Ćwiczenie 30 Metodyka poprawnych i dokładnych pomiarów absorbancji w zakresie UV- VS, wyznaczenie małych wartości absorbancji. Czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wartości absorbancji dla wybranych długości fali. Zagadnienia: spektroskopia absorpcyjna w zakresie UV-VS, prawa absorpcji, budowa i działanie spektrofotometru, czynniki wpływające na mierzone widma absorpcji i wyznaczane wartości absorbancji, dobór warunków dla pomiaru widm absorpcji i wyznaczania poprawnych wartości absorbancji, błędy przypadkowe i systematyczne w pomiarach absorbancji. Wstęp Praktycznie wszystkie związki chemiczne niezależnie w jakiej postaci występują (monomerów, dimerów, większych agregatów, czy też kompleksów) absorbują w zakresie UV, λ=185-220 nm. Ogromna większość związków absorbuje także w zakresie bardziej długofalowym, 300>λ>220 nm, zaś bardzo wiele z nich również w zakresie widzialnym λ 350 nm. Dlatego obecność tych związków można stwierdzić, jak i wyznaczyć ich stężenie mierząc widma absorpcji w zakresie UV-VS. Spektroskopia UV-VS należy do najczulszych metod eksperymentalnych, obok spektroskopii emisyjnej i spektrometrii mas. Z powyższych względów jest ona bardzo powszechnie stosowana w badaniach podstawowych oraz licznych zastosowaniach analitycznych w tym praktycznych, tak w badaniach jakościowych jak i ilościowych. Do pomiaru widm absorpcji stosuje się spektrofotometry pracujące najczęściej w zakresie spektralnym λ=200-800 nm (ν=50000-12500 cm -1 ). Korzystając z nich można wykonywać także pomiary w zakresie ultrafioletu próżniowego, =175-200 nm, (ν-57140-50000 cm -1 ) przedmuchując komorę, w której znajdują się kuwety z próbkami gazowym azotem. Możliwe są też pomiary w zakresie bliskiej podczerwieni (NR) do 4000 nm (ν-2500 cm -1 ), sięgającym aż do zakresu spektralnego, w którym stosuje się spektrometry R i Ramana. 1
Ze względu na przywołane wyżej niezwykle cenne zalety, spektroskopia UV-VS jest zdecydowanie najczęściej stosowana spośród wszystkich istniejących metod do detekcji w metodzie HPLC, niezastąpionej metodzie badawczej i analitycznej. Praktycznie wszystkie chromatografy cieczowe, tak HPLC jak i UPLC, stosują spektrofotometrymetry UV-VS jako podstawowe, a nierzadko jedyne detektory. Część teoretyczna. Absorbancję próbki, w której absorbuje jeden związek opisuje ilościowo prawo Lamberta- Beera, (równanie 1): absorbancja skolimowanej wiązki monochromatycznego promieniowania w jednorodnym, izotropowym ośrodku jest proporcjonalna do wartości molowego współczynnika absorpcji (mol -1. cm -1. dm 3 ) i do stężenia c (mol. dm -3 ) badanego związku oraz do długości drogi optycznej (l), na której zachodzi absorpcja. Wartość ε(λ), która zależy od długości fali, charakteryzuje własności absorpcyjne każdego związku. Ta zależność jest faktycznie widmem absorpcji. Wartość molowego współczynnika absorpcji w zależności od typu przejścia ( *, n *, *, itp.) może zmieniać się w bardzo szerokim zakresie, od wartości niewiele większych od zera (np. ε = 10-2 mol -1 dm 3 cm -1, na długofalowym ogonie pasma absorpcji), aż do wartości ~ 10 6 mol -1 dm 3 cm -1, dla przejść w pełni dozwolonych. Jeśli w próbce badany związek występuje w postaci tylko jednego indywiduum (najczęściej pojedyńczych cząsteczek badanego związku), to wartość ε(λ) nie zależy od stężenia. Absorbancję próbki, w której absorbuje więcej niż jeden związek opisuje prawo addytywności absorbancji, (równanie 2). A c l (1) A A1 A2 A3 A i (2) Eksperymentalnie wartość absorbancji A, zgodnie z równaniem (3) jest wyznaczana w oparciu o pomiar intensywności światła przepuszczonego (transmitowanego) przez kuwetę z badanym roztworem, T, które dotarło do detektora. Jest nim najczęściej fotopowielacz. 2
A o log logt (3) T gdzie 0 - intensywność światła padającego na próbkę Niezależnie od tego czy pomiar absorbancji odbywa się w spektrofotometrze dwuwiązkowym (jednoczesny pomiar dla próbki i dla odnośnika) czy też jednowiązkowym (kolejno pomiar dla próbki i dla odnośnika) przyjmuje się, że spełnione jest równanie 4. T 0 abs (4) zaś A (1 10 ) (5) abs 0 abs -liczba kwantów zaabsorbowanych przez badany związek, wyznaczona z równania 5 lub z pomiarów aktynometrycznych, W pomiarach widm absorpcji, WA, wpływ na wartość T obok absorpcji promieniowania przez próbkę mają także: odbicie światła ( odb ) na przedniej i tylnej ścianie kuwety z badanym roztworem, absorpcja tego światła przez samą kuwetę ( a-k ), rozpraszanie światła w rozworze ( rozp ), a także absorpcja światła przez rozpuszczalnik ( a-r ) i ewentualne zanieczyszczenia w nim obecne ( a-z ). Tak więc, w rzeczywistych pomiarach absorbancji wartość T opisuje równanie 6. T = 0 - abs -( odb + rozp + a-k + a-r + a-z ) (6) Aby równanie 4 było spełnione wszystkie wielkości w równaniu 6 oprócz abs muszą być takie same dla próbki i dla odnośnika. Tylko w takich warunkach spełnione jest równanie Lamberta-Beera, a zmierzone wartości A( ) zależą wyłącznie od absorpcji badanego związku. W pomiarach WA rzeczywiste wartości poszczególnych wielkości w równaniu 6 dla próbki i odnośnika są z reguły różne. Ta różnica powoduje systematyczne błędy w pomiarach absorbancji. Mogą one być rzędu ΔA ~ 10-2 i większe, zaś w zakresie krótkofalowym (λ < 250 nm) mogą być równe ΔA ~ 10-1. Możliwe jest jednak wyeliminowanie tych różnic dzięki zastosowaniu odpowiedniej metodyki pomiarów i uwzględnieniu wyznaczonych poprawek. 3
Wyznaczanie błędu pomiaru absorbancji stosowanego spektrofotometru UV-VS. Proste spektrofotometry UV-VS mierzą najczęściej WA, czy też A(λ), z błędem ΔA = ±1x10-3. Dobrej klasy spektrofotometry, np. stosowany do wykonywania tego ćwiczenia mierzy absorbancję z błędem ΔA = ±1x10-4, zaś spektrometry fotodiodowe, stosowane jako detektory w aparatch HPLC i UPLC, mierzą absorbancję z bardzo małym błędem ΔA = ±(1-2)x10-5. Wartości ΔA dla każdego spektrofotometru wyznacza się korzystając z wyników pomiaru absorbancji, gdy w komorze pomiarowej nie ma kuwet (pomiar tzw. linii zerowej). Gdy WA wykreśla się w zakresie małych wartości A (najczęściej A 1 x 10-2 ), to wartość ΔA dla dowolnej długości fali można wprost wyznaczyć z szerokości lini zerowej spektrofotometru. Najmniejsze wartości A dla badanej próbki, które można mierzyć na danym spektrofotometrze muszą być co najmniej 2 razy większe od błędu pomiaru absorbancji na tym aparacie tj. A / ΔA 2. Dla każdej metody badawczej stosunek S / N 2, gdzie S - wielkość mierzonego sygnału (signal), N-wielkość szumów (noise), określa najmniejszą wartość, która może być zmierzona na danym aparacie. Korzystając z dobrej klasy spektrofotometrów UV-VS, dla których ΔA=±1x10-4 można mierzyć WA i A(λ) dla próbek, których absorbancja jest bardzo mała. Gdy mierzona A(λ) = 1x10-3 to błąd wyznaczonej absorbancji wynikający wprost z wartości ΔA dla danego aparatu wynosi ΔA / A = 0.1, tj. 10%; gdy A(λ) = 1 x 10-2, a ΔA = ±1x10-4, to błąd pomiaru wynosi zaledwie 1%. Poprawny pomiar absorbancji (A) ma bezpośredni wpływ na błąd wyznaczanych wartości molowego współczynnika absorpcji (równanie 8). A c l (7) A c (8) l (równanie 7) i stężenia badanego związku w próbce c 4
Zastosowania spektroskopii UV-VS. Spektroskopię UV-VS jest podstawową metodą analityczną, dokładną i "szybką". Stosuje się ją bardzo często do badania przebiegu reakcji chemicznych i fotochemicznych. Ponadto przed wykonaniem badań metodą spektroskopii emisyjnej, zarówno stacjonarnej jak i rozdzielczej w czasie, konieczny jest najpierw pomiar widm absorpcji (WA) badanych związków czy też ich mieszanin, w odpowiednio dobranym rozpuszczalniku. Pomiar ten należy wykonać, przede wszystkim w celu wyboru odpowiednich długości fali promieniowania wzbudzającego dla mierzonego widma emisji. W celu wyznaczenia wydajności kwantowej emisji (Φ E ), równanie 9 oraz zaniku fotochemicznego (Φ FOT ), równanie 10, badanych związków oraz wydajności kwantowej tworzenia fotoproduktów, konieczny jest także pomiar WA, a przynajmniej pomiar wartości absorbancji dla wybranych długości fali. E FOT E abs c abs (9) (10) gdzie: E -liczba kwantów emitowanych przez badany związek, c-liczba cząsteczek badanego związku, które zaniknęły w reakcji fotochemicznej. W najbardziej uniwersalnej metodzie HPLC powszechnie stosowane są detektory UV-VS, które pozwalają na pomiar absorbancji przy wybranych długościach fali z zakresu ultrafioletu i części widzialnej, a nawet na pomiar całego widma absorpcji. Dzięki temu są one wykorzystywane do identyfikacji związków znajdujących się w badanej mieszaninie oraz do wyznaczenia ich stężenia. Dokładny pomiar absorbancji. W wymienionych wyżej zastosowaniach spektroskopii absorpcyjnej UV-VS, a także szeregu innych jej zastosowaniach, konieczny jest bardzo dokładny pomiar wartości A. Często są to małe wartości absorbancji, A<0.1, a nawet A 10-2. Przyczyną tego, że wartości A są małe, mogą być małe wartości molowego współczynnika absorpcji, konieczność użycia małych stężeń, (ze względu na łatwość tworzenia dimerów, a nawet oligomerów, np. dla porfiryn, 5
ftalocyjanin i wielu barwników oraz ich pochodnych), słaba rozpuszczalność badanych związków, a także ich wysoki koszt. lościowe pomiary widm absorbcji w szerokim zakresie stężeń, także wartości A(λ), dla wybranych długości fali są wykorzystywane do badania tworzenia dimerów i wyższych merów, oraz kompleksów z rozpuszczalnikiem, czy też z odpowiednio dobranym związkiem (wygaszaczem, sensybilizatorem, surfaktantem, cyklodekstryną, itp.), w których mierzone są bardzo małe wartości A. Wiarygodny i powtarzalny pomiar małych wartości A z błędem poniżej 10% (często 1-2%) jest możliwy. Wymaga on jednak poznania rzeczywistych możliwości pomiarowych stosowanego spektrofotometru (wyznaczenia wartości ΔA) i jego kalibracji (wartości A i λ). Wartość ΔA zależy istotnie od wyboru właściwych parametrów pomiaru. Koniecznym warunkiem aby można mierzyć wiarygodne WA dla próbek o bardzo małych wartościach A(λ) jest także zastosowanie odpowiedniej metodyki ilościowych pomiarów absorbancji i wyeliminowanie tych czynników które obok rzeczywistej absorbcji mogą istotnie wpływać na mierzoną wartość A (patrz równanie 6). Dzięki temu, że możliwe są poprawne i dokładne pomiary bardzo małych wartości absorbancji, A ~ 10-2, można wyznaczać bardzo małe stężenia badanych związków i małe wartości ε(λ), ~10-1 mol -1 dm 3 cm -1. Dla ilustracji dla związku, dla którego ε(λ max ) = 5 x 10 4 mol -1 dm 3 cm -1, a droga optyczna użytej kuwety (4) wynosi L = 1cm, wartość A(λ) max = 1x10-2 otrzyma się gdy jego stężenie jest bardzo małe i wynosi c = 2x10-7 mol/dm 3 (A = 5x10 4 x4x10-6 x1). Natomiast najmniejsze stężenie tego związku, które możemy wyznaczyć (z błędem ~10%)gdy stosujemy spektrofotometr dla którego ΔA = 1 x 10-4, a l=5cm wynosi zaledwie 8x10-9 mol/dm 3, (c = 2x10-3 / 5x10 4 x 5 = 8x10-9 mol/dm 3 ). Cele ćwiczenia Pierwszym celem ćwiczenia jest przeprowadzenie pomiarów WA, które pozwolą stwierdzić jakie czynniki oprócz absorpcji światła przez badany związek (równanie 6) mają wpływ na mierzone WA i na wyznaczoną dla wybranych długości fali wartość absorbancji A(λ).. Aby ten cel zrealizować konieczne będzie stwierdzenie jaki wpływ na WA i wartości A(λ) mają: -odbicie i rozpraszanie światła, -absorbcja światła przez rozpuszczalnik, 6
-parametry stosowanego spektrofotometru, a szczególnie zmiana jego czułość w trakcie pomiarów WA. Wykonanie WA za pomocą jednowiązkowego spektrofotometru oddzielnie w obu kuwetach stosowanych dla próbki i odnośnika oraz rozpuszczalnika i roztworu badanego związku (w tym rozpuszczalniku) w obu kuwetach pozwoli wyznaczyć różnice między nimi, dotyczące absorpcji i odbicia światła przez nie oraz różnice ich grubości. Drugim celem ćwiczenia jest poprawne i bardzo dokładne wyznaczenie wartości A(λ) dla wybranych długości fali, a na tej podstawie stwierdzenie jakie najmniejsze wartości absorbancji można wiarygodnie wyznaczyć stosując jednowiązkowy spektrofotometr SP 8001 (Metertech nc.). Należy podkreślić, że aby wyznaczyć poprawne i dokładne WA i wartości A(λ) konieczne jest zarówno wyeliminowanie wpływu innych zjawisk niż absorpcja światła na wartość mierzonej absorbancji (Ćwiczenie 30), jak i dobranie odpowiednich parametrów pomiaru WA (Ćwiczenie 31) na stosowanych w obu ćwiczeniach spektrofotometrach. Część eksperymentalna Pomiary widm absorpcji będą wykonane na spektrofotometrze dwuwiązkowymv-550 (Jasco) lub jednowiązkowym SP-8001 (Metertech nc.). Schemat optyczny spektrofotometru V-550 podany jest na Rys. 1. Rys.1 Schemat dwuwiązkowego spektrofotometru UV-VS na przykładzie V-550 (Jasco). 7
Badany będzie roztwór benzofenonu w metanolu o wartości absorbancji w maximum długofalowego pasma absorpcji w zakresie A=0.1-1.5. Stosowane będą kuwety kwarcowe o drodze optycznej L- 1cm. Wartości A dla wszystkich zmierzonych WA będą wyznaczane dla następujących długości fali : -w maksimach pasm absorpcji, -dla kilku (2-4) długości fali, dla których wartości A(λ) wyraźnie się różnią, (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie), w tym dla długości fali, dla której A(λ)~10-2, -w zakresie długofalowym, w którym nie absorbuje badany związek (2-3 długości fali). Dobór warunków pomiaru WA, (ustalonych z prowadzącym ćwiczenie), należy określić korzystając z załączonego WA badanego związku (pkt. 3) wykonanego w warunkach standardowych: szczelina 1,2-1nm, krok pomiarowy 1nm, czasu pomiaru absorbancji dla jednej długości fali 0.25s, (fast). W celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników pomiarów WA, należy brać pod uwagę kształt WA, wyznaczone wartości A oraz kształt i położenie linii zerowej w zakresie długofalowym, gdzie nie absorbuje badany związek. Na tej podstawie należy określić: -zakres spektralny, w którym mierzone będą WA, -szerokość szczeliny w spektrofotometrze, -krok pomiaru, tj. odległość pomiędzy kolejnymi wartościami, dla których mierzone będą wartości A, -czas pomiaru (czas integracji) wartości A dla jednej długości fali. W wyborze optymalnych parametrów pomiarowych dla spektrofotometru V-550 (Jasco) i SP- 8001 (Metertech nc.), można kierować się danymi zawartymi w Tabeli na stronie 5 Metodyki pomiarów WA. Specyfikacja najważniejszych parametrów pomiarowych spektrofotometru SP-8001 znajduje się przy aparacie. Wykonanie ćwiczenia W ramach ćwiczenia należy zmierzyć kolejno: 1. linię bazową spektrofotometru, 2. linię zerową spektrofotometru, 8
3. WA roztworu badanego związku względem pustej kuwety mierzone w standardowych warunkach, o ile to WA nie będzie dołączone do ćwiczenia. Przed wykonaniem dalszych pomiarów (4-15) ustalić z prowadzącym ćwiczenie warunki pomiarów, w szczególności zakres spektralny, w którym mierzone będą WA oraz długości fali, dla których będą wyznaczane wartości A(λ) Pomiary jakie należy wykonać, aby zrealizować pierwszy cel Ćwiczenia: 4. WA pustej kuwety, która będzie użyta dla próbki, 5. WA pustej kuwety próbki, która będzie użyta dla odnośnika, 6. WA rozpuszczalnika w kuwecie próbki, 7. powtórzyć pomiar 2, 8. WA rozpuszczalnika w kuwecie odnośnika, Pomiary jakie należy wykonać, aby zrealizować drugi cel Ćwiczenia: 9. powtórzyć pomiar 6, 10. powtórzyć pomiar 2, 11. powtórzyć pomiar 6 12. WA badanego związku w kuwecie próbki, 13. powtórzyć pomiar 12, 14. powtórzyć pomiar 2, 15. powtórzyć pomiar 12, stosując dłuższy (o2-5 razy) czas pomiaru A(λ) Aby zbadać wpływ rozpraszania światła na WA i wyznaczane wartości A badanego związku należy wykonać pomiary: 16. WA rozpuszczalnika w kuwecie odnośnika z dodanym związkiem rozpraszającym światło, nie absorbującym w zakresie UV-VS, 17. jak 16 ale z większą zawartością związku rozpraszającego światło, 18. WA badanego związku w kuwecie próbki z dodanym związkiem rozpraszającym światło. Opracowanie wyników. Biorąc pod uwagę cele ćwiczenia, dla ustalonych długości fali, (patrz wyżej), należy wyznaczyć rzeczywiste wartości A, dla wybranych długości fali, dla których mierzono A(λ), pomiary 4-18. W tym celu skorzystać ze zmierzonych wartości A(λ) w ramach pomiarów 4-18. 9
Wyznaczyć także wartości A dla wybranych długości fali, które określają: a. błąd pomiaru absorbancji stosowanego spektrofotometru (pkt 2, 7 i 14), b. wkład absorpcji i odbicia światła przez kuwetę stosowaną dla próbki (pkt 4), c. wkład absorpcji i odbicia światła przez kuwetę stosowaną dla odnośnika (pkt 5), d. różnicę absorpcji i odbicia światła między kuwetą stosowaną dla próbki i dla odnośnika (pkt 4 i pkt. 5), e. absorpcję światła pochodząca od rozpuszczalnika w kuwecie próbki (pkt. 6), f. absorpcję światła pochodząca od rozpuszczalnika w kuwecie odnośnika (pkt. 8), g. różnicę absorpcji światła przez rozpuszczalnik w kuwecie próbki i kuwecie odnośnika (pkt. 6 i pkt. 8), h. zmianę czułości spektrofotometru porównując wartości A (pkt 2 i pkt. 7) W celu bardzo dokładnego wyznaczenia wartości A i A dla pkt. 4 i 5 oraz pkt. 6 i 8 należy uwzględnić wyniki pkt. 2 i 7, i. wyznaczyć wartość A dla rozpuszczalnika A(rozp) w kuwecie próbki z pomiarów 6, 9 i 11 uwzględniając ewentualne zmiany czułości spektrofotometru (pkt.7 i 10), a korzystając z tak obliczonych wartości A obliczyć średnią wartość A śrd (rozp), j. wyznaczyć wartość A dla próbki z pomiarów 12,13 i 15, uwzględniając ewentualne zmiany czułości spektrofotometru (pkt.10 i 14), korzystając z tak obliczonych wartości A obliczyć średnią wartość absorbancji badanego związku; A śrd (BZ), k. wyznaczyć rzeczywiste wartości A dla badanego związku z relacji A = A śrd (BZ)- A śrd (rozp), l. wyznaczyć zmianę czułości spektrofotometru w krótszych okresach czasu porównując wartości A wyznaczone w (pkt. 2 i 7, pkt. 7 i 10, pkt. 10 i 14) oraz w dłuższym okresie czasu (pkt. 2 i 14). Dyskusja wyników W oparciu o pkt. a podać jakie najmniejsze wartości A(λ) można mierzyć na stosowanym spektrofotometrze, pamiętając, że S/N 2. W oparciu o pkty. b-h skomentować różnice wartości A(λ) pustych kuwet próbki i odnośnika oraz wypełnionych rozpuszczalnikiem. Powiązać te różnice z różnym odbiciem i absorpcją światła przez obie kuwety i różną absorpcją światła przez rozpuszczalnik w obu kuwetach. 10
W oparciu o pkt. i-k wyznaczyć różnice między średnią wartością A śrd (λ )i wartościami A(λ) pojedynczych pomiarów dla rozpuszczalnika i dla próbki. Wyznaczyć błąd (w %) wyznaczonej wartości A(λ) dla BZ dla kilku λ, dla których A(λ) ~ 0.2-1.0, A(λ) ~ 0.05-0.1, A(λ) ~ 0.01-0.02. Literatura: [1]-Materiały dotyczące spektroskopii absorpcyjnej dostępne w internecie na stronie http://www.staff.amu.edu.pl/~iwonam/student.htm, [2]-Zbigniew Kęcki, Podstawy spektroskopii molekularnej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998, [3]-Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997, [4]-P. W. Atkins, Podstawy chemii fizycznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999, 11