Rola badań laboratoryjnych w diagnostyce szpiczaka mnogiego i innych dyskrazji plazmocytów

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(1): 43-52 Praca poglądowa Review Article Rola badań laboratoryjnych w diagnostyce szpiczaka mnogiego i innych dyskrazji plazmocytów Role of laboratory tests in diagnosis of multiple myeloma and other plasmocytes dyscrasia patients Anna Rodziewcz-Lurzyńska 1, Dagna Bobilewicz 1,2 1 Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny w Warszawie, Laboratorium Centralne 2 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Wydziału Nauki o Zdrowiu Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, Warszawa Streszczenie Nowotwory z komórek plazmatycznych stanowią dużą grupę chorób, charakteryzujących sie niekontrolowanym rozrostem pojedynczego klonu plazmocytów, wytwarzających jednorodne białko monoklonalną immunoglobulinę lub jej podjednostki (lekkie i ciężkie łańcuchy). Monoklonalne białko w większości przypadków manifestuje się w proteinogramie obecnością dodatkowego prążka we frakcji gammaglobulin aczkolwiek jego brak nie wyklucza patologii. Dla najczęściej występujących chorób, czego przykładem jest szpiczak mnogi, zostały opracowane i są aktualizowane algorytmy postępowania, natomiast w odniesieniu do rzadziej występujących (np. amyloidoza AL) istnieją problemy diagnostyczne, dla rozwiązania których poza badaniami stosowanymi od dawna ma znaczenie wprowadzanie nowych markerów jak np. lekkie wolne łańcuchy. W pracy przedstawiono szereg wyników własnych ilustrujących laboratoryjny obraz dyskrazji. Summary Plasma cell dyscrasia is a group of diseases characterized by uncontrolled proliferation of single clone of plasma cells producing monoclonal protein immunoglobulin and/or its subunits (light and heavy chains). Monoclonal protein most often can be detected as an extra band on serum protein pattern, nevertheless if it is lacking pathological condition cannot be excluded. Multiple myeloma is the most common gammapathy and the diagnostic criteria are well précised and updated. In case of the others like AL amyloidosis many problems with interpretation of laboratory results exist. For solving them besides of well established laboratory tests like serum protein electrophoresis the others like serum free light chains are being introduced. The own results illustrating laboratory picture of discrasia are presented. Słowa kluczowe: Key words: gammapatie monoklonalne, szpiczak mnogi, białko monoklonalne, elektroforeza białek surowicy, immunofiksacja białek, wolne łańcuchy lekkie w surowicy. monoclonal gammapathy, multiple myeloma, monoclonal protein, serum protein electrophoresis, immunofixation, serum free light chains. Wstęp Nowotwory z komórek plazmatycznych stanowią dużą grupę chorób, określanych mianem gammapatii monoklonalnych. Charakteryzuje je niekontrolowany rozrost pojedynczego klonu plazmocytów, wytwarzających jednorodne białko monoklonalną immunoglobulinę lub jej podjednostki (lekkie i ciężkie łańcuchy). W większości przypadków monoklonalne białko manifestuje się w proteinogramie obecnością dodatkowego prążka we frakcji gammaglobulin, aczkolwiek brak ewidentnych zmian w rozdziale elektroforetycznym nie wyklucza patologii. Do gammapatii monoklonalnych zalicza się: szpiczaka mnogiego, gammapatię o nieustalonym znaczeniu (MGUS), szpiczaka bezobjawowego (tlącego), szpiczaka niewydzielającego, białaczkę plazmocytową (plazmatyczno-komórkową), guzy plazmatyczno-komórkowe (izolowany szpiczak kości, pozakostny pozaszpikowy guz plazmatyczno-komórkowy), choroby z odkładania immunoglobulin (pierwotna układowa amyloidoza łańcuchów lekkich AL, choroba depozytów łańcuchów lekkich i ciężkich), szpiczaka z osteosklerozą (zespół POEMS polineuropatia, organomegalia, endokrynopatia, gammapatia monoklonalna i zmiany skórne) oraz makroglobulinemię Waldenströma [1]. Dla rozpoznania najczęstszych z nich w tym szpiczaka plazmocytowego zostały opracowane algorytmy postępowania [1, 2, 3]. Choroby, z którymi mamy do czynienia relatywnie rzadko, np. amyloidoza 43

www.diagnostykalaboratoryjna.eu spowodowanej przez klon nowotworowy. Zaburzony stosunek łańcuchów lekkich kappa do lambda (sflc; serum free light chain ratio), przemawia z dużym prawdopodobieństwem za rozrostem monoklonalnym. Wysoka aktywność dehydrogenazy mleczanowej oraz podwyższone stężenie beta 2-mikroglobuliny wskazuje na dużą agresywność choroby. Beta 2-mikroglobulina jest białkiem o niskiej masie cząsteczkowej, obecnym na powierzchni komórek jądrzastych, zwłaszcza limfocytów, dlatego też jest ono uznawane za wskaźnik masy nowotworowego klonu komórek plazmatycznych. W międzynarodowej klasyfikacji prognostycznej szpiczaka plazmocytowego są uwzględniane stężenia albuminy oraz beta 2-mikroglobuliny. W prezentowanym przypadku było to stadium III dla którego mediana czasu przeżycia wynosi ok. 29 miesięcy [1]. Pacjentka zmarła po 8 miesiącach od przyjęcia na oddział hematologiczny. AL, stanowią natomiast tak dla klinicystów, jak i diagnostów laboratoryjnych duży problem diagnostyczny. Celem pracy było przedstawienie roli laboratorium w rozpoznawaniu i monitorowaniu wybranych gammapatii między innymi w oparciu o wyniki badań własnych. Szpiczak mnogi Szpiczak mnogi jest najczęstszą gammapatią monoklonalną. Pomimo upływu lat elektroforeza białek surowicy pozostaje nadal dobrym i tanim badaniem przesiewowym, szczególnie wówczas, gdy towarzyszą jej typowe zmiany w innych badaniach rutynowych. Na rycinie 1. przedstawiono wyniki proteinogramu i dodatkowo wykonanej immunofiksacji białek surowicy chorego z aktywną postacią szpiczaka plazmocytowego. Widoczny jest wyraźny dodatkowy monoklonalny prążek we frakcji gamma globulin, przewyższający nawet pik albuminy. W tym przypadku badaniem uzupełniającym jest immunofiksacja, uznawana za referencyjną metodę wykrywania białka monoklonalnego w szpiczaku plazmocytowym (czułość analityczna 12-25 mg/dl). Technika ta polega na równoczesnym rozdziale białek surowicy na 6-ciu ścieżkach, a następnie inkubacji ze swoistymi przeciwciałami dla poszczególnych łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Badanie ma na celu nie tylko potwierdzenie obecności białka monoklonalnego ale również określenie klasy i typu białka. U tego chorego wykryto białko monoklonalne klasy IgG typu kappa. Poza tym stwierdzono typowe trzycyfrowe OB, niedokrwistość (zazwyczaj normocytowa i normobarwliwa, w rozmazie krwi spotykana rulonizacja erytrocytów), podwyższone stężenie kreatyniny, obniżone przesączanie kłębuszkowe (egfr), obecność białka w moczu, świadczące o uszkodzeniu nerek oraz wysokie stężenie wapnia, będące następstwem osteolizy wywołanej rozrostem komórek plazmatycznych w kościach. Stężenie IgG jest wybitnie podwyższone, natomiast pozostałych klas obniżone. Jest to wynik immunosupresji prawidłowych komórek plazmatycznych Stan przednowotworowy szpiczaka MGUS (Monoclnal Gammapathy of Undetermined Significance) Aktywną postać szpiczaka plazmocytowego może poprzedzać gammapatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu (MGUS), której ryzyko progresji wynosi 1% rocznie [1, 2]. Może ulec także transformacji do amyloidozy AL, makroglobulinemii Waldenströma czy innych chorób limfoproliferacyjnych [1, 2, 3]. Kryteria rozpoznania MGUS [3]: stężenie białka monoklonalnego w surowicy <3,0 g/dl; obecność klonalnych plazmocytów w szpiku <10%; brak uszkodzeń narządowych (CRAB: C hiperkalcemia, R niewydolność nerek, A niedokrwistość, B zmiany kostne) Badanie szpiku może zostać wykonane później u pacjentów z niskim ryzykiem MGUS (klasa IgG, białko monoklonalne <1,5 g/dl i prawidłowy stosunek wolnych lekkich łańcuchów kappa/lambda) Na rycinie 2. przedstawiono proteinogram i wynik immunofiksacji u pacjenta z rozpoznaniem MGUS. We frakcji gammaglobulin obecny jest niewielki dodatkowy prążek, immunofiksacja surowicy potwierdziła obecność białka monoklonalnego klasy IgG typu kappa, w moczu brak białka monoklonalnego. Pozostałe wyniki badań były w normie, zarówno ilościowe oznaczanie immunoglobulin jak i stosunek wolnych lekkich łańcuchów kappa/lambda. Rycina 1. Proteinogram i immunofiksacja surowicy pacjenta z aktywną postacią szpiczaka plazmocytowego. Pozostałe wyniki badań: OB 130 mm/1h, Hb 9,20 g/dl, kreatynina 1,58 mg/dl, egfr <32,7 ml/min/1,73m 2, białko całkowite 14,0 g/dl, Ca 3,61 mmol/l, LDH 408 U/I, CRP 13,5 mg/l, IgA 17 mg/dl, IgG 9267 mg/dl, IgM <3 mg/dl, beta 2-mikroglobulina 12,72 mg/l, k 178,73 mg/l, l 5,60 mg/l, k/l 31,92, białko w moczu 47 mg/dl. Szpiczak tlący i co dalej? Pełnoobjawową postać szpiczaka plazmocytowego poprzedza obecność szpiczaka tlącego (bezobjawowego). Ryzyko progresji do postaci objawowej wynosi 10% rocznie w ciągu pierwszych 5 44

Diagn Lab 2015; 51(1): 43-52 lat od rozpoznania, a następnie zmniejsza się [4]. Według Międzynarodowej Grupy Roboczej ds. Szpiczaka Mnogiego do zdiagnozowania szpiczaka tlącego spełnione muszą być dwa kryteria [3] stężenie białka monoklonalnego w surowicy (IgG lub IgA) 3,0 g/dl lub białko monoklonalne w moczu 500mg/24h i/ lub klonalne plazmocyty szpiku kostnym (10 60%) brak cech pełnoobjawowego szpiczaka (CRAB) lub amyloidozy Rycina 3 przedstawia proteinogram i wynik immunofiksacji pacjenta z ostatecznym rozpoznaniem szpiczaka tlącego. Widoczny dodatkowy prążek we frakcji gammaglobulin przy prawidłowym stężeniu białka całkowitego i jego poszczególnych frakcji. W immunofiksacji obecne monoklonalne białko klasy IgG typu lambda. Zaburzony jest stosunek wolnych lekkich łańcuchów kappa/ lambda. Pozostałe wyniki badań w normie bez cech uszkodzeń narządów. W badaniu radiologicznym całego układu kostnego brak zmian. Decydującym badaniem była trepanobiopsja, w której liczba plazmocytów wynosiła 25%, w badaniu aspiracyjnym szpiku kostnego ich liczba nie przekraczała 10%. W tym stadium choroby zaleca się regularne wykonywanie proteinogramu, początkowo w odstępach jednomiesięcznych, a później 2-3miesięcznych, celem ustalenia dynamiki choroby [3, 5, 6]. Monitorowanie jej przebiegu opiera się na ocenie powierzchni piku monoklonalnego. Ponadto wykonywane są podstawowe badania laboratoryjne jak: morfologia krwi, oznaczenie stężenia kreatyniny, wapnia, albuminy, beta 2-mikroglouliny, aktywności LDH oraz badanie ogólne moczu [2, 5]. W przypadkach braku Rycina 2. Proteinogram i immunofiksacja surowicy pacjenta z MGUS. Pozostałe wyniki badań: Hb 14,17 g/dl, kreatynina 0,85 mg/dl, białko całkowite 6,9 g/dl, Ca 2,46 mmol/l, LDH 175 U/I, CRP 0,7 mg/l, IgA 157 mg/dl, IgG 887 mg/dl, IgM 140 mg/dl, k 11,59 mg/l, l 18,85 mg/l, k/l 0,61. W immunofiksacji moczu nie wykryto białka monoklonalnego. dodatkowego prążka w elektroforezie do monitorowania wykorzystuje się badania stężenia wolnych lekkich łańcuchów kappa i lambda, stężenia immunoglobulin oraz immunofiksację białek. Badania wykonywane są w celu jak najwcześniejszego uchwycenia progresji do pełnoobjawowej choroby i wdrożenia leczenia. Choroba lekkiego łańcucha nietypowy proteinogram Szpiczak, w którym nowotworowy klon komórek plazmatycznych wydziela tylko i wyłącznie lekki łańcuch immunoglobuliny, nosi nazwę choroby lekkiego łańcucha. Stanowi on ok. 20% przypadków szpiczaka. Proteinogram jest odmienny niż w szpiczaku, produkującym białko monoklonalne w postaci kompletnej im- Rycina 3. Proteinogram i immunofiksacja surowicy pacjenta z tląca postacią szpiczaka. Pozostałe wyniki badań: Hb 13,80 g/dl, kreatynina 0,85 mg/dl, egfr >60,ml/min/1,73m 2, białko całkowite 6,6 g/dl, Ca 2,35 mmol/l, LDH 156 U/I, CRP 2,1 mg/l, IgA 134mg/dl, IgG 1106 mg/dl, IgM 73 mg/dl, k 10,87 mg/l, l 54,59 mg/l, k/l 0,20. W immunofiksacji moczu nie wykryto białka monoklonalnego. 45

www.diagnostykalaboratoryjna.eu munoglobuliny. W ok. 40% przypadków stwierdza się brak zmian w postaci dodatkowego piku a także często występującą hipogammaglobulinemię przy prawidłowym lub obniżonym stężeniu białka całkowitego w surowicy [7]. Wzrost stężenia białek ostrej fazy we frakcji alfa-2 globulin (np. w stanach zapalnych) może maskować obecność słabego dodatkowego prążka monoklonalnego. Ilość białka monoklonalnego wykrywanego w surowicy zależy od stadium choroby. Początkowo uwidocznia się jedynie w surowicy, następnie wraz z postępem choroby w surowicy i moczu. Wiąże się to z narastającą niewydolnością nerek wywołaną przez wolne łańcuchy lekkie o nefrotoksycznym działaniu. Zalecane jest wykonanie immunofiksacji białek surowicy i oznaczenie sflc, co razem z proteinogramem znacząco podwyższa czułość diagnostyczną [8]. W przypadku pojawienia się białka w moczu przydatne jest wykonanie immunofiksacji w moczu z dobowej zbiórki. Na rycinie 4. przedstawiono wyniki proteinogramu i immunofiksacji surowicy pacjenta z chorobą lekkiego łańcucha. Obecne jest białko monoklonalne, wolne lekkie łańcuchy typu kappa. Stwierdza się charakterystyczne obniżenie stężenia wszystkich rutynowo oznaczanych klas immunoglobulin (G, A, M) oraz zaburzony stosunek wolnych łańcuchów lekkich z wybitnie podwyższonym stężeniem wolnego łańcucha lekkiego zaangażowanego w proces nowotworowy. Wysokie stężenie kreatyniny i obniżony egfr oraz bardzo duży białkomocz dobowy wskazują na uszkodzenie nerek. Wartość beta 2-mikroglobuliny sugeruje krótki okres przeżycia (stadium III). Choroby z odkładania białka monoklonalnego trudna diagnostyka Chorobą zaliczaną do gammapatii monoklonalnych jest również amyloidoza AL, w której nowotworowe plazmocyty produkują jednorodne białko, fragment lub cały łańcuch lekki immunoglobuliny, najczęściej łańcuch lekki lambda [9]. Białko to tworzy włókienka amyloidowe o zmienionej strukturze tzw. kartki beta (β), nierozpuszczalne i oporne na działanie enzymów proteolitycznych, które odkładane pozakomórkowo w tkankach i narządach prowadzą do upośledzenia ich funkcji. Do kryteriów rozpoznania pierwotnej układowej amyloidozy łańcuchów lekkich zalicza się [9]: obecność wtórnych do odkładania amyloidu zaburzeń narządowych (zajęcie nerek, wątroby, serca, przewodu pokarmowego i obwodowego układu nerwowego), potwierdzenie obecności amyloidu barwieniem czerwienią Kongo w biopsji tkankowej (tkanka tłuszczowa, szpik kostny) lub w biopsji narządowej, potwierdzenie w badaniach histochemicznych obecności łańcuchów lekkich immunoglobulin, potwierdzenie dyskrazji plazmocytów (białko monoklonalne w surowicy lub moczu, nieprawidłowy stosunek łańcuchów lekkich, obecność klonalnych plazmocytów w szpiku kostnym). Do postawienia pełnego rozpoznania powinny być spełnione wszystkie kryteria [9]. Amyloidoza AL jest chorobą trudną do rozpoznania. Obecnie badaniem przesiewowym jest immunofiksacja białek surowicy i moczu (czułość 74%) oraz oznaczenia sflc (czułość 88%) [8, 9]. W praktyce nie zawsze wyniki wszystkich badań są dodatnie. U około 10-15% chorych stężenie łańcucha zaangażowanego w proces nowotworowy jest niewiele podwyższone, niekiedy z zachowanym stosunkiem kappa/lambda [10]. Elektroforeza białek surowicy nie jest w tej chorobie dostatecznie dobrym badaniem przesiewowym, jej czułość wynosi 66%, podczas gdy w szpiczaku plazmocytowym sięga 87,6% [8]. Z doświadczeń własnych, w większości przypadków amyloidozy AL w proteinogramie obserwuje się jedynie hipogammagloblulinemię z bardziej lub mniej zaawansowaną hipoproteinemią. Rycina 5 przedstawia wyniki chorego na amyloidozę AL. W immunofiksacji nie zostało wykryte białko monoklonalne, co spowodowane jest odkładaniem białka w tkankach i narządach. Krążącego amyloidu jest mało, co przekłada się na niewiele podwyższone stężenie łańcucha lekkiego typu lambda i zaburzenie stosunku kappa/lambda. W moczu obecne są niewielkie ilości białka monoklonalnego. W odróżnieniu od szpiczaka plazmocytowego, w moczu obok wolnych łańcuchów, jest obecna albumina. [9] W przypadku stwierdzenia dużego białkomoczu (nerczycowego) niewiadome- Rycina 4. Proteinogram z dwoma dodatkowymi pikami we frakcji gammaglobulin i immunofiksacja surowicy z obecnym białkiem monoklonalnym wolny łańcuch lekki typu kappa. Pozostałe wyniki badań: kreatynina 1,22 mg/dl, egfr <39,7 ml/min/1,73m 2, białko całkowite 5,2 g/dl, Ca 1,94 mmol/l, LDH 377 U/I, IgA 8 mg/dl, IgG 201 mg/dl, IgM 7 mg/dl, beta 2-mikroglobulina 9,35 mg/l, k 17991 mg/l, l 5,6 mg/l, k/l 3212,68. Immunofiksacja moczu obecne białko monoklonalne wolne lekkie łańcuchy typu kappa, białkomocz 17,60 g/24h. 46

Diagn Lab 2015; 51(1): 43-52 go pochodzenia należy rozważyć możliwość występowania amyloidozy AL [9, 10]. Inną chorobą monoklonalną, którą cechuje odkładnie monoklonalnego białka w narządach, jest choroba depozytów łańcuchów lekkich i ciężkich. W odróżnieniu od amyloidozy AL charakterystyczna jest dla niej ziarnista (niezorganizowana) struktura złogów, która nie barwi się czerwienią Kongo, a najczęściej występującym białkiem monoklonalnym jest wolny łańcuch lekki kappa [6]. Przede wszystkim prowadzi do uszkodzenia nerek, w mniejszym stopniu serca i wątroby [6]. Rycina 5. Proteinogram i immunofiksacja surowicy chorego na AL z zespołem nerczycowym. Charakterystyczna hipoproteinemia, hipoalbuminemia, wzrost frakcji alfa 2-globulin i hipogammaglobulinemia. W immunofiksacji surowicy nie stwierdzono obecności białka monoklonalnego. W immunofiksacji moczu obecne białko monoklonalne wolne łańcuchy lekkie typu lambda, białko 2,41 g/24h, k 17,95 mg/l, l 63,37 mg/l, k/l 0,28. Inne szpiczaki trudne do zdiagnozowania Rzadko występują tzw. szpiczaki niewydzielające wśród których można wyróżnić dwie grupy [11]: prawdziwie niewydzielający (ale pro- Pozostałe wyniki badań: kreatynina 1,79 mg/dl, egfr <32,7 ml/min/1,73m 2, białko całkowite 7,3 g/dl, Ca 2,69 mmol/l, LDH 700U/I, Rycina 6. Proteinogram i immunofiksacja surowicy pacjenta ze szpiczakiem plazmocytowym w klasie IgD. dukujący ) szpiczak CRP 4,9 mg/l, IgA 31 mg/dl, IgG 358 mg/dl, IgM 11 mg/dl, beta 2-mikroglobulina 6,07 mg/l, k 8,25 mg/l, l 3385,00 mg/l, k/l 0,00. białko monoklonalne obecne wewnątrz nowotworowych plazmocytów widoczne w specjalnym barwieniu, nie wydzielane poza komórkowy). Dla tej jednostki chorobowej charakterystyczne są poje- Równie rzadko występuje tzw. szpiczak pozakostny (pozaszpikę, występuje u ok. 85% chorych; dyncze guzy tkanek miękkich, utworzone przez komórki plazmatyczne w całym ciele, przede wszystkim dotyczących głowy i szyi nieprodukujący szpiczak brak białka monoklonalnego nawet w plazmocytach, występuje w ok. 15% chorych na szpiczaka [1, 12]. W surowicy i moczu brak jest białka monoklonalnego lub niewydzielającego. stwierdza się jego bardzo niskie stężenie. W takich przypadkach W przypadku tych chorych żadne metody laboratoryjne oprócz w poszukiwaniu zmiany wykonywane są badania obrazowe [1, 3]. badania szpiku kostnego uzyskanego metodą aspiracji i trepanobiopsji nie pozwalają na potwierdzenie rozpoznania. Jednakże po Rzadkie postacie szpiczaka plazmocytowego IgD i IgE wprowadzeniu czułych testów do oznaczania stężenia wolnych Klon komórek szpiczakowych w około 50% przypadków wydziela białko monoklonalne w klasie IgG [1]. Szpiczaki w klasie IgD lekkich łańcuchów okazało się, że część szpiczaków niewydzielających (ale produkujących ) wydziela niewielkie ilości wolnych (2%) i IgE są niezmiernie rzadkie (kilkadziesiąt przypadków na łańcuchów, które jednak tradycyjnymi metodami elektroforetycznymi nie są wykrywane. Izolowany szpiczak kości stanowi <5% czaka, jednakże znacznie częściej wtórnie pojawia się amyloidoza świecie) [1, 13]. Objawy kliniczne są podobne do innych klas szpi- nowotworów z komórek plazmatycznych [1, 12]. Charakterystyczna i transformacja do formy pozaszpikowej oraz cechy uszkodzenia jest pojedyncza zmiana kostna. W surowicy i moczu brak jest białka nerek [13]. Na rycinie 6. przedstawiono wyniki proteinogramu monoklonalnego lub stwierdza się jego bardzo niskie stężenie. Istnieje bardzo duże ryzyko progresji do szpiczaka plazmocytowego. Immunofiksacja wykazała obecność białka monoklonalnego z obecnym dodatkowym prążkiem we frakcji gammaglobulin. klasy 47

www.diagnostykalaboratoryjna.eu IgD typu lambda oraz białka monoklonalnego wolny łańcuch lekki lambda. Pozostałe wyniki wskazują na typowe dla tej postaci szpiczaka uszkodzenie nerek stężenie kreatyniny podwyższone i obniżony egfr. Wysoka aktywność dehydrogenazy mleczanowej oraz wysokie stężenie β2-mikroglobuliny wskazują na dość agresywny przebieg choroby. Nie oznaczono bezpośrednio stężenia IgD, natomiast obniżone stężenie innych klas immunoglobulin przemawia za supresją szpiku kostnego. Zaburzony stosunek wolnych łańcuchów kappa/lambda, będący wynikiem wysokiego stężenia łańcucha lambda, jest dodatkowym złym czynnikiem prognostycznym uszkodzenia nerek. Na rycinie 7. przedstawiono wyniki proteinogramu z dodatkowym bardzo małym prążkiem. W immunofiksacji obecne białko monoklonalnego w klasie IgE typu lambda. limfoplazmocytem [6]. Jest to chłoniak limfoplazmatyczny z gammapatią monoklonalną IgM [1]. W odróżnieniu od szpiczaka plazmocytowego w klasie IgM, który występuje wyjątkowo rzadko, brak jest zmian osteolitycznych. Ponadto w makroglobulinemii występują nieco inne objawy kliniczne, takie jak: niedokrwistość, gorączka, spadek masy ciała, nocne poty, nadlepkość krwi, powiększenie węzłów chłonnych, wątroby i śledziony, amyloidoza, krioglobulinemia oraz neuropatie czuciowo-motoryczne [6, 14]. Kryterium rozpoznania stanowi obecność 10% limfoplazmocytów w szpiku kostnym oraz białka monoklonalnego w klasie IgM. [1] W chorobie tej badanie elektroforetyczne białek surowicy jest bardzo dobrym badaniem przesiewowym, którego czułość wynosi blisko 100% [8]. Białko całkowite marker niedoskonały Wysokie stężenie białka całkowitego jest jednym z pierwszych sygnałów choroby. Test ten jednak nie jest dostatecznie czuły, zwłaszcza w początkowym i terminalnym okresie choroby (Ryc. 8) [10]. Na początku choroby stężenie białka może pozostawać w granicach normy i stopniowo wzrastać jako wynik nasilania się produkcji białka monoklonalnego. Nietypo- Rycina 7. Proteinogram i immunofiksacja surowicy chorego dializowanego z obecnym białkiem monoklonalnym w klasie IgE. Pozostałe wyniki badań: OB 32 mm/1h, kreatynina 6,67 mg/dl, białko całkowite 6,6 g/dl, Ca 2,37 mmol/l, LDH 184U/I, CRP 1,2 mg/l, IgA 17 mg/dl, IgG 426 mg/dl, IgM 33 mg/dl, beta 2-mikroglobulina 27,22 mg/l, k 69,53 mg/l, l 255,53 mg\l, k/l 0,27. wo w końcowym etapie choroby, kiedy stężenie Makroglobulinemia Waldenströma a szpiczak IgM białka monoklonalnego jest bardzo wysokie, przekraczające niekiedy 4g/dl, stężenie białka całkowitego pozostaje w normie bądź Makroglobulinemia Waldenströma jest nowotworową chorobą dotyczącą komórki pośredniej miedzy limfocytem B a plazmocytem tzw. młodej komórki plazmatycznej potocznie nazywanej spadku stężenia wszystkich białek, a głównie albuminy, wywoła- jest nieznacznie podwyższone. Wynika to przede wszystkim ze nego wyniszczeniem organizmu przez toczący się proces nowotworowy. Stężenie białka całkowitego wzrasta również w przewlekłych stanach zapalnych, czy chorobach autoimmunizacyjnych, w których dochodzi do produkcji przeciwciał poliklonalnych przez wiele różnych linii komórek plazmatycznych. W różnicowaniu produkcji mono i poliklonalnej Rycina 8. Proteinogram w początkowym i terminalnym okresie szpiczaka plazmocytowego. pomocne są oznaczenia stężenia poszczególnych 48

Diagn Lab 2015; 51(1): 43-52 klas immunoglobulin oraz wolnych łańcuchów lekkich kappa i lambda w surowicy. W procesach zapalnych zazwyczaj obserwuje się wzrost wszystkich klas immunoglobulin i niezaburzony stosunek wolnego lekkiego łańcucha kappa do lambda. W rozrostach monoklonalnych stężenie jednej z klas jest natomiast wyraźnie podwyższone, a pozostałych obniżone Rycina 9. A) Produkcja poliklonalna: IgG 3360 mg/dl, IgA 771 mg/dl, IgM 255mg/dl, k /l 0,98. B) Produkcja monoklonalna: IgG 5843 mg/dl, IgA 37 mg/dl, IgM 9 mg/dl k/l 0,10. bądź pozostaje jeszcze w granicach normy, a stosunek sflc jest zaburzony (Ryc. 9, 10). Proteinogram badanie przesiewowe a może tylko monitorowanie Badaniem przesiewowym jest rozdział elektroforetyczny, obecnie coraz częściej wykonywany metodą elektroforezy kapilarnej, co znacznie przyspiesza czas uzyskania wyniku. W znacznym odsetku przypadków stwierdza się obecność dodatkowego piku, a czułość diagnostyczna dla szpiczaka plazmocytowego wynosi 87,6 % [8]. Tym nie mniej u ok. 13% chorych nie stwierdza się dodatkowego prążka, którego obecność jest zależna od ilości krążącego białka monoklonalnego [3, 8]. Monoklonalne immunoglobuliny mogą być: wydzielane na zewnątrz komórki, odkładane pozakomórkowo bądź kumulowane wewnątrz plazmocyta. Bardzo rzadko nowotworowe plazmocyty nie produkują immunoglobulin. Takie sytuacje spotyka się m.in. w: szpiczaku plazmocytowym, amyloidozie AL czy chorobie depozytów łańcuchów lekkich/ciężkich i szpiczaku niewydzielającym. W ostatnich latach wprowadzono badanie stężenia wolnych lekkich łańcuchów kappa i lambda w surowicy, co dodatkowo przyśpieszyło proces diagnostyczny. W komórce plazmatycznej zarówno prawidłowej jak i nowotworowej syntetyzowane są równocześnie łańcuchy ciężkie i lekkie immunoglobulin, przy czym te drugie wytwarzane są w pewnym nadmiarze (ok. 40%) [7, 15]. Wewnątrz komórki plazmatycznej dochodzi do sprzęgania łańcuchów, a nadmiar wolnych lekkich łańcuchów jest wydzielany na zewnątrz. Następnie są one filtrowane w kłębuszku nerkowym, reabsorbowane i rozkładane przez enzymy lizosomalne kanalika proksymalnego. Łańcuch lekki kappa (k) występuje zazwyczaj w postaci monomeru, a lambda (l) w postaci dimeru. Okres półtrwania tych białek jest bardzo krótki wynosi od 2 do 6 godzin, co umożliwia monitorowanie pacjenta w czasie rzeczywistym [10]. Dla porównania okres półtrwania immunoglobulin jest znacznie dłuższy np.: dla immunoglobuliny IgG wynosi średnio 21 dni. Oznaczenia wolnych lekkich łańcuchów są wykonywane metodą immunonefelometryczną bądź immunoturbidymetryczną. Ze względu na fakt, że na ich powierzchni znajduje się wiele epitopów zalecane jest stosowanie przeciw- Rycina 10. Porównanie wyników immunofiksacji białek surowicy: A) brak białka monoklonalnego wzrost stężenia immunoglobulin poliklonalnych; B) obecne białko monoklonalne w klasie IgG typu lambda. ciał poliklonalnych. W piśmiennictwie dla tej metody dostępne są liczne dane, dotyczące wartości diagnostycznej tych testów. Na podstawie oznaczeń sflc można z dużym prawdopodobieństwem wnioskować o rozroście monoklonalnym. Zaburzony stosunek wolnego lekkiego łańcucha kappa do lambda występuje w 1/3 przypadków MGUS, w 70% szpiczaka tlącego i w ponad 90% szpiczaka plazmocytowego [3]. Oznaczenia sflc początkowo miały zastąpić elektroforezę białek jednakże nie we wszystkich przypadkach chorób nowotworowych komórki plazmatycznej wykrywa się ich obecność i dlatego zalecane jest wykonanie łącznie proteinogramu i sflc, w celu zwiększenia czułości [7, 15]. W przypadku makroglobulinemii Waldenströma stężenie wolnych łańcuchów lekkich może natomiast pozostać w normie (czułość sflc ok. 73%) [8]. Obecnie oznaczenia sflc przede wszystkim wykorzystywane są do monitorowania procesu leczenia, oceny ryzyka uszkodzenia nerek i innych narządów oraz potwierdzenia rozpoznania w przypadkach gdy nie jest wykrywane białko monoklonalne, a istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia choroby, a mianowicie w szpiczaku niewydzielającym oraz amyloidozie AL. Białko monoklonalne może migrować z innymi białkami jak transferryna, β lipoproteiny czy składowa C3 dopełniacza do wąskiej frakcji β i pozostać niezauważone [2]. Dlatego też prawidłowy proteinogram nie może wykluczać wykonania immunofiksacji białek surowicy. Dobrym przykładem jest w tym względzie rycina 11, 49

www.diagnostykalaboratoryjna.eu (probówka, igła oraz strzykawka powinny być ogrzane, a krew zaraz po pobraniu przetransportowana do laboratorium z zachowaniem odpowiedniej temperatury). Następnie surowica zostaje poddana wielodniowej obserwacji w temperaturze 4 C. Jeśli pojawia się osad, żelifikacja bądź zmętnienie próbki, które ustępują po ogrzaniu, wykonywana jest immunofiksacja uprzednio Rycina 11. Proteinogram bez widocznego dodatkowego piku, niewiele podwyższona frakcja beta 1-globulin. Immunofiksacja wykazała obecność niewielkich ilości białka monoklonalnego klasy IgA typu kappa. oczyszczonego osadu (ryc. 12). Tą techniką może być określony charakter krioglobuliny poliklonalna/monoklonalna oraz klasa i jej typ. Jeżeli białko monoklonalne ma charakter krioglobuliny wszystkie badania laboratoryjne powinny być wykonywane w temp. 37 C w materiale pobranym w w/w sposób. Rycina 12. Wynik immunofiksacji krioglobulin: A) krioglobulinemia mieszana obecna poliklonalna immunoglobulina klasy IgG oraz monoklonalna klasy IgM typu kappa; B) krioglobulinemia monoklonalna obecna krioglobulina monoklonalna klasy IgG typu kappa. na której przedstawiono prawidłowy proteinogram, natomiast immunofiksacja białek ujawnia obecność niewielkich ilości białka monoklonalnego. Najczęściej jest to monoklonalne białko w klasie IgA, w takich wypadkach zaleca się monitorowanie pacjenta poprzez oznaczanie stężenia tej immunoglobuliny. Proteinogram to również użyteczne narzędzie przy monitorowaniu przebiegu choroby zarówno przed leczeniem, w trakcie jak i w kontroli chorych po jego zakończeniu. Badanie szpiku kostnego jest wykonywane jedynie w przypadku podejrzenia uzyskania odpowiedzi całkowitej na leczenie. Tylko w szpiczaku niewydzielającym jest to badanie wykonywane do każdej oceny odpowiedzi na leczenie [3]. Krioglobulinemia towarzysząca szpiczakom Krioglobuliny są to nieprawidłowe monoklonalne lub poliklonalne przeciwciała, tworzące często kompleksy immunologiczne, które w temperaturze poniżej 37 C ulegają precypitacji, żelifikacji, a po ogrzaniu ponownie ulegają ulegają rozpuszczeniu [16]. Krioglobuliny mogą towarzyszyć wielu chorobom wątroby, zespołom limfoproliferacyjnym, kłębuszkowym zapaleniom nerek, chorobom autoimmunizacyjnym, a także szpiczakom i makroglobulinemi Waldenströma [16]. Według podziału Broueta gammapatiom towarzyszy typ I krioglobulinemii (monoklonalne immunoglobuliny) i stanowi ok. 1% przypadków. Obecność krioglobulin prowadzi do różnorakich manifestacji klinicznych i sprawia duży problem techniczny w wykonaniu badań laboratoryjnych. Badanie w kierunku krioglobulin wymaga pobrania krwi w temperaturze ok. 37 C Podsumowanie Możliwości metodyczne jak i doświadczenia kliniczne oraz nowe opcje terapeutyczne sprawiają, że zalecane kryteria w rozpoznawaniu gammapatii, w szczególności najczęstszej z nich, jaką jest szpiczak plazmocytowy, ulegają systematycznym zmianom. Klasyczne kryteria obejmowały obecność monoklonalnych komórek plazmatycznych, białka monoklonalnego oraz niewydolność narządową tzw. CRAB (Calcium zwiększone stężenie wapnia >2,75 mmol/l; Renal dysfunkcja nerek, kreatynina >2mg/dl; Anaemia niedokrwistość Hb<10 g/dl; Bone zmiany kostne). Dotychczas rozpoznanie szpiczaka plazmocytowego i wdrożenie leczenia wymagało obecności uszkodzeń narządowych. Zmienione wymogi przedstawione w 2014 r. przez Międzynarodową Grupę Roboczą ds. Szpiczaka Mnogiego kładą mniejszy nacisk na zmiany narządowe, natomiast włączają inne, wcześniejsze cechy, w tym klonalne plazmocyty w szpiku kostnym 60% oraz stosunek wolnych lekkich łańcuchów zaangażowanych/niezaangażowanych w proces nowotworowy (involved/uninvoled) [3] (tab. I). Pomimo postępu metodycznego elektroforeza białek surowicy jest nadal badaniem pierwszego rzutu i wykorzystywana jest głównie razem z oznaczeniem sflc jako badanie wstępne. Może służyć do monitorowania przebiegu choroby poprzez ocenę wielkości piku w proteinogramie zarówno pacjentów nieleczonych (MGUS) jak i pacjentów w trakcie leczenia oraz w okresie remisji po przeszczepie szpiku (dotyczy to chorych z białkiem monoklonalnym w klasie IgG i IgM). Dodatkowo ocena elektroforetyczna białek surowicy frakcji gammaglobulin dostarcza informacji na temat odporności organizmu. Wraz z postępem choroby stopniowo dochodzi do spadku produkcji prawidłowych immunoglobulin poliklonalnych, co sprzyja rozwojowi zakażeń, które są główną przyczyną zgonów w szpiczaku plazmocytowym [10]. Proteinogram ma również ograniczenia, można nie obser- 50

Diagn Lab 2015; 51(1): 43-52 Tabela I. Kryteria rozpoznania szpiczaka plazmocytowego według Międzynarodowej Grupy Roboczej ds. Szpiczaka Mnogiego (IMWG) 2014. Klonalne plazmocyty w aspiracji szpiku kostnego 10% i jedna lub więcej cech: uszkodzenie narządów (CRAB) C hiperkalcemia: stężenie wapnia powyżej górnej granicy >0,25 mmol/l (1 mg/dl) lub >2,75 mmol/l (>11 mg/dl) R uszkodzenie nerek: egfr <40 ml/min/1,73m 2 lub stężenie kreatyniny >177 umol/l (>2 mg/dl), A niedokrwistość: stężenie hemoglobiny >2 g/dl poniżej dolnej granicy lub <10 g/dl, B zmiany w kościach: jedna lub więcej w radiologicznym badaniu, CT lub PET-CT jedna lub więcej cech: klonalne plazmocyty w szpiku kostnym 60% stosunek wolnych lekkich łańcuchów zaangażowanych/niezaangażowanych w proces nowotworowy w surowicy 100 (sflc) więcej niż jednoogniskowa zmiana uwidoczniona w MRI, która ma co najmniej 5 mm lub więcej. wować dodatkowych prążków kiedy stężenie krążącego białka monoklonalnego jest niewielkie (MGUS, amyloidoza AL, choroba lekkiego łańcucha, szpiczak niewydzielający, izolowany szpiczak kości i forma pozaszpikowa), dlatego też pomocne jest oznaczanie sflc. Do oceny odpowiedzi na leczenie wykorzystywane jest wyliczenie dflc (difference between involved and uninvolved FLCs), czyli różnicy pomiędzy łańcuchem zaangażowanym i niezaangażowanym w proces nowotworowy [17]. Wyniki podane na rycinach odnoszono do stosowanych w Laboratorium Centralnym zakresów referencyjnych: OB <12mm/1h, Hb 12,00-16,00 g/dl, kreatynina 0,50-1,10 mg/dl, egfr >60 ml/min/1,73m 2, białko całkowite 6,2-8,2 g/dl] Ca 2,15-2,60 mmol/l, LDH 135-225 U/I, CRP 0-10 mg/l, IgA 70-400 mg/dl, IgG 700-1600 mg/dl, IgM 40-240 mg/dl, beta 2-mikroglobulina 0,81-2,19 mg/l, k 3,30-19,40 mg/l, l 5,71-26,30 mg/l, k/l 0,26-1,65, k/l 0,31-3,10 w chorobach nerek białko w moczu [wynik ujemny]. Piśmiennictwo: 1. Dmoszyńska A, Walter-Croneck A, Mańko J i wsp. Zalecenia Polskiej Grupy Szpiczakowej dotyczące rozpoznawania i leczenia szpiczaka plazmocytowego na rok 2012. Acta Haematol Pol 2012; 43: 7-53. 2. Ludwig H, Miguel JS, Dimopoulos MA et, al. International Myeloma Working Group recommendations for global myeloma care. Leukemia 2014; 28: 981-992. 3. Rajkumar SV, Dimopoulos MA, Palumbo A, et al. International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. Lancet Oncol 2014; 15: e538-e548. 4. Walewski J. Epidemiologia i patogeneza. In: Domszyńska A. Szpiczak mnogi. Najnowsze metody rozpoznawania i leczenia. ANmedia Wydawnictwo, Warszawa 2009; 23-29. 5. Jurczyszyn A, Zaucha J M, Machaczka M i wsp. Niezbędne wymogi diagnostyczne i zalecenia terapeutyczne w szpiczaku plazmocytowym. Przeg Lek 2013; 70: 1-10. 6. Jędrzejczak W. Gammapatia monoklonalna o nieustalonym znaczeniu i inne dyskrazje plazmocytowe. In: Domszyńska A. Szpiczak mnogi. Najnowsze metody rozpoznawania i leczenia. ANmedia Wydawnictwo, Warszawa 2009; 161-170. 7. Jenner E. Serum free light chains In clinical laboratory diagnostics. Clin Chim Acta 2014; 427: 5-20. 8. Katzmann JA, Kyle RA, Benson, J et al. Screening panels for detection of monoclonal gammopathies. Clin Chem 2009; 55: 1517-1522. 9. Charliński G, Jurczyszyn A, Jędrzejczak W. Pierwotna, układowa amyloidoza łańcuchów lekkich objawy kliniczne, aktualna diagnostyka i leczenie. Przeg Lek 2014; 71: 102-109. 10. Drożdż R. Zaburzenia białkowe u chorych ze szpiczakiem rola oznaczania wolnych łańcuchów lekkich w surowicy. In: Jurczyszyn A, Skotnicki AB. Szpiczak mnogi kompleksowa diagnostyka i terapia. Fundacja Centrum Leczenia Szpiczaka, Kraków 2010; 1: 56-69. 11. Nair B. Nonsecretory multiple myeloma. 2011; www.meylomabeacon.com. 12. Grząśko N. Szpiczak odosobniony i inne rzadkie postacie szpiczaka. In: Dmoszyńska A. Szpiczak mnogi. Najnowsze metody rozpoznawania i leczenia. ANmedia Wydawnictwo, Warszawa 2009; 145-159. 13. Pandey S, Kyle R. Unusual Myelomas: A Review of IgD and IgE Variants. Oncology 2013; 27: 798-803. 14. Oza A, Rajkumar SV. Waldenstrom macroglobulinemia: prognosis and management. Blood Cancer J 2015; DOI:10.1038/BCJ.2015.28. 15. Usnarska-Zubkiewicz L, Hołoda J, Kuliczkowski K. Wolne łańcuchy lekkie w surowicy znaczenie diagnostyczne i prognostyczne w dyskrazjach plazmocytowych. Acta Heamatol Pol 2009; 40: 349-361. 16. Książek A, Załuska W. Krioglobulinemia. Nefrol Dial Pol 2008; 12: 102-103. 17. Guidelines for use of serum free light chain assays. 2013, chapter 25; www. wikilite.com. Adres do korespondencji: mgr Anna Rodziewicz-Lurzyńska Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny Laboratorium Centralne 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1a Tel. +48 22 5991162 e-mail: rodziewicz.a@gmail.com Zaakceptowano do publikacji: 03.04.2015 51

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 52