WPŁYW ph i TEMPERATURY NA WŁAŚCIWOŚCI LIPOFILOWE ZWIĄZKÓW POLIFENOLOWYCH Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny Tomasz Chmiel, Dagmara Kempińska-Kupczyk, Agata Kot-Wasik, Jacek Namieśnik Gdańsk 19.02.2019
Metody oznaczania lipofilowości Lipofilowość: istotny czynnik wpływający na aktywność biologiczną substancji mierzona poprzez podział danego związku pomiędzy fazy w układzie dwufazowym (ciecz-ciecz lub ciecz-ciało stałe) optymalny zakres: 0 < logp < 3....
Metody oznaczania lipofilowości Lipofilowość: istotny czynnik wpływający na aktywność biologiczną substancji mierzona poprzez podział danego związku pomiędzy fazy w układzie dwufazowym (ciecz-ciecz lub ciecz-ciało stałe) optymalny zakres: 0 < logp < 3
Pomiar lipofilowości wyzwania Lipidy i pochodne kwasów tłuszczowych w organizmach żywych => długołańcuchowe cząsteczki, których łańcuch węglowy jest znacznie dłuższy niż łańcuch węglowy n-oktanolu Organizmyżywe Długość łańcucha węglowego Udział % Literatura Błony komórkowe zwierząt C 14 -C 24 ~50% Coskun U. & Simons K. Structure 19 (2011) 1543 Fitoplankton C 16 -C 18 >55% Zooplankton C 16 -C 24 >40% Ryby C 16 -C 18 40-60% Skorupiaki C 18 -C 22 10-45% Alberts B. et al. Annals of Botany 91 (2003) 401 FAO, Fats and fatty acids in human nutrition 2008 Morais S.M. et al. Animal Sciences 38 (2016) 243 Bergé J.P. et al. Marin Biotechnology 96 (2005) 49 Rossi S. et al. J. Plankton Res. 28 (2006) 551 fosfatydylocholina Kolumna z unieruchomioną sztuczną błoną biologiczną IAM (np. krzemionka modyfikowana cząsteczkami fosfolipidów) n-oktanol kolumna typu C18 z zabezpieczonymi grupami silanolowymi
ph istotny czynnik wpływający na lipofilowość zróżnicowane ph w przewodzie pokarmowym limituje to wchłanianie substancji związane również z ich lipofilowością w zależności od stałej dysocjacji związku (pk) może on występować w: formie zdysocjowanej (jonowej) logd wchłanianie formie niezdysocjowanej logd Jama ustna ph 6,5 7,5 Żołądek Dwunastnica ph 1,5 4,0 ph 5,0 7,0 wchłanianie GALUSAN EPIKATECHINY () Jelito czcze ph 5,2 7,0 Jelito kręte ph 6,6 7,4 Okrężnica ph 5,0-8,0
Zakres prac badawczych Wyznaczenia lipofilowości związków przeciwutleniających z grupy orto-difenoli za pomocą HPLC z wykorzystaniem elucji izokratycznej i gradientowej KWASY FENOLOWE FLAWAN-3-OLE FLAWONY/FLAWONOLE KSANTANOIDY Podgrupa R R 1 R 2 R 3 Nazwa związku Kwasy fenolowe R 1 Kwas chlorogenowy (CA) Kwas protokatechowy (PA) Flawan-3-ole H (-) Epikatechina (EC) Gal 2 Galusan epikatechiny () Flawony H OH Glu 3 OH Izoorientyna (ISR) 6-C-glukozyd luteoliny H OH H OH Luteolina (LUT) Flawanole OH OH H OH Kwercytyna () O-Rut 4 OH H OH Rutyna (RUT) Ksantanoidy Glu Mangiferyna () 1 [(prop-2-enoyl)oksy]-1,4,5-trihydroksycykloheksan; 2 reszta kwasu galusowego; 3 glukoza; 4 rutynoza Wytypowanie deskryptorów lipofilowości Ocena wpływu struktury związków, temperatury oraz ph na właściwości lipofilowe Porównanie uzyskanych wyników z wartościami współczynnika podziału (logp) oznaczonego za pomocą metody ekstrakcyjnej ( shake-flask ) oraz metod obliczeniowych
Lipofilowość o-difenoli wyznaczona w układzie RP-HPLC (37 C ph 2,8) 1,2 log k w chromatograficzny współczynnik podziału CHI (ϕ 0 ) chromatograficzny indeks hydrofobowości (gdy k = 1, czyli log k = 0) k współczynnik retencji t R i t 0 czas retencji i czas martwy m wartość średnia logk 0,9 0,6 0,3 0,0 10 20 30 40 50 60-0,3 φ [%CH 3 OH] -0,6 EC CA RUT ISR LUT PA Nazwa związku logk = f(φ) R 2 φ[%] n mk mlogk CHI or φ 0 logkw logd Kwas chlorogenowy (CA) y = -0.050x + 1.48 1.000 15-35 5 2.77 ± 0.02 0.35 ± 0.01 29.53 ± 0.93 1.48 ± 0.02 1.76 ± 0.03 Kwas protokatechowy (PA) y = -0.030x + 0.67 0.999 15-35 5 0.96 ± 0.01-0.07 ± 0.01 22.79 ± 0.25 0.67 ± 0.01 0.95 ± 0.01 Mangiferyna () y = -0.060x + 2.10 1.000 20-40 5 3.25 ± 0.01 0.33 ± 0.01 35.47 ± 1.09 2.10 ± 0.04 2.33 ± 0.05 Epikatechina (EC) y = -0.054x +1.75 0.999 20-35 4 1.90 ± 0.01 0.12 ± 0.01 32.18 ± 0.76 1.75 ± 0.03 2.03 ± 0.04 Galusan epikatechiny () y = -0.060x + 2.33 0.999 20-35 4 4.13 ± 0.01 0.40 ± 0.01 36.41 ± 0.83 2.33 ± 0.04 2.57 ± 0.04 Kwercytyna () y = -0.048x + 2.86 0.999 45-60 4 3.91 ± 0.01 0.46 ± 0.02 59.68 ± 1.55 2.86 ± 0.05 3.14 ± 0.05 Rutyna (RUT) y = -0.056x + 2.65 0.996 30-50 5 3.73 ± 0.01 0.40 ± 0.01 47.13 ± 1.12 2.65 ± 0.04 2.93 ± 0.05 Luteolina (LUT) y = -0.047x + 2.92 0.999 40-60 5 3.31 ± 0.01 0.44 ± 0.01 61.88±1.72 2.92 ± 0.05 3.19 ± 0.06 Isoorientyna (ISR) y = -0.058x + 2.06 0.999 30-50 5 1.62 ± 0.01 0.03 ± 0.01 40.48±0.86 2.06 ± 0.03 2.34 ± 0.04
Wytypowanie deskryptora lipofilowości niepodatnego na zmiany warunków analizy Odporność (robustness) deskryptorów lipofilowości na zmianę wybranych parametrów HPLC przepływ fazy ruchomej (0,5; 0,7 i 1 ml/min) rodzaj rozpuszczalnika organicznego (MeOH lub ACN) wymiary kolumny chromatograficznej (długość: 125cm lub 50cm) rodzaj fazy stacjonarnej kolumny: kolumna C18 i kolumna IAM Kwas chlorogenowy (95% C.I) Kwercytyna (95% C.I) mk; mlogk; logkw 2,9 2,4 1,9 1,4 0,9 0,4 17,0 13,0 9,0 5,0 1,0 logd & CHI mk; mlogk; logkw; logd 4,9 3,9 2,9 1,9 0,9 58,0 48,0 38,0 28,0 18,0 8,0 CHI -0,1 F.5MeOH F.7MeOH F.7 PhxC18 F.7ACN -3,0-0,1 F.5MeOH F.7MeOH F.7 PhxC18 F.7ACN -2,0 mk mlogk logkw logd CHI mlogk logkw logd CHI mk
Wytypowanie deskryptora lipofilowości niepodatnego na zmiany warunków analizy Wyniki standaryzowane dla poszczególnych deskryptorów lipofilowości (95% przedział ufności; k = 2) Kwas chlorogenowy (CA) Kwercytyna () logd i logk w deskryptory lipofilowości niezależne od zmiany warunków HPLC (kolumna typu C18)
Wytypowanie deskryptora lipofilowości niepodatnego na zmiany warunków analizy Zależność parametrów logd i logkw od rodzaju fazy stacjonarnej " # " $ % % % % φ stosunek faz kolumny chromatograficznej k i, k j współczynniki retencji 2 węglowodorów (np. naftalen i toluen) Pow i, Pow j współczynniki podziału 2 węglowodorów V S objętość fazy stacjonarnej V 0 objętość martwa kolumny
Wpływ struktury związku na właściwości lipofilowe Obecność grupy hydroksylowej oraz reszty cukrowej z reguły zmniejsza lipofilowość związku Lipofilowość wzrasta wraz z długością łańcucha węglowego logd = 3.55 ± 0.06 Kwercytyna Izokwercytyna logd = 3.04±0.32 logd = 3.70 ± 0.07 Luteolina
Wpływ temperatury na właściwości lipofilowe logd 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 ph=2,8 CA PA EC RUT LUT logd 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 ph=7,4 CA EC RUT LUT ISR 0,5 3,21 3,26 3,31 3,36 3,41 1/Tx10-3 [K -1 ] ISR 0 3,21 3,26 3,31 3,36 3,41 1/Tx10-3 [K -1 ] &'() +, 2.3030 1 2 3, 2.3030 Występuje spontaniczne i uporządkowane przeniesienie do fazy organiczne ( tr G o < 0, tr H o < 0, tr S o < 0) Analit CA PA EC RUT LUT ISR tr H o [KJmol -1 ] tr S o [J mol -1 K -1 ] tr G o [KJmol -1 ] -30.81 ± 0.35-65.64 ± 1.16-11.24±0.11-21.52 ± 0.22-51.19 ± 0.73-6.28±0.06-52.50 ± 1.99-124.77 ± 6.61-15.41±0.23-44.88 ± 0.06-105.88 ± 0.21-13.35±0.17-53.99 ± 3.10-124.79 ± 10.3-16.95±0.17-60.10 ± 1.46-133.82 ± 4.86-20.26±0.34-62.32 ± 2.98-144.77 ± 9.90-19.29±0.80-71.98 ± 2.85-171.16 ± 9.49-21.11±0.40-54.88 ± 3.57-126.37 ± 11.9-17.35±0.63
Wpływ ph na właściwości lipofilowe (A) 4 3,5 3 2,5 logd 2 1,5 1 0,5 0 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5-0,5 ph RUT ISR LUT EC CA PA (B) I logd I 1,15 0,9 0,65 0,4 0,15 pka- kwasy fenolowe -0,1 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 pka flawony i flawonole CA PA RUT ISR LUT EC PH pka flawano-3-ole
Wpływ ph na właściwości lipofilowe (A) (B) I logd I logd 4 3,5 1,15 3 0,9 2,5 2 0,65 1,5 0,4 1 0,5 0,15 pka- kwasy fenolowe pka flawony i flawonole 0 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5-0,1-0,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 ph RUT ISR LUT EC CA PA CA PA RUT ISR LUT EC PH pka -flawano-3- ole ph=2,8 ph=7,4 ph=8,6 PA CA CA EC EC CA ISR RUT LUT EC ISR ISR RUT LUT RUT LUT logd
Wpływ ph na właściwości lipofilowe (A) (B) I logd I logd 4 3,5 1,15 3 0,9 2,5 2 0,65 1,5 0,4 1 0,5 0,15 pka- kwasy fenolowe pka flawony i flawonole 0 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5-0,1-0,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 ph RUT ISR LUT EC CA PA CA PA RUT ISR LUT EC PH pka -flawano-3- ole ph=2,8 ph=7,4 ph=8,6 PA CA CA EC EC CA ISR RUT LUT EC ISR ISR RUT LUT RUT LUT logd
Lipofilowość a metoda wyznaczania ph=2,8 ph=7,4 ph=2,8 ph=7,4 HPLC RUT PA CA Metoda ekstrakcyjna Shake-flask CA Metody obliczeniowe CA LogD LogP AvLogP EC EC EC CA ISR RUT LUT PA RUT EC LUT ISR ISR ISR PA RUT LUT RUT LUT LUT CA ISR EC PA
Wyznaczanie lipofilowości za pomocą HPLC z elucją gradientową wstępne wyniki Konieczne przeprowadzenie kilkunastu analiz HPLC z elucją izokratyczną do wyznaczenia logd Bardziej czasochłonne, większe zużycie rozpuszczalników i wzorców, np. dla kwercytyny % MeOH t 0 (uracyl) t R śr k śr logk śr logkw S ϕ mk mlogk 40 1.05 1.05 10.59 9.10 0.96 2.87 0.05 59.68 3.91 0.46 45 1.04 1.04 6.23 4.98 0.70 50 1.04 1.04 3.97 2.83 0.45 55 1.04 1.04 2.75 1.66 0.22 60 1.03 1.03 2.06 1.00 0.00 Czas analizy: 132 min Objętość MeOH: 41mL Możliwość wykorzystania wyników analizy HPLC z elucją gradientową w połączeniu z analizą regresji do przewidywania logd ti C18 (35%MeOH) tg (12) tg(17) ti IAM 20%ACN tg IAM logd C18 logd IAM ti C18 (35%MeOH) 1.00 tgc18 (12min) 0.64 1.00 ti: czas retencji elucja izokratyczna tg: czas retencji elucja gradientowa tg C18 (17min) 0.80 0.96 1.00 ti IAM 20ACN 0.97 0.61 0.76 1.00 tgiam 0.74 0.92 0.91 0.76 1.00 logd C18 0.55 0.98 0.92 0.54 0.92 1.00 logd IAM 0.54 0.96 0.88 0.54 0.94 0.99 1.00
Wyznaczanie lipofilowości za pomocą HPLC z elucją gradientową wstępne wyniki Wyniki lipofilowości uzyskane za pomocą kolumny C18 i IAM są statystycznie podobne (p > 0,91) logd IAM 4,00 3,00 25 C ph 7,4 y = 0,9517x + 0,0298 R² = 0,9755 2,00 1,00 0,00-1,00-0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00-1,00 logd C18 Możliwość oszacowania lipofilowości dla kolumny IAM w oparciu o wyniki uzyskane za pomocą kolumny C18 ograniczenie kosztów (IAM ok. 10 razy droższa od C18)
Podsumowanie i plany na przyszłość Lipofilowość przebadanych o-difenoli (logd) jest odwrotnie proporcjonalna do temperatury. Jednakże nie ma istotnego wpływu na uszeregowanie związków pod względem ich lipofilowości. Warunki ph wpływają istotnie na logd związków polifenolowych (zwłaszcza o niskim pka; np. kwasów fenolowych), a tym samym na ich wchłanianie z przewodu pokarmowego. Największe zmiany lipofilowości odnotowano dla ph bliskiego stałej dysocjacji danego związku (pka 1 < ph < pka + 1). LogD deskryptor lipofilowości niepodatny na zmiany warunków analizy HPLC, co stwarza większą szansę na porównanie wyników uzyskanych przez różne grupy badawcze. Podjęcie próby korelacji logd wyznaczonego w warunkach izokratycznych z wynikami uzyskanymi w warunkach gradientowych dla większej grupy związków możliwość szybkiego określania lipofilowości