BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XL, 2007, 3, str. 313 318 Lech Rodziewicz ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ SPEKTROMETRII MAS DO OZNACZANIA POZOSTAŁOŚCI METABOLITÓW NITROFURANÓW W PRODUKTACH POCHODZENIA ZWIERZE CEGO Pracownia Badań Chemicznych Środków Spożywczych Zakładu Higieny Weterynaryjnej w Białymstoku Kierownik: dr L. Rodziewicz Hasła kluczowe: metabolity nitrofuranów, pozostałości, wymagania analityczne, LC-MS/MS, żywność. Key words: nitrofuran metabolites, residue, analytical requirements, LC-MS/MS, food stuffs. Furazolidon, nitrofurazon, nitrofurantoina, furaltadon (pochodne 5-nitrofuranów) są przeciwbakteryjnymi lekami, które były stosowane w lecznictwie weterynaryjnym (zakażenie dróg moczowych, przewodu pokarmowego, skóry), a także jako dodatki konserwujące do żywności. Działania bakteriobójcze nitrofuranów obejmują szerokie spektrum mikroorganizmów (paciorkowce, gronkowce, pałeczki gram ujemne). Ponadto nitrofurany mają właściwości przeciwpierwotniakowe i grzybobójcze. Obok cennego działania farmakologicznego nitrofurany wywołują liczne efekty niepożądane takie jak: mutagenność, kancerogenność, hepatoksyczność, uszkodzenia płuc oraz mięśnia serowego (1). Nitrofurany w organizmie zwierząt dość szybko ulegają przemianom metabolicznym, dlatego też do kontroli pozostałości nitrofuranów wykorzystano ich metabolity jako biomarkery pozostałości ze względu na ich długi półokres zaniku w organizmie zwierząt (1,9 3,8 tyg.). Biomarkerem furazolidonu jest metabolit 3-amino-2-oksazolidon (AOZ), nitrofurantoiny 1-aminohydantoina (AHD), nitrofurazonu semikarbazyd (SEM) oraz furaltadonu 3-amino-5-morfolinometylo-2-oksazolidon (AMOZ) (2). Rozporządzenie Komisji 90/2377/WE z dnia 26 czerwca 1990 r. zakwalifikowało nitrofurantoinę, nitrofurazon, furaltadon oraz furazolidon w roku 1995 do IV aneksu w 4-stopniowym podziale środków farmakologicznych pod względem maksymalnej granicy pozostałości wżywności pochodzenia zwierzęcego (ang. maximum residua limits MRL). W aneksie tym znalazły się związki aktywne farmakologicznie, dla których nie można ustalić MRL. Umieszczenie nitrofuranów w aneksie IV oznacza zakaz ich stosowania u zwierząt, których produkty przeznaczone są do spożycia (3). Mimo to istnieją podejrzenia, że nitrofurany mogą być nielegalnie wykorzystywane w leczeniu zwierząt (4, 5). W krajach należących do UE na 1500 przebadanych próbek produktów pochodzenia zwierzęcego stwierdzono 12 wyników dodatnich co stanowi 0,8% wszystkich próbek. Dyrektywa 96/23/WE z dnia 29 kwietnia 1996 r. nakazuje monitorowanie pozostałości metabolitów nitrofuranów w tkankach zwierząt i produktach pochodzenia zwierzęcego (6). Metodom potwierdzającym stosowanym w analizie stawia się wysokie wymagania analityczne. Metody muszą spełniać wymagania, które są określone w decyzjach komisji 2002/657/WE z dnia 14 sierpnia 2002 r. (7) oraz 2003/181/WE z dnia 13 marca 2003 r. (8). Wyżej wymieniona decyzja (7) zakwalifikowała nitrofurany do grupy A, do której należą substancje wykazujące działanie anaboliczne oraz substancje na których stosowanie nie ma urzędowego zezwolenia. Wprowadza ona dla ilościowych metod potwierdzających grupy A parametry wykonawcze
314 L. Rodziewicz Nr 3 takie jak: specyficzność, selektywność, liniowość, powtarzalność, odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna, odporność na niewielkie zmiany, limit decyzyjny wartości granicznej, zdolności wykrywania oraz rodzaje technik pomiarów (układy) jakie można stosować. Decyzja (7) wprowadza dwa nowe parametry wykonawcze jakie musi spełniać metoda potwierdzająca. Jest to decyzyjna wartość graniczna (CCα) oraz zdolność wykrywani (CCβ). CCα oznacza wartość graniczną, na poziomie której i powyżej której można wnioskować z prawdopodobieństwem błędu α, że próbka jest niezgodna (fałszywie dodatnia) i wynosi ona dla metabolitów nitrofuranów (grupa A) 1%. CCβ jest to najniższe stężenie analitu, które może być wykryte, zidentyfikowane i oznaczone w próbce z prawdopodobieństwem 1 β. Błąd β jest to prawdopodobieństwo uznania próbki za fałszywie ujemną i wynosi on dla metabolitów nitrofuranów 5%. Oba te parametry służą do jednoznacznej interpretacji wyników analiz pozostałości chemicznych w żywności pochodzenia zwierzęcego. Wartości CCα i CCβ rozstrzygają ze znanym prawdopodobieństwem czy w próbce znajdują się oznaczane metabolity nitofuranów, czy też nie lub czy jego wartość przekracza wartość graniczną. Dla potwierdzającej metody ilościowej oznaczania metabolitów nitrofuranów wyniki są zgodne jeżeli są poniżej wartości CCα wyznaczonej dla poszczególnych matryc. Parametry CCα i CCβ można wyznaczyć dwoma sposobami na podstawie analizy 20 próbek ślepych (7) oraz na podstawie krzywej kalibracji sporządzonej zgodnie z PN-ISO 11843-2 (9). Decyzja (8) wprowadziła MRPL dla metabolitów nirofuranów dla produktów pochodzenia zwierzęcego, który wynosi 1,0 ng/g. MRPL (ang. minimum required performance limit) jest to najmniejsza zawartość analitu jaka może być wykryta, zidentyfikowana i potwierdzona za pomocą metody analitycznej (8). Przy oznaczaniu metabolitów nitrofuranów w produktach pochodzenia zwierzęcego są stosowane metody, w których mają zastosowanie układy LC-UV, LC-MS i LC-MS/MS. Układ LC-UV nie spełnia warunku MRPL, gdyż granice wykrywalności podawane przez różnych autorów są wyższe od wymaganych (10). Przy zastosowaniu tego układu można oznaczyć metabolity nitrofuranów wątrobie na poziomie 5,0 10 ng/g (10). Ponadto zgodnie z decyzją (8) metody potwierdzając muszą przekazywać informację na temat struktury analitycznej. Dlatego też metody oparte wyłącznie na analizie chromatograficznej bez zastosowania spektrometrii mas nie są odpowiednie jako metody potwierdzające w grupie A. Zgodnie z decyzją (8) układ LC-MS może być stosowany w metodach potwierdzających grupy A. Układ ten nie spełnia jednak warunku MRPL (10, 11, 12). Przy zastosowaniu układu LC-MS można oznaczyć metabolity w tkance mięśniowej na poziomie 0,25 5,0 ng/g (11), zaś w jajach 1,0 3,0 ng/g (12) przy MPRL wynoszącym 1,0 ng/g. Warunek MRPL spełniają metody, w których są stosowane układ LC-MS/MS. Zastosowanie tego układu pozwoliło na zwiększenie czułości 20 100 razy względem LC-MS, co pozwoliło na identyfikacje i oznaczanie poniżej MPRL (13). Przygotowanie prób e k d o a n a l i z y. Analiza metabolitów nitrofuranów w produktach pochodzenia zwierzęcego przy użyciu LC-MS/MS dzielą się zasadniczo na następujące etapy: przygotowanie próbki do badań, hydroliza i derywatyzacja, neutralizacja, oczyszczanie i zatężanie otrzymanego ekstraktu oraz analiza LC-MS/MS. Analizę próbek metabolitów nitrofuranów prowadzono w obecności standardu wewnętrznego dodanego bezpośrednio do próbki przed homogenizacją w roztworze wodnym kwasu solnego. Jako standard wewnętrzny (IS) stosowano przeważnie wzorce deuterowe (AOZ-d4, AMOZ-d5) lub znaczone izotopem węgla ( 13 C 3 -AHD, 13 C 15 N 2 -SEM). Najważniejszym etapem analizy jest hydroliza metabolitów nitrofuranów powiązanych z białkami i derywatyzacja, które przeprowadzano jednocześnie traktując jako jeden etap. Powoduje to, że oznaczano sumę całkowita związanych i wolnych metabolitów bez rozróżniania na wolne lub związane. Przeprowadzenie hydrolizy i derywatyzcji jest konieczne, w celu uzyskania związków o bardziej korzystnych właściwościach dla analizy techniką MS. Metabolity nitrofuranów maja małe masy atomowe pomiędzy 75 a 202 g/mmol. Z punku widzenia analizy MS zakres mas poniżej m/z 150 przy technice jonizacji ESI rozpylania w polu elektrycznym, czyli elektrosprej (ang. electrospray ionisation ESI) powoduje zmniejszenie czułość MS oraz interferencje ze strony rozpuszczalników i innych związków stosowanych w analizie. Dlatego też w celu uzyskania związków o bardziej korzystnych właściwościach dla MS przeprowadzono hydrolizę metabolitów nitrofuranów roztworem kwasy solnego i derywatyzację wolnej grupy aminowej danego metabolitu przy zastosowaniu 2-nitrobenzaldehyd (NBA). Spowodowało to wzrost masy atomowej poszczególnych metabolitów 208 334 g/mol, która jest bardziej tolerowana przez
Nr 3 Chromatografia cieczowa oznaczanie metabolitów nitrofuranów 315 MS. Wadą zastosowania NBA do derywatyzacji metabolitów jest długi czas reakcji ponad 15 godz. w temp. 37 C. Zwiększenie czasu derywatyzacji nie wpłynęło w zasadniczy sposób na wzrostu czułości metody. W celu ominięcia czasochłonnej derywatyzacji testowano wiele innych aldehydów aromatycznych w celu skrócenia czasu reakcji oraz zwiększenia czułości. Żaden z testowanych związków nie dał znaczącej poprawy (4). Neutralizację próbki prowadzono przeważnie fosforanem trójsodowym lub kwaśnym fosforanem potasu, doprowadzając do ph = 7 wodorotlenkiem sodu. Następnym etapem analizy jest oczyszczanie i zatężanie otrzymanych ekstraktów, które prowadzono przeważnie metodą ekstrakcji ciecz-ciecz (5, 14, 15) lub ciecz-ciecz w połączeniu z SPE. Do ekstrakcji stosowano octan etylu. Przy zastosowaniu metody SPE stosowano kolumienki polimerycznych typu LiChlorut EN (4, 16) ( firmy Merck), Oasis MAX, Oasis HLB (firmy Waters) (17, 18). Wypełnienia te charakteryzują się wysoką powierzchnia aktywności, dużą pojemnością i stabilnością w szerokim zakresie ph. Przy zastosowaniu octanu etylu do ekstrakcji z tkanki mięśniowej drobiu przy wzmocnieniu na poziomie 1,0 μg/kg otrzymano odzysk dla AHD, AOZ, SEM odpowiednio 104, 34 i 28%, zaś w jajach przy tym samym wzmocnieniu 34, 19 i 20% ze względnym odchyleniem standardowym poniżej 10% (14). Przy zastosowaniu do ekstrakcji otanu etylu i kolumienek Oasis w wątrobie trzody przy wzmocnieniu 5 25 μg/kg otrzymano odzysk powyżej 50% dla AMOZ, AHD, zaś dla AOZ, SEM powyżej 90% (5). Kolumienki LiChlorut EN znalazły zastosowanie w oznaczaniu metabolitów nitrofuranów w tkankach zwierząt (4, 16), Oasis MCX i Oasis HLB w tkankach zwierząt (17) i Oasis HLB w miodzie (18). A n a l i z a L C - M S / M S. Do analizy stosowano krótkie kolumny chromatograficzne standardowe o średnicy 2 3 mm wypełnione przeważnie fazą chemicznie odwróconą C-18. Jako fazę ruchomą stosowano wodę, wodne roztwory kwasu octowego oraz buforowy roztwór octanu amonowego w połączeniu z polarnymi rozpuszczalnikami acetonitrylem lub metanolem. Stosowano układ faz z zastosowaniem elucji gradientowej. W celu uzyskania najlepszego rozdziału metabolitów nitrofuranów testowano różne kolumny oraz skład fazy ruchomej. Najlepszy rozdział uzyskano stosując kolumnę C-18 Luna (5 μm, 150 3 mm, Phenomenex) oraz fazę ruchomą A o stęż. 0,5 mmol/dm 3 octan amonu i B metanol (13). Próbki analizowano stosując układ LC-MS/MS. Najczęściej stosowaną metodą jonizacji jest rozpylanie cieczy zawierającej badaną substancje w polu elektrycznym (ang. electrospray ionisation ESI). Jest to łagodna jonizacja nie powodująca fragmentacji badanych cząstek. W celu wywołania wtórnej fragmentacji w drugim MS stosowano przeważnie metodę wzbudzania jonów przez kolizję (ang. collisiom induced dissociation CID). Rozdzielenie wiązki jonów wg wartości stosunku m/z prowadzono z zastosowaniem analizatora kwadrupolowego. Układ pracował w trybie jonów dodatnich. Identyfikacje i oznaczanie ilościowe metabolitów prowadzono przeważnie w systemie monitorowania wybranych reakcji tworzenia jonów metastabilnych MRM (ang. metastable reaction monitoring). W celu uzyskania wykresu kalibracyjnego mierzono odpowiedzi spektrometru mas na różne ilości metabolitów nitrofuranów względem odpowiedzi na stałą ilość IS. Na ryc. 1 przedstawiono chromatogramy metabolitów nitrofuranów próbki mięśni bydła wzmocnionej na poziomie 1,0 μg/kg, uzyskane przy zastosowaniu układu LC-ESI-MS/MS-CID. Próbki do badań przygotowano wg procedury własnej. Zastosowano chromatograf cieczowy firmy Agilent 1100, spektrometr masowy API 3000 LC-MS/MS przy wysokim napięciu fragmentacji 5500 V, która jest optymalna dla czterech metabolitów. Do wstępnego rozdziału metabolitów nitrofuranów zastosowano kolumnę chromatograficzną Luna C18 o wymiarach 150 2 mm, wielkość ziarna 3 μm firmy Phenomenex oraz fazę ruchomą A metanol do LC-MS, B 20:80 (V 1 +V 2 ) metanol do LC-MS i 0,5 mm octan amonu. Analizę próbek prowadzono w obecności dwóch IS AOZ-d4 i AMOZ-d5, których sygnały leżą blisko oznaczanych analitów. AOZ-d4 jest IS dla AOZ, AHD, SEM, zaś AMOZ-d5 dla AMOZ. Identyfikacje i oznaczanie ilościowe metabolitów nitrofuranów prowadzono w systemie monitorowania wybranych reakcji (ang. metastable reaction monitoring MRM). W celu identyfikacji uwzględniono podstawowe przejścia m/z dla AHD 249 134 (15), 249 178 (28), AOZ 236 134 (19), 236 192 (19), SEM 209 166 (15), 209 192 (25), AMOZ 335 291 (18), 335 262 (24), zaś przy oznaczaniu ilościowym AHD 249 134, AOZ 236 134, SEM209 166, AMOZ 335 291 oraz dla IS AOZ-d4 240 142 (19), AMOZ-d5 340 296 (18). W nawiasie podano wartość energii kolizyjnej w MeV. Spełnia to wymagania decyzji (7), która wymaga dla metod potwierdzających przy wykorzystaniu zbierania danych w systemie MRM co najmniej czterech punktów identyfikacyjne. W naszym przypadku jon macierzysty każdego z metabolitów nitrofuranów daje po dwa jony potomne. Jon
316 L. Rodziewicz Nr 3 Ryc. 1. Chromatogram LC-ESI-MS/MS-CID z ekstraktu mięśni bydła, tryb pracy MRM, wzmocnienie matrycy 1 ng/g. Fig. 1. LC-ESI-MS/MS-CID chromatograms of cattle muscle extract, MRM mode, spiked matrix meat tissue nitrofuran metabolites 1 ng/g.
Nr 3 Chromatografia cieczowa oznaczanie metabolitów nitrofuranów 317 macierzysty daje 1 punkt identyfikacjny, zaś jony potomne po 1,5 punktu każdy z osobna, co w sumie wynosi 4 punkty identyfikacyjne. Inni autorzy metod oznaczania metabolitów nitrofuranów monitorowali inne przejścia m/z. W tab. I przedstawiono najczęściej stosowane jony diagnostyczne metabolitów nitrofuranów, IS do identyfikacji i oznaczania ilościowego. Zwia zek Tabela I Jony diagnostyczne używane dla metabolitów nitrofuranów Table I Diagnostic ions used for nitrofuran metabolites Jon podstawowy Jony używane w analizie jakościowej (m/z) Jony używane w analizie ilościowej (m/z) AOZ 236 134, 101, 149, 192 134 AHD 249 134, 104, 178, 108 134 SEM 209 166, 134, 192, 196 166 AMOZ 335 291, 128, 262, 266 291 AOZ-d4 (IS) 240 134 AMOZ-d5 (IS) 340 296 SEM-d4 (IS) 213 170 AHD-d4 (IS) 253 138 jon podstawowy Układ LC-ESI-MS/MS-CID oraz ww. przejścia stosowano do oznaczania metabolitów nitrofuranów w tkance mięśniowej zwierząt (4, 10, 14, 17), krewetkach (15), jajach (14) i miodzie (18). Zgodnie z decyzją (7) przy oznaczaniu metabolitów wyznaczano wartość CCα i CCβ. W tkance mięśniowej kurcząt przy zastosowaniu do oczyszczania ekstraktów poprzez ekstrakcję octanem etylu i zastosowaniem kolumienek Lichlorut EN CCα i CCβ mieściło się w zakresie 0,11 0,21 i 0,19 0,36 ng/g przy MRPL wynoszącym 1,0 ng/g, zaś odzysk w granicach 85 122%. Najmniejsze wartość CCα i CCβ stwierdzono dla AMOZ 0,12, 0,2 ng/g, największe zaś dla AHD 0,21 i 0,36 ng/g (16). W miodzie przy zastosowaniu do oczyszczania kolumienek polimerycznych CCα mieściło się w zakresie 0,07 0,46, a CCβ 0,12 0,56 ng/g (18). CCα i CCβ obliczono na podstawie krzywej kalibracji. Niektórzy autorzy metod oczyszczając ekstrakt octanem etylu wyznaczali granicę wykrywalności (LOD) dla S/N = 3 (stosunek sygnału do szumu) oraz granicę oznaczoności (LOQ) S/N = 6 w tkance mięśniowej trzody. Granice wyznaczono na postawie wyników uzyskanych w trzech laboratoriach. Wyznaczona wartości LOD mieściła się w granicach 0,03 0,09, zaś LOQ 0,05 0,49 ng/g. Najmniejsze wartość LOQ stwierdzono dla AMOZ 0,04 0,07, największe zaś dla AHD 0,37 0,49 ng/g. Odzyski przy fortyfikacji na poziomie 0,5 ng/g uzyskane w trzech laboratoriach są podobne i wynosiły dla AOZ 45 48, AHD 24 29, SEM 12 15 i AMOZ 46 49% (5) PODSUMOWANIE Metody oznaczania metabolitów nitrofuranów, w których stosowano układ LC-MS wg decyzji komisji 2003/181/WE nie spełniają warunku MRPL (1,0 ng/g), gdyż ich granice wykrywalności są wyższe od wymaganych. Warunek MRPL spełniają metody, w których stosowano układ LC- MS/MS. Zastosowanie tego układu pozwoliło na zwiększenie czułości 20 100 razy względem LC-MS, co pozwoliło na identyfikacje i oznaczanie poniżej MPRL. Przedstawione metody oznaczania metabolitów w których stosowano układ LC-MS/MS oraz wyznaczono wartość CCα i CCβ spełniają wymagania decyzji komisji 2002/657/WE.
318 L. Rodziewicz Nr 3 L. R o d z i e w i c z THE APPLICATION OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY TO DETERMINE NITROFURAN METABOLITE RESIDUES IN ANIMAL PRODUCTS PIŚMIENNICTWO 1. Szczypka M.: Właściwości genotoksyczne związków 5-nitrofuranowych. Roczn. PZH, 1995; 4: 390-395. 2. Cooper K., Kennedy G.: Nitrofuran antibiotic metabolites detected at parts per million concentrations in retina of pigs-a new matrix for enhanced monitoring of nitrofuran abuse. Analyst. 2005; 130: 446-448. 3. Rozporządzenie Komisji 90/2377/WE z dnia 26 czerwca 1990 r. określająca procedury wspólnoty dla ustalenia najwyższych dopuszczalnych pozostałości weterynaryjnych produktów medycznych w żywności. 4. Leitner A., Zollner P., Lindner W.: Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2001; 939: 49-58. 5. O Keeffe M., Conneely A., Cooper K.: Nitrofuran antibiotic residues in pork The FoodBRAND retail survey. Anal. Chim. Acta 2004; 520: 125-131. 6. Dyrektywa 96/23/WE z dnia 29 kwietnia 1996 r. o środkach przyjętych do dla monitorowania pewnych substancji i ich pozostałości u zwierząt żywych i w produktach pochodzenia zwierzęcego. 7. Decyzja Komisji z dnia 14 sierpnia 2002 r. 2002/657/WE wykonująca dyrektywę Rady 96/23 dotyczącą wyników metod analitycznych i ich interpretacji. 8. Decyzja Komisji z dnia 13 marca 2003 r. 2003/181/WE zmieniająca decyzję 2002/657/WE w odniesieniu do ustalenia minimalnych wymaganych wartości granicznych wydajności (MPRL) dla niektórych pozostałości w żywności pochodzenia zwierzęcego. 9. PN-ISO 11843-2: Zdolność wykrywania Cz. 2: Metrologia w przypadku kalibracji liniowej. PKN, lipiec 2003; 19:1-13. 10. Horne E., Cadogan A., O Keeffe.: Analysis of protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry. Analyst. 1996; 121: 1463-1468. 11. Stolker A., Brinkman U.: Analatical strategie sof residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents in food-producing animals- a review. J. Chromatogr. A 2005; 1067: 15-53. 12. Corcia A., Nazzari M.: Liquid chromatographic-mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacterial agents in animal ford products. J. Chromatogr. A, 2002; 974: 53-89. 13. Hartig L., Czapiewski K.: Detecting nitrofuran metabolitrs in animal products using LC/MS/MS. Article 2005; 17: 21-23. 14. Finzi J.K., Donato J.L., Sucupira M., De Nucci G.: Determination of nitrofuran metabolites in poultry muscle and eggs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2005; 842: 30-35. 15. Scope A.: Detection of nitrofran metabolites in shrimp. FDA 2004; 1: 1-7. 16. Mottier P., Khong S., Gremaud E.: Quantitative determination of nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray onization-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2005; 842: 30-35. 17. Conneely A., Nugent A., Okeeffe M.: Isolrtion of bound residues of nitrofuran drugs from tissue by solid-phase extraction with determination by liquid chromatography with UV and tandem mass spectrometric detection. Anal. Chim. Acta 2003; 483: 91-98. 18. Khong S., Gremaud E., Richoz J.: Analysis of matrix-bound nitrofuran in worldwide originated honeys by isotope dilution high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2004; 25: 5309-5315. Adres: 15-959 Białystok, ul. Zwycięstwa 26A.