieważ stężenie próbki w fazie ruchomej w pierwszej sekcji zostało zmniejszone, próbka przemieszczać się będzie z fazy stacjonarnej z powrotem do fazy ruchomej (proces ten nazywany jest desorpcją) w celu utrzymania stałej wartości współczynnika podziału. Proces ten zobrazowany jest na Rysunku (ii). W bardzo krótkim czasie cała próbka zostanie zdesorbowana z fazy stacjonarnej w pierwszej sekcji kolumny i porwana przez fazę ruchomą do drugiej sekcji kolumny. Ostatecznie, równowaga znowu zostanie ustalona a próbka w całości znajdzie się w drugiej sekcji kolumny (Rys. (iii)). Proces sorpcji i desorpcji będzie trwał (Rys. (iv)) aż próbka dojdzie do końca kolumny i zostanie wymyta z kolumny. Chromatografiści nie stosują terminu lejki separacyjne lub sekcje kolumn ale zapożyczają terminologię z techniki destylacji, z którą chromatografia ma pewne cechy wspólne. Przez analogię z destylacją, każda sekcja kolumny chromatograficznej w której przyjmuje się, iż równowaga została osiągnięta znana jest jako półka teoretyczna. Przyjrzeliśmy się procesowi chromatograficznemu, który przebiega jako seria dyskretnych kroków tak jak w przypadku lejka separacyjnego. Ale chromatografia jest dynamicznym procesem a nie serią statycznych kroków. Jednakże, czyniąc nasze kroki lub teoretyczne półki bardzo małymi, procesy statyczne i dynamiczne stają się równoważne. Długość kolumny odpowiadająca teoretycznym półkom nazwana jest Wysokością Równoważną Półce Teoretycznej (Height Equivalent to a Theoretical Plate - HETP lub H). Im mniejsza wartość H tym więcej kroków równoważnych zawiera kolumna (jest to równoważne z przeprowadzaniem dużych ilości kolejnych separacji w lejku) i przyjmuje się, że kolumna posiada dużą sprawność. W praktyce, oznacza to że kolumna sprawdziłaby się lepiej przy separacji składników mieszanin. Odnosząc się ponownie do rysunków przedstawianych powyżej, jeżeli strzałki wskazują kierunek, w którym poruszają się cząsteczki substancji, obserwujemy iż w fazie stacjonarnej nie odbywa się ruch bezpośrednio wzdłuż kolumny. Cząsteczki poruszają się tylko przez granicę pomiędzy fazą stacjonarną i fazą ruchomą, a wzdłuż kolumny tylko w czasie kiedy znajdują się w fazie ruchomej. W fazie ruchomej, wszystkie cząsteczki poruszają się z taką 7
samą prędkością (µ), gdzie µ = prędkość liniowa fazy ruchomej, a więc czas spędzony w fazie ruchomej jest taki sam dla wszystkich cząsteczek. Czas ten nazwany jest czasem retencji substancji nie zatrzymywanej lub martwym czasem kolumny (t M ). Zróżnicowanie migracji wynika z czasu (t S ) jaki różne substancje spędzają w fazie stacjonarnej. Składnik (A) z niskim współczynnikiem podziału, K, w jakimkolwiek czasie będzie posiadał mniej cząsteczek w fazie stacjonarnej w porównaniu do innego składnika (B) z wyższym współczynnikiem podziału, dlatego będzie mniej opóźniony i szybciej przemieści się przez kolumnę. W związku z tym, stosunek przemieszczania się składnika, (Rm), jest odwrotnie proporcjonalny do wartości jego współczynnika podziału; stosunek przemieszczania się Rm proporcjonalne do 1 / K Składniki mieszaniny będą odseparowane tylko wtedy gdy ich współczynniki podziału pomiędzy fazą stacjonarną a fazą ruchomą będą się różniły. Całkowity czas retencji składnika ( t R ) jest sumą czasów spędzonych w fazie ruchomej i fazie stacjonarnej: t R = t m + t S t S zazwyczaj zwane jest zredukowanym czasem retencji, t R W chromatografii gazowej przyjmuje się, że faza ruchoma (zazwyczaj azot, hel lub wodór) nie wykazuje oddziaływania z próbką, np. nie wpływa na rozdzielenie cząsteczek próbki pomiędzy fazami, które zależy tylko od oddziaływań międzycząsteczkowych między próbką a fazą stacjonarną. Jedyną funkcją fazy ruchomej jest transport cząsteczek substancji rozpuszczonej wzdłuż kolumny. W chromatografii cieczowej faza ruchoma opisana jest jako interaktywna i odgrywa ważną rolę w rozdzielaniu składników próbki. Poprzez zmianę składu chemicznego fazy ruchomej, rozkłady składników pomiędzy fazy stacjonarną i ruchomą przyczyniają się do tego, iż stosunek ich migracji może być znacznie zmieniony. Dlatego w chromatografii cieczowej, analityk może dodatkowo kontrolować selektywność. Stosunek przemieszczania się pasma badanej substancji przez kolumnę jest odwrotnie proporcjonalny do wartości współczynnika podziału. W wypadku izotermy liniowej, K nie zależy od stężenia (tj. nachylenie krzywej jest stałe). 8
Dlatego też, chociaż powyższy rysunek przedstawia gradient stężenia w poprzek piku i maksymalne stężenie znajdujące się w centrum piku, wartość K pozostanie stała w poprzek piku. Oznacza to, że cały pik przemieszczać się będzie w tym samym stosunku a podstawowy kształt pozostanie bez zmian tj. będzie miał charakter gaussowski. Jak zostało to już przedstawione, w zasadzie pik będzie się rozmywał przechodząc wzdłuż kolumny z powodu zjawiska dyfuzji, ale w obecnej dyskusji możemy pominąć ten fakt. W takim przypadku mówi się o idealnej liniowej chromatografii, przy czym termin idealna odnosi się do faktu, iż dyfuzja została zignorowana. W chromatografii adsorpcyjnej, izoterma ma kształt wypukły w stosunku do osi Cm (izoterma typu Langmuir). Takie zachowanie ma miejsce w wypadku silnych oddziaływań między analizowaną substancją a fazą stacjonarną, ale oddziaływania substancja /substancja są stosunkowo słabe. Początkowo, ilość substancji zaadsorbowanej przez fazę stacjonarną wzrasta szybko wraz ze wzrostem stężenia w fazie ruchomej, tak długo aż jednocząsteczkowa warstwa substancji uformuje się na adsorbencie. Ponieważ oddziaływania pomiędzy cząsteczkami substancji są słabe, przypadki adsorpcji, w których formowane są warstwy jednocząsteczkowe i pewna ilość substancji zostaje zaadsorbowana, pozostają stałe nawet gdy stężenie w fazie ruchomej później wzrasta. Dlatego współczynnik podziału jest wysoki przy niskich wartościach Cm, ale maleje wraz ze wzrostem Cm. Poniższy rysunek przedstawia kształt piku w odniesieniu do izotermy tego typu. 9
Oznacza to, że stosunek przemieszczania się nie jest teraz taki sam. Jeżeli oznaczy się stopień przemieszczania się za pomocą strzałek, brzegi pasma, gdzie stężenie jest najniższe, będą miały najwyższą wartość K i dlatego poruszanie się tej strefy następuje stosunkowo wolno w porównaniu do centrum pasma gdzie panuje najwyższe stężenie a wartość K jest najniższa. Dlatego centrum pasma porusza się szybciej docierając do rozmytej przedniej części piku i pozostawiając za sobą ogon. W układach podziałowych, izoterma zazwyczaj jest wklęsła do osi Cm (izoterma typu anty- Langmuira). Ten rodzaj izotermy powstaje w wyniku silnych oddziaływań między cząsteczkami substancji, a oddziaływania pomiędzy substancją a fazą stacjonarną są słabe. Dlatego, przy niskich stężeniach, rozpuszczalność cząsteczek badanej substancji jest mała i parametr K ma niską wartość, ale gdy kilka cząsteczek substancji rozpuści się w fazie 10
stacjonarnej, silne oddziaływania substancja /substancja wciągają kolejne cząsteczki do fazy stacjonarnej i K wzrasta gwałtownie. Jakiego kształtu piku należy się spodziewać w układzie podziałowym? Pik z rozproszonym przodem i ostrym ogonem nazywany jest pikiem z rozmytą częścią przednią. Należałoby rozważyć, że w przypadku izotermy typu anty-langmuira K wzrośnie wraz ze wzrostem stężenia w poprzek pasma, więc najniższe będzie na brzegach a najwyższe w centrum piku. Dlatego stosunek przemieszczania się będzie najniższy w centrum a najwyższy na brzegach. Ogon będzie dążył do środka a przód będzie odbiegał od środka przyczyniając się do powstania piku z ostrym ogonem i rozmytym przodem (tj. rozmycie przedniej części piku). Proces ten przedstawiono na rysunku. 1. Do asymetrycznego wzrostu piku przyczynić się może także kilka innych czynników, a w szczególności powolne dozowanie do kolumny, ale mogą one zostać ograniczone w wyniku dobrania odpowiednich warunków pracy. 11
Generalnie, ogonowanie i rozmycie przedniej części piku są szersze niż odpowiadający kształt piku typu gaussowskiego. Poniżej widać, iż poszerzony pik nie sprzyja pełnemu rozdzieleniu dwóch związków, więc takie zjawisko powinno być unikane. W jaki sposób można temu przeciwdziałać? Obie formy izoterm mogą być postrzegane jako liniowe jeżeli stężenie substancji jest stosunkowo niskie. Dlatego, jeżeli dozowana ilość próbki do kolumny jest utrzymana na niskim poziomie, piki typu gaussowskiego zazwyczaj będą otrzymane w przypadku izotermy nieliniowej. W chromatografii gazowej i cieczowej dla typowej kolumny z wypełnieniem (4 mm śr.) wielkość próbki danego składnika w mieszaninie powinna być utrzymana poniżej 1 mg (0,1 µl jeżeli M = 100). W chromatografii gazowej z wypełnieniem stałym, wielkość próbki musi być znacznie mniejsza jeżeli dąży się do otrzymania piku typu gaussowskiego. Jeżeli wielkość próbki jest zbyt duża piki stają się zniekształcone a kolumnę uważa się za przeładowaną. Masa próbki (Skala logarytmiczna) Wpływ wielkości próbki na czas retencji analitów: A - kolumna nie przeładowana; B kolumna lekko przeładowana; C kolumna mocno przeładowana; 2.3. Indeks retencji (I) Indeks retencji (I) jest miarą retencji badanej substancji względem retencji normalnych alkanów (łańcuch prosty) w danej temperaturze i dla danej kolumny. Do obliczania indeksów retencji w warunkach temperatury izotermicznej stosuje się równanie 2a. W warunkach z programowaniem temperatury, można użyć równania 2b. 12
Indeks retencji dla n-alkanów to liczba węgli pomnożona przez 100. Na przykład, n-dodekan (n-c 12 H 26 ) ma I = 1200. Jeżeli badana substancja posiada I = 1478, eluowana jest po n-c 14 a przed n-c 15, i bliższa jest n-c 15. Indeksy retencji normalizują zmienne parametrów przyrządów tak, że dane retencji mogą być porównywane dla różnych systemów GC. Indeksy retencji dobrze służą również przy porównywaniu charakterystyk różnych kolumn. Indeks retencji (I) w warunkach izotermicznych (2a) I = 100y + [100 (z-y) (log t R(x) log t R(y) )] / [ log t R(z) log t R(y) ] Indeks retencji (IT) dla warunków z programowaniem temperatury (2b) IT = 100 [ (t R(x) t R(y) ) / (t R(z) t R(y) ] + 100y t R = czas retencji x = badana substancja (analit) y = n-alkany z liczbą y atomów węgla eluowane przed substancją rozpuszczoną x z = n-alkany z liczbą z atomów węgla eluowane przed substancją rozpuszczoną x z y = różnica w liczbie węgli pomiędzy dwoma n-alkanami 13
2.4. Współczynnik rozdzielenia α Współczynnik rozdzielania jest miarą czasu lub odległości między maksymalnymi wartościami dwóch pików. Oblicza się go za pomocą równania 3. Jeżeli α = 1, piki mają tę samą retencję i koeluują. Współczynnik rozdzielania (α) k 1 = współczynnik retencji pierwszego piku k 2 = współczynnik retencji drugiego piku α= k 2 / k 1 (3) 2.5. Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny Sprawność kolumny wyrażona jest liczbą półek teoretycznych (N). Liczba półek teoretycznych może być obliczona stosując równanie 4. Teoretyczne półki są pojęciem umownym, ponieważ kolumna nie zawiera niczego co mogłoby przypominać fizycznie półki destylacyjne albo inne podobne elementy. Liczba teoretycznych półek jest pośrednią miarą szerokości piku dla piku o specyficznym czasie retencji. Przyjmuje się, że kolumny z wyższą liczbą półek są bardziej sprawne niż kolumny z mniejszą liczbą półek. Kolumna z dużą liczbą półek wytwarzać będzie węższe piki w danym czasie retencji w porównaniu z kolumną o mniejszej liczbie półek. 14
Półki teoretyczne lub sprawność (N) N = 5.545 [(t R ) / w h ] 2 (4) N = 16[t R / w b ] 2 N = liczba półek teoretycznych t R = czas retencji w h = szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu) w b = szerokość piku w podstawie (w jednostkach czasu) Wysoka sprawność kolumny ma szczególne znaczenie gdy należy rozdzielić nieduże piki. Gdy stężenia substancji są większe, można użyć mniej efektywnych kolumn. Sprawność kolumny jest funkcją wymiarów kolumny (średnicy, długości, i grubości filmu), rodzaju gazu nośnego i jego natężenia przepływu lub średniej liniowej prędkości, oraz związku i jego retencji. W celu porównania kolumn, często stosowana jest liczba teoretycznych półek na metr (N/m). Liczba teoretycznych półek ma znaczenie tylko w przypadku określenia konkretnych warunków. Zwykle niezbędne są warunki temperatury izotermicznej a programowanie temperatury przyczynia się do powstania nadmiernych półek. Także, współczynnik retencji (k) testowanej substancji w celu obliczenia liczby półek powinien być większy od 5. Bowiem mniej zatrzymywane piki przyczyniają się do nadmiernej liczby półek. Porównując liczby półek teoretycznych dla różnych kolumn, wymaga się tych samych warunków temperaturowych i retencji piku (k) aby porównanie było poprawne. 15
Wysokość równoważna półce teoretycznej (H) Inną miarą sprawności kolumny jest wysokość równoważna półce teoretycznej (H). Jest ona obliczona za pomocą równania 5 i zazwyczaj podawana jest w mm. Im krótsza każda z teoretycznych półek, tym więcej półek zawiera się w danym odcinku kolumny. Przekłada się to na więcej półek teoretycznych na metr i wyższą sprawność. Małe wartości wysokości równoważnych półce wskazują na wyższą sprawność. Wysokość równoważna półce teoretycznej (H) (5) H = L / N L = długość kolumny (mm) N = liczba półek teoretycznych Asymetria 16
2.6. Rozdzielczość (R S ) Im wyższa rozdzielczość tym dwa piki nakładają się na siebie mniej. Rozdzielenie to tylko odległość lub czas pomiędzy maksymalnymi wartościami (a) dwóch pików. Rozdzielczość dotyczy zarówno odległości (a) i szerokości pików. Może być ona obliczana z dwóch równań 6 (a i b). 17
Rozdzielczość (R S ) R = 1.18 [ (t R2 -t R1 ) / (w h1 + w h2 )] (6 a) R = 2 (t r2 -t R1 ) / (w b1 + w b2 ) (6 b) t R1 = czas retencji pierwszego piku t R2 = czas retencji drugiego piku w h1 = szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu) pik pierwszy w h2 = szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu) - pik drugi w b1 = szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) pik pierwszy w b2 = szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) pik drugi Rozdzielczość do linii podstawowej zazwyczaj ma miejsce przy wartości R 1.50, jednakże, nie ma wtedy linii podstawy pomiędzy pikami. Wartości większe od 1.50 wskazują na linię podstawy między pikami. Wartości mniejsze niż 1.50 wskazują na koelucję piku. Przykłady można znaleźć na poniższym rysunku. Przykłady rozdzielczości 18
Czasami wartości rozdzielczości wyraża się w procentach. Są one obliczone ze stosunku wysokości wgłębień pomiędzy pikami do całkowitej wysokości piku. Wartość tę łatwiej można sobie wyobrazić niż liczbę rozdzielczości; jednakże, niemożliwe jest odróżnienie poziomu rozdzielenia do linii podstawy. Zmiany rozdzielczości jakie obserwuje się na chromatogramie przedstawiającym dwa piki dla różnych wartości współczynnika separacji lub liczby teoretycznych półek. Średnia wartość współczynnika separacji wskazana jest przez k. 19
20
2.7. Stosunek faz (β) Stosunek faz kolumny (β) obliczony jest z równania 7. Dla tej samej fazy stacjonarnej i temperatury kolumny (programowana lub izotermiczna), zmiana stosunku faz może być wykorzystana w celu obliczenia zmiany retencji substancji. Zależność ta wyrażona jest za pomocą równania 8. Stała podziału (Kc) wyraża stosunek stężenia badanej substancji w fazie stacjonarnej i ruchomej (C S / C M ). Stałe podziału są niezmienne dla tej samej fazy stacjonarnej, temperatury kolumny i substancji rozpuszczonej. Stosunek faz (β) r = promień kolumny ( µm) d f = grubość warstwy (µm) β = r / (2 d f ) (7) Stała podziału (Kc) Kc = C s / C M (8) Kc = k β = k [ r / (2 d f )] C s = stężenie substancji rozpuszczonej w fazie stacjonarnej C M = stężenie substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej 21
Dlatego, dla danej fazy stacjonarnej i temperatury kolumny, można określić ilość i kierunek jakiejkolwiek zmiany retencji w zależności do zmian średnicy kolumny lub grubości filmu fazy stacjonarnej. Równanie 8 wykazuje, iż wzrost stosunku faz daje odpowiedni spadek retencji (k) gdy Kc jest wartością stałą. Odwrotnie, spadek stosunku faz przyczynia się do odpowiedniego wzrostu retencji (k). Równanie 8 wskazuje na to, że stosunek faz maleje wraz ze zmniejszeniem się średnicy lub ze wzrostem grubości warstwy. Każda z tych zmian daje wzrost retencji badanej substancji. Stosunek faz wzrasta ze wzrostem średnicy lub spadkiem grubości warstwy. Każda z tych zmian daje spadek retencji substancji. Czasami pożądana jest zmiana średnicy kolumny lub grubości warstwy po to aby otrzymać specyficzny efekt (wzrost sprawności), bez zmiany retencji. Można tego dokonać poprzez proporcjonalną zmianę średnicy kolumny i grubości warstwy. Na przykład, jeżeli średnica kolumny zostanie zmniejszona z 0.25 do 0.18 mm, odpowiednia zmiana grubości warstwy ( np. 0.25 µm 0.18µm) utrzymuje ten sam stosunek faz. Starania ogólne mają przyczynić się do utrzymania tej samej retencji osiągając zarazem wyższą sprawność dzięki zmniejszeniu średnicy kolumny. W tabela 1 przedstawiono stosunki faz dla kolumn o najczęściej spotykanych średnicach. Tabela 1. Stosunek faz dla kolumn o najczęściej spotykanych średnicach. Grubość warstwy d f (µm) Średnica kolumny (mm) 0.10 0.18 0.20 0.25 0.32 0.45 0.53 0.10 250 450 500 625 800 1125 1325 0.18 139 250 278 347 444 625 736 0.25 100 180 200 250 320 450 530 0.40 63 113 125 156 200 281 331 0.42 107 119 149 190 268 315 0.50 90 100 125 160 225 265 0.83 60 75 96 136 160 0.85 59 74 94 133 156 1.00 50 63 80 113 133 1.27 49 63 88 104 1.50 42 53 75 88 2.55 25 31 44 52 3.00 21 27 38 44 5.00 13 16 23 27 22
23