MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 81-87 Angelika Długosz 2, Sylwia Rynans 1, Tomasz Dzieciątkowski 1, Grażyna Młynarczyk 1 Zastosowanie metody real-time PCR do wykrywania DNA ludzkiego poliomawirusa BK 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk 2 Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego kierownik: prof. dr hab. B. Zagdańska Celem pracy było adaptowanie i zbadanie użyteczności metody real-time PCR do diagnostyki zakażeń ludzkim poliomawirusem BK, zwłaszcza u pacjentów poddanych immunosupresji po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych oraz przeszczepach nerek. Wirus BK (BKV) wyizolowany został po raz pierwszy w 1971 roku od pacjenta po przeszczepieniu nerki (3) jest obecnie klasyfikowany w obrębie rodziny Polyomaviridae, rodzaju Polyomavirus (7). Do pierwotnego zakażenia nim dochodzi zazwyczaj w wieku dziecięcym, najczęściej drogą kropelkową lub przez bezpośredni kontakt. Na rozpowszechnienie zakażeń BKV w populacji wskazuje fakt, iż około 90% osób dorosłych wykazuje obecność specyficznych przeciwciał w klasie IgG, skierowanych przeciwko temu wirusowi (8). Po bezobjawowym zakażeniu pierwotnym patogen ustala stan latencji w komórkach nerek, gdzie zazwyczaj pozostaje w utajeniu do końca życia. Reaktywacja wirusa następuje niemal wyłącznie u osób z zaburzeniami odporności (np. w wyniku AIDS) czy poddanych leczeniu immunosupresyjnemu po przeszczepieniach (6). W tej grupie kliniczna manifestacja zakażeń BKV obejmuje krwotoczne zapalenie pęcherza moczowego u pacjentów po transplantacji komórek krwiotwórczych (2, 4) oraz zwężenie moczowodu i śródmiąższowe zapalenie nerek u biorców przeszczepu nerek (5, 10). Ta ostatnia choroba prowadzi często do pogorszenia czynności funkcjonowania nerki, a w konsekwencji do utraty przeszczepu. Złotym standardem w przesiewowej diagnostyce zakażeń BKV jest ocena tak zwanych decoy cells w moczu (9, 14), która jednak coraz częściej zastępowana jest przez oznaczanie liczby kopii wirusa metodą real-time PCR (qpcr) w moczu i/lub w surowicy (1, 13). W przypadkach podejrzenia nefropatii BK celowe jest także przeprowadzenie biopsji nerki, która pozwala na ocenę zmian morfologicznych. Należą do nich: obecność wewnątrzjądrowych ciałek wtrętowych w komórkach nabłonka oraz zmiany cytopatyczne w miąższu nerki (10). Wczesne wykrycie zakażeń BKV umożliwia zastosowanie odpowiedniej terapii, która zazwyczaj polega na ograniczeniu dawek preparatów immunosupresyjnych, co daje szansę na wyzdrowienie i utrzymanie przeszczepu (5, 11). Stosowany obecnie w niektórych
82 A. Długosz i inni Nr 1 ośrodkach cidofowir nie ma formalnego zatwierdzenia jako lek skuteczny przeciwko BKV i wykorzystywany jest jedynie w ograniczonych próbach klinicznych (12, 15). Celem pracy było dostosowanie metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA ludzkiego poliomawirusa BK oraz określenie jej czułości analitycznej i przydatności do diagnostyki zakażeń BKV w próbkach klinicznych. MATERIAŁ I METODY W celu opracowania starterów i sondy do metody qpcr wykrywającej DNA poliomawirusa BK wykorzystano sekwencję DNA dostępną w internetowej bazie danych GenBank (AB485712.1), kodującego specyficzne białko wirusa VP3. Zaprojektowane do niej, z użyciem oprogramowania LightCycler Probe Design (Roche Diagnostics ), startery amplifikują fragment genomu BKV o długości 103 par zasad (Tabela I). Dodatkowo celem zwiększenia specyficzności reakcji zastosowano zaprojektowaną sondę hydrolizującą typu TaqMan, wyznakowaną na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym CalFluor Gold 540 oraz wygaszaczem BHQ-1 na końcu 3 (Oligo ). Tabela I. Sekwencje użytych w badaniach starterów i sondy Nazwa Sekwencja (5 3 ) BKV_F GAA GGT ACC CGT GTA CAT T BKV_R GTA TAC TTT GTT GAT TTC TTA AGT CCA BKV_540 CalFluor Gold 540 ATG CTG ACA GTA TAG AAG AAG TTA CAC AA BHQ1 Do jakościowych badań techniką real-time PCR (określenie swoistości reakcji) użyto całogenomowego DNA ludzkiego poliomawirusa BK (Virion ). Jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii Vero, zaś za kontrole specyficzności reakcji posłużył DNA izolowany z: wirusa cytomegalii (CMV), poliomawirusa JC (JCV) oraz ludzkiego adenowirusa typu 12 (HAdV-12). Dodatkowo do określenia specyficzności wykorzystano DNA ekstrahowany z bakterii, będących najczęstszymi etiologicznymi czynnikami zapalenia pęcherza: Escherichia coli, Enterococcus fecalis oraz Staphylococcus saprophyticus. Określenie czułości metody wykonano z zastosowaniem seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wzorcowego DNA BKV w jałowej, redestylowanej wodzie w zakresie od 10 0 do 10-3 (1,35x10 4-1,50x10 1 kopii/ml). Oznaczenia qpcr wykonywano na aparacie LightCycler 2.0 z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics ). Mieszanina reakcyjna zawierała 5 µl DNA; 2,25 µm starterów BKV_F oraz BKV_R oraz 150 nm sondy BKV_540 w końcowej objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w temp. 95 0 C, po którym następowało 40 cykli składających się z denaturacji 10 s w temp. 95 0 C, przyłączania starterów przez 10 s w temp. 60 0 C oraz wydłużania nici w temperaturze temp. 72 0 C przez 5 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek do temp. 40 0 C na 60 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości fali 530 nm, właściwej dla fluoroforu CalFluor Gold 540. Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny do ilości produktu w mieszaninie. Materiał kliniczny do badań stanowiło 27 próbek moczu oraz 23 próbki surowicy krwi, pobranych od 22 pacjentów z podejrzeniem krwotocznego zapalenia pęcherza, hospitalizo-
Nr 1 Real-time PCR w diagnostyce poliomawirusa BK 83 wanych w Klinice Hematologii i Onkologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego oraz Klinice Transplantacji Komórek Krwiotwórczych Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w latach 2010-2011. Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics ), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 35 ml buforu elucyjnego. Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w dwukrotnych, niezależnych powtórzeniach. WYNIKI Przy badaniu specyficzności opracowanej reakcji real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, zaobserwowano tylko w próbce zawierającej materiał genetyczny BKV. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii Vero, wirusa cytomegalii, poliomawirusa JC, adenowirusa typu 12 oraz patogenów bakteryjnych nie wykryto fluorescencji, co wskazuje na brak w nich amplifikacji kwasu nukleinowego. Obserwacja taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy o wysokiej swoistości użytej techniki (Ryc.1). Ryc.1. Wynik reakcji real-time PCR służącej oznaczeniu specyficzności metody. Krzywa oznaczona BKV oznacza amplifikację DNA poliomawirusa BK. Krzywa oznaczona Vero to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii Vero), zaś krzywe: CMV, JCV, HAdV, E. coli, E. fecalis oraz S.saprophyticus oznaczają kontrole specyficzności reakcji. Podczas określania zakresu czułości metody technika real-time PCR umożliwiała wykrycie wszystkich użytych rozcieńczeń DNA poliomawirusa BK zakresie od 10 0 do 10-3 (Ryc. 2). Podobnie otrzymana krzywa kalibracyjna wykazywała wysoki współczynnik liniowości, co świadczy o wysokiej wiarygodności zaprojektowanej metody (Ryc. 3).
84 A. Długosz i inni Nr 1 Ryc.2. Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania BKV. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację DNA seryjnych rozcieńczeń wirusa w zakresie od 10 0 do 10-3. Krzywa Vero to kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezakażonej linii Vero. Ryc.3. Krzywa kalibracyjna fluorescencji metody real-time PCR w kierunku wykrywania DNA poliomawirusa BK. Poszczególne punkty na krzywej oznaczają fluorescencję seryjnych rozcieńczeń BKV w zakresie od 10 0 do 10-3. Opisane powyżej próbki kliniczne poddano opracowanej reakcji real-time PCR z użyciem sondy hydrolizującej TaqMan. Wzrost poziomu fluorescencji fluoroforu CalFluor Gold 540, będący następstwem przyrostu ilości produktu w mieszaninie oraz degradacji sondy TaqMan zaobserwowano w 8 materiałach klinicznych (6 próbkach moczu i 2 próbkach surowicy), pochodzących od 5 pacjentów (22,7%). Pozostałe 42 próbki nie zawierały sekwencji DNA typowych dla BKV, o czym świadczy brak w nich przyrostu fluorescencji w czasie badania. Wyliczona średnia wartość wiremii BKV w surowicy wynosiła 170 kopii/ml, zaś średni poziom wirusowego DNA w moczu 1250 kopii/ml (Tabela II).
Nr 1 Real-time PCR w diagnostyce poliomawirusa BK 85 Tabela II. Przedstawienie wyników jakościowych i ilościowych uzyskanych przy użyciu opracowanej metody qpcr Nr Wynik uzyskany przy użyciu opracowanej metody real-time PCR (kopii/ml) mocz 1 (-) surowica 1 (-) mocz 2 (-) surowica 2 (-) mocz 3 (-) surowica 3 (-) mocz 4 (+) 870 kopii/ml surowica 4 (-) mocz 5 (-) surowica 5 (-) mocz 6 (-) surowica 6 (-) mocz 7 (-) surowica 7 (-) mocz 8 (+) 700 kopii/ml surowica 8 (-) mocz 9 (+) 1900 kopii/ml surowica 9 (+) 150 kopii/ml mocz 10 (-) surowica 10 (-) mocz 11 (-) mocz 12 (-) surowica 12 (-) mocz 13 (-) surowica 13 (-) mocz 14 (-) surowica 14 (-) mocz 15 (+) 2200 kopii/ml surowica 15 (+) 190 kopii/ml mocz 16 (-) surowica 16 (-) mocz 17 (-) mocz 18 (-) surowica 18 (-) mocz 19 (-) mocz 20 (-) surowica 20 (-) mocz 21 (-) surowica 21 (-) mocz 22 (+) 800 kopii/ml surowica 22 (-) mocz 23 (-) mocz 24 (-) surowica 24 (-) mocz 25 (+) 1000 kopii/ml surowica 25 (-) mocz 26 (-) surowica 26 (-) mocz 27 (-) surowica 27 (-) DYSKUSJA Ze względu na coraz większe rozpowszechnienie we współczesnej medycynie zabiegów przeszczepiania zarówno komórek krwiotwórczych, jak i narządów unaczynionych, coraz większą rolę zaczęła odgrywać diagnostyka wirusowych zakażeń potransplantacyjnych (1, 2, 13). Stosowane rutynowo po tych zabiegach podawanie leków immunosupresyjnych prowadzi do zaburzenia funkcji komórek efektorowych układu odpornościowego, odpowiedzialnych za obronę ustroju przed zakażeniami wirusowymi (4). Wykrywalna wiremia BKV występuje u około 50% pacjentów po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych, zazwyczaj do drugiego miesiąca po transplantacji. Częstość jej występowania jest podobna zarówno u biorców przeszczepów autologicznych (39-54%), jak i allogenicznych (46-53%) (2). Do typowych manifestacji klinicznych produktywnego zakażenia BKV zaliczyć można zarówno łagodnie przebiegający krwiomocz, jak i ciężkie postacie krwotocznego
86 A. Długosz i inni Nr 1 zapalenia pęcherza czy śródmiąższowego zapalenia nerek. Wśród biorców przeszczepów komórek krwiotwórczych krwotoczne zapalenie pęcherza jest najczęstszym powikłaniem reaktywacji BKV. Występuje ono u 10-25% pacjentów z tej grupy i wiązane jest z wysoką śmiertelnością (2). Czynnikami ułatwiającymi reaktywację poliomawirusa BK wśród pacjentów po przeszczepieniach prawdopodobnie są: brak specyficznych przeciwciał przeciwko BKV u biorcy przed zabiegiem transplantacyjnym, intensywność terapii immunosupresyjnej oraz niezgodność w dużej ilości alleli HLA pomiędzy dawcą a biorcą (2, 4, 10). U biorców allogenicznych przeszczepów nerek do istotnych czynników ryzyka zaliczane jest leczenie ostrych epizodów odrzucania a także stosowanie takrolimusu czy mykofenolanu mofetylu jako leków immunosupresyjnych (5, 10). Trudności w diagnostyce zakażeń powodowanych przez poliomawirusa BK, związane dodatkowo z koniecznością szybkiego zmniejszania podawanych preparatów immunosupresyjnych, wymusiły rozpowszechnienie w diagnostyce poprzeszczepowej technik biologii molekularnej (1, 2). Tradycyjny wariant PCR, połączony z elektroforezą żelową, ma zazwyczaj ograniczoną czułość i nie umożliwia oznaczeń ilościowych. Rozwiązanie stanowi wykorzystanie techniki real-time PCR do monitorowania poziomu wirusowego DNA (viral load) u pacjentów poddanych terapii immunosupresyjnej. Zaobserwowana także w niniejszych badaniach czułość i szybkość badań wykonanych z użyciem qpcr zapewnia wykrycie reaktywacji BKV nawet przebiegających z niewielkim nasileniem replikacji (1, 13). Dostępność półilościowych lub ilościowych metod monitorowania wiremii BKV może więc znacząco ułatwić szybką diagnostykę zakażenia, a w konsekwencji prawidłowe postępowanie terapeutyczne. A. Długosz, S. Rynans, T. Dzieciątkowski, G. Młynarczyk Real-time PCR test for detection and quantification of human polyomavirus BK (BKV) DNA SUMMARY The human polyomavirus BK (BKV) is wide-spread pathogen, associated with urogenital tract disorders or even nephropathy in immunosuppressed patients. Nowadays molecular detection by real-time PCR (qpcr) is recognized as a method-of-choice for detecting human polyomaviruses in clinical samples. The aim of the study was development of real-time PCR assay for detection and quantification of polyomavirus BK DNA in clinical samples, using specific primers targeting a viral DNA VP3 gene and a TaqMan hydrolyzing probe. The analytical sensitivity of assay was tested using serial dilutions of BKV DNA in range between 13500 and 15 copies/ml. 27 urine samples and 23 plasma samples taken from a group of 22 adult recipients of allogeneic HSCT were tested for the presence of polyomavirus BK in the LightCycler system. Described in-house real-time PCR assay detected BKV DNA in 8 specimens (6 urine and 2 plasma). Detected average viral load was 170 copies/ml for plasma and 1250 copies/ml for urine samples, respectively. The results of this study show that developed TaqMan-based probe qpcr assay is very reliable and valuable for detection and quantification of BKV DNA, both in urine and plasma samples. These data, combined with its rapid
Nr 1 Real-time PCR w diagnostyce poliomawirusa BK 87 turnaround time for results and decreased hands-on time, make the LightCycler PCR assay highly suitable for the rapid diagnostics of polyomavirus BK infections in the clinical laboratory. PIŚMIENNICTWO 1. Costa C, Bergallo M, Astegiano S i inni. Monitoring of BK virus replication in the first year following renal transplantation. Nephrol Dial Transplant; 2008; 23: 3333-6. 2. Dropulic LK, Jones RJ. Polyomavirus BK infection in blood and marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplant; 2008; 41: 11-8. 3. Gardner SD, Field AM, Coleman DV i inni. New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after renal transplantation. Lancet; 1971; 7712: 1253-7. 4. Giraud G, Priftakis P, Bogdanovic G i inni. BK-viruria and haemorrhagic cystitis are more frequent in allogeneic haematopoietic stem cell transplant patients receiving full conditioning and unrelated-hla-mismatched grafts. Bone Marrow Transplant; 2008; 41: 737-42. 5. Hirsch HH, Knowels W, Dickenmann M i inni. Prospective study of polyomavirus type BK replication and nephropathy in renal transplant recipients. N Engl J Med; 2002; 347: 488-96. 6. Hirsch HH, Steiger J. Polyomavirus BK. Lancet Infect Dis; 2003; 3: 611-23. 7. Hou J, Jensen PJ, Major EO i inni. Polyomaviruses. W: Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Red. C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2005, 231-8. 8. Knowles WA, Pipkin P, Andrews N i inni. Population-based study of antibody to the human polyomaviruses BKV and JCV and the simian polyomavirus SV40. J Med Virol; 2003; 71: 115-23. 9. Matłosz B, Durlik M, Wesołowska A i inni. Polyoma BK virus reactivation in kidney and pancreaskidney recipients. Transplant Proc; 2005; 37: 947-8. 10. Matłosz B, Durlik M. Śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej wywołane wirusem polyoma BK. Przegl Epidemiol; 2006; 60: 133-40. 11. Matłosz B, Dęborska-Materkowska D, Mróz A i inni. Risk factors for BK nephropathy in kidney or simultaneous kidney-pancreas allograft recipients. Adv Clin Exp Med; 2008; 17: 201-6. 12. Savona MR, Newton D, Frame D i inni. Low-dose cidofovir treatment of BK virus-associated hemorrhagic cystitis in recipients of hematopoietic stem cell transplant. Bone Marrow Transplant; 2007; 39: 783-7. 13. Schönberger S, Meisel R, Adams O i inni. Prospective, comprehensive, and effective viral monitoring in children undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant; 2010;16: 1428-35. 14. Traystman MD, Gupta PK, Shah KV i inni. Identification of viruses in the urine of renal transplant recipients by cytomorphology. Acta Cytol; 1980; 24: 501-10. 15. Wu SW, Chang HR, Lian JD. The effect of low-dose cidofovir on the long-term outcome of polyomavirus-associated nephropathy in renal transplant recipients. Nephrol Dial Transplant; 2009; 24: 1034-8. Otrzymano: 24 I 2011 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny e-mail: dzieciatkowski@wp.pl