RZDZIAŁ 6 ZITEGRWAA METDA KALIBRACYJA WE PDEJŚCIE W ZAKRESIE AALIZY RUTYWEJ Paweł Kościelniak Zakład Chemii Analitycznej, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, ul. R. Ingardena 3, 30-060 Kraków 1. WPRWADZEIE W odróżnieniu od roli i zadań przedstawicieli wielu dyscyplin i dziedzin naukowych zasadnicze zadania, jakie ma to spełnienia chemik-analityk są jasno sprecyzowane. Sprowadzają się one do określenia: jaka substancja (analit) jest ukryta w badanym materiale (próbce) oraz jaka jest ilość analitu w próbce. To drugie zadanie należące do zakresu tzw. analizy ilościowej jest z natury rzeczy trudniejsze od pierwszego, bowiem określenie ilości analitu (czyli jego oznaczenie) jest uwarunkowane znajomością rodzaju tej substancji. Głównymi parametrami określającymi jakość wyników analitycznych są przede precyzja i dokładność. Precyzja jest miarą zgodności oszacowań wyniku analitycznego w cyklu oznaczeń wykonywanych w określonych warunkach doświadczalnych, a dokładność miarą zgodności wyniku analitycznego z rzeczywistą zawartością analitu w próbce, czyli z tzw. wynikiem prawdziwym. Dokładność jest zatem bezpośrednią oceną poprawności pracy analityka i w tym świetle jest to parametr o pierwszorzędnym znaczeniu. Wyznaczenie dokładności wyniku analitycznego z definicji wymaga znajomości wyniku prawdziwego. Jest jednak rzeczą oczywistą, że gdyby ta wartość była znana, to wyznaczanie dokładności mijałaby się z celem. Jest to podstawowy paradoks chemii analitycznej. Ścisłe wyznaczenie dokładności nie jest możliwe również z tego prostego powodu, że niemożliwe jest idealnie dokładne wyznaczenie zawartości analitu w próbce. Każda analiza oparta jest na pomiarach fizykochemicznych wykonywanych za pomocą odpowiednich instrumentów pomiarowych. Pomiary te obarczone są błędami, wynikającymi choćby z technicznych uwarunkowań pracy stosowanych instrumentów, a błędy te przenoszą się na błędy analityczne. Podstawowym dylematem analityka jest zatem to, że tak istotny parametr analityczny, jakim jest dokładność uzyskiwanych wyników, nie podlega ścisłej ocenie. Każde podejście stosowane w tym celu z góry skazane jest na niepowodzenie. Z drugiej strony podejmowanie takich prób jest konieczne, choćby tylko z tego powodu, by analityk mógł kontrolować jakość stosowanych przez siebie metod i instrumentów, a także weryfikować swoją wiedzę i umiejętności analityczne. 2. BŁĘDY SYSTEMATYCZE Dokładność oznaczenia jest uwarunkowana głównie błędami systematycznymi popełnianymi w trakcie wykonywania analizy. Pełna procedura analityczna składa się zwykle z kilku etapów, z których najważniejsze to: pobranie reprezentatywnej próbki, przeprowadzenie jej do odpowiedniego stanu skupienia, ustalenie jej właściwości fizykochemicznych i przeprowadzenie kalibracji analitycznej wraz z wykonaniem
pomiarów. a wszystkich tych etapach można popełnić błędy systematyczne, które sumując się rzutują na dokładność wyniku analitycznego. Próbka pobierana do analizy powinna być reprezentatywna, tzn. jej właściwości chemiczne i fizykochemiczne powinny być takie same, jak właściwości całej partii materiału, z którego jest pobierana. ajbardziej istotne jest oczywiście to, by próbka miała reprezentatywny skład chemiczny, ale ważne jest również (o czym często się zapomina), by odznaczała się np. odpowiednią gęstością i lepkością (w przypadku analizy cieczy), czy też np. prawidłową morfologią i uziarnieniem (w przypadku analizy próbek ciał stałych). a etapach przeprowadzenia próbki do odpowiedniej postaci (zwykle do postaci roztworu ciekłego) i dostosowaniu jej właściwości fizykochemicznych do pomiaru można popełnić błędy powodujące ogólnie bądź utratę pewnej części analitu, bądź wprowadzenie go do próbki w pewnej niekontrolowanej ilości. Utrata analitu jest nieodłącznym elementem takich procesów, jak np. mineralizacja próbki, wzbogacania anlitów, czy też maskowanie lub rozdzielanie jej składników. Z drugiej strony, im większa jest liczba i ilość odczynników potrzebnych do wykonania powyższych zabiegów, tym większe jest ryzyko wprowadzenia do próbki analitu stanowiącego zanieczyszczenie tych odczynników. Początkowe etapy procedury analitycznej stanowią elementy określonej, ściśle ustalonej metody analitycznej, której przestrzeganie zapewnia ustalenie optymalnych warunków doświadczalnych dla wykonania pomiarów. Błędy popełnione na tych etapach można więc nazwać błędami metody analitycznej [1]. iemal każda metoda analityczna wymaga przeprowadzenia tzw. kalibracji. Celem kalibracji jest wyznaczenie wyniku analitycznego na podstawie tzw. zależności kalibracyjnej, czyli zależności między sygnałem analitycznym a stężeniem analitu. Zależność tę odwzorowuje się w postaci wykresu kalibracyjnego, który konstruuje się zwykle w sposób doświadczalny za pomocą próbek wzorcowych (najczęściej w postaci roztworów). Błędy systematyczne popełniane na etapie kalibracji wynikają z błędnego odwzorowania zależności kalibracyjnej; można je zatem nazwać błędami kalibracyjnymi. Istnieją dwa główne źródła błędów kalibracyjnych: efekt nieliniowości zależności kalibracyjnej i efekt interferencyjny [2]. Błędy pochodzące z pierwszego źródła ujawniają się najczęściej wtedy, gdy nieliniowa zależność kalibracyjna jest odwzorowywana w postaci wykresu liniowego. Błędy wynikające z efektu interferencyjnego popełnia się w takiej sytuacji, gdy wykres kalibracyjny nie uwzględnia wpływu substancji towarzyszących analitowi w próbce (interferentów) na sygnał analityczny mierzony dla analitu. Uniknięcie błędów kalibracyjnych zależy zatem w dużej mierze od stopnia znajomości zależności kalibracyjnej i od przyjęcia na etapie kalibracji właściwej strategii, zapewniającej prawidłowe odwzorowanie tej zależności. a rysunku 1 przedstawiono schematycznie poszczególne etapy procedury analitycznej z zaznaczeniem typów błędów systematycznych, jakie można popełnić w trakcie jej realizacji 1. 1 W podziale tym nie uwzględniono błędów pochodzących z nieprawidłowego działania używanych instrumentów analitycznych, a także błędów osobowych analityka, które mogą być wynikiem jego pomyłki, niewiedzy, niedbałości lub celowego nieprawidłowego postępowania. 114
Pobranie próbki błędy metody błędy kalibracyjne adanie próbce odpowiedniego stanu skupienia Przygotowanie próbki do pomiaru Kalibracja analityczna zastosowanie różnych metod analitycznych zastosowanie materiału referencyjnego przyjęcie strategii kalibracyjnej Rys. 1. Błędy systematyczne popełniane w toku całej procedury analitycznej i sposoby ich weryfikacji 3. METDY WERYFIKACJI DKŁADŚCI WYIKÓW AALITYCZYCH Błędy analityczne są charakterystyczne dla określonego sposobu realizacji procedury analitycznej, obejmującego zastosowanie wybranej metody analizy wraz z przyjętą strategią kalibracyjną. Jest więc bardzo mało prawdopodobne, by wynik analityczny uzyskany dla określonej próbki po zastosowaniu dwóch lub większej liczby różnych metod analitycznych był obarczony błędami o jednakowej wartości i kierunku. Z tego powodu uzyskanie w takiej sytuacji statystycznie jednakowych wyników analitycznych daje niemal pewność, że średnia wartość tych wyników jest bardzo zbliżona do wartości prawdziwej, czyli jest bardzo dokładna. Wydaje się, że zastosowanie różnych metod analitycznych jest najpewniejszą drogą sprawdzenia dokładności wyniku analitycznego. Jest to jedyny sposób, który daje możliwość kontroli prawidłowości realizacji procedury analitycznej na wszystkich jej etapach (patrz rysunek 1). Im bardziej wybrane metody są różne od siebie, tzn. im bardziej różny jest sposób ich realizacji na poszczególnych etapach, tym bardziej dokonana weryfikacja jest wiarygodna. Z drugiej strony jest jednak oczywiste, że stosowanie dwóch lub kilku metod do analizy tych samych próbek wymaga znacznego nakładu pracy i czasu, a także wydatnie zwiększa koszty analizy. Bywa również tak, że badana substancja może być wiarygodnie oznaczana jedynie ściśle określoną, pojedynczą metodą analityczną, bądź też analityk po prostu nie ma do dyspozycji takich instrumentów pomiarowych, które są konieczne do realizacji różnych metod. Praktyczne wykorzystanie omawianego sposobu weryfikacji dokładności analitycznej jest więc w dużej mierze ograniczone. Aby ominąć powyższe trudności, różne metody analityczne stosuje się do analizy większych partii próbek, które są następnie udostępniane do powszechnego użytku. Próbki takie noszą nazwę materiałów odniesienia 2. Analizy wykonywane są zwykle 2 W pewnych wyjątkowych przypadkach materiały odniesienia otrzymuje się na drodze syntetycznej, tzn. poprzez łączenie poszczególnych składników w znanych ilościach, odpowiadających ich zawartościom w określonych próbkach. 115
w różnych laboratoriach i obejmują oznaczenia kilku lub nawet kilkunastu składników próbki. W rezultacie otrzymuje się produkt o składzie, który pod względem ilościowym jest wyznaczony dokładnie (w granicach określonego, dopuszczalnego błędu), a pod względem jakościowym reprezentuje dany rodzaj badanego materiału (np. gleby, tytoniu, krwi itp.). Weryfikacja dokładności analizy danej próbki o nieznanym składzie przy użyciu odpowiedniego materiału odniesienia polega na oznaczeniu analitów w obu próbkach tą samą metodą analityczną w jednakowych warunkach doświadczalnych. trzymanie oczekiwanych wyników analizy próbki materiału odniesienia świadczy o prawidłowości zastosowanego postępowania analitycznego i pozwala przyjąć, że składniki próbki o nieznanym składzie zostały również oznaczone z dużą dokładnością. Co więcej, użycie materiału odniesienia stwarza również możliwość ustalenia, jak bardzo otrzymane wyniki analityczne są niedokładne, tzn. w jakim stopniu odbiegają od wartości prawdziwych. ależy zauważyć, że prawidłowość weryfikacji dokładności analitycznej za pomocą określonego materiału odniesienia zależy w decydującej mierze od tego, na ile właściwości chemiczne i fizykochemiczne próbki są reprezentowane przez ten materiał. W przypadku próbek stałych duże znaczenie mogą mieć różnice w pewnych ich cechach fizycznych, takich jak stopień uziarnienia, gęstość itd. Decydującą rolę odgrywa jednak skład chemiczny materiału odniesienia i badanej próbki, który powinien być jednakowy pod względem jakościowym i zbliżony do siebie pod względem ilościowym. Waga tego problemu polega miedzy innymi na tym, że różna ilość składników towarzyszących analitowi w obu próbkach może wywoływać efekt interferencyjny o różnym nasileniu, co w konsekwencji uniemożliwi wiarygodne porównanie obu wyników analitycznych nawet wtedy, gdy zostały otrzymane przy zachowaniu identycznych warunków procedury analitycznej. Można zatem ogólnie stwierdzić, że użycie materiału odniesienia nie daje pewności pełnego uwzględnienia błędów systematycznych wywodzących się ze specyficznych właściwości chemicznych i fizykochemicznych próbki pobranej do analizy (patrz rysunek 1). Inna metodą, która jest dość często stosowana do sprawdzania dokładności wyników analitycznych (w szczególności w analizie materiałów biologicznych) jest tzw. metoda odzysku. Polega na tym, że określoną procedurę analityczną stosuje do analizy samej badanej próbki i do analizy tej samej próbki z dodatkiem znanej ilości analitu. Dokładność oznaczenia analitu w próbce określa się na podstawie porównania różnicy otrzymanych wyników analitycznych z dodaną ilością analitu. Udowodniono jednak, że metoda ta aczkolwiek stosunkowo prosta, szybka i tania jest w swojej zasadzie zawodna [3,4]. Główną przyczyną jest to, że analit dodany do próbki i analit zawarty w próbce w sposób naturalny mogą podlegać rozmaitym procesom zachodzącym w trakcie analizy zupełnie odmiennie. Efekt ten jest objawia się przede wszystkim wtedy, gdy analit zawarty w próbce znajduje się w środowisku złożonej matrycy i może przyjmować różne formy chemiczne (a paradoksalnie metoda odzysku właśnie w takich przypadkach jest najczęściej stosowana). pisane powyżej metody weryfikacji dokładności wyników analitycznych odnoszą się przede wszystkim do takich sytuacji, gdy analizy wymagają stosowania złożonych metod analitycznych, będących wtedy z natury rzeczy źródłem poważnych potencjalnych błędów systematycznych. W praktyce analitycznej bardzo często jest jednak tak, że metoda analityczna nie stwarza tak dużych trudności na etapie pobierania próbek, by ich reprezentatywność budziła wątpliwości, a na etapach przygotowania próbek do pomiaru nie wymaga skomplikowanych zabiegów chemicznych. awet 116
jednak w takich prostych przypadkach osobnym problemem pozostają błędy kalibracyjne, a w szczególności te, które wywodzą się z efektu interferencyjnego. Wpływ substancji towarzyszących analitowi w próbce na jego oznaczenie może zostać efektywnie wyeliminowany podczas przygotowania próbki do pomiaru (np. interferenty można oddzielić od analitu lub zneutralizować ich działanie innymi substancjami dodanymi do próbki), lecz zabiegi te nie zawsze przynoszą pożądany rezultat. Często również się zdarza, że analityk po prostu nie zdaje sobie sprawy o możliwości występowania efektu interferencyjnego lub też nie wie, które składniki próbki mogą ten efekt wywoływać 3. We wszystkich takich przypadkach nieodzownym sposobem eliminacji błędów wywodzących się z tych efektów jest przyjęcie odpowiedniej strategii na etapie kalibracji analitycznej. Chemia analityczna oferuje różne sposoby kalibracji prowadzące do eliminacji i minimalizacji efektów interferencyjnych [5]. ajprostszą i w wielu przypadkach bardzo skuteczną metodą tego typu jest tzw. konwencjonalna metoda ekstrapolacyjna (CEM) [5], znana powszechnie z literatury pod nazwą metoda dodatków wzorca. Pod względem proceduralnym jest ona bardzo podobna do metody odzysku [6], wymaga bowiem przygotowania i analizy próbki bez dodatku analitu i z dodatkiem (przynajmniej jednym) analitu o znanym stężeniu. Różni się od metody odzysku przede wszystkim tym, że stosowana jest w odniesieniu do próbki już przygotowanej do pomiaru, co w dużej mierze zapobiega odmiennemu zachowaniu się analitu zawartego w próbce i do niej dodanego. Dzięki temu, że w przypadku metody CEM analit znajduje się zawsze w obecności interferentów zawartych w próbce, efekt interferencyjny może zostać efektywnie skompensowany, a wynik analityczny (otrzymywany na drodze ekstrapolacyjnej) ma szansę być wolny od błędów wywodzących się z tego efektu. W praktyce analitycznej przyjmuje się, że wynik ten rzeczywiście jest dokładny i najczęściej nie sprawdza się tej dokładności przez zastosowanie dodatkowych zabiegów chemicznych, ani tym bardziej kalibracyjnych. ile zatem samą metodę CEM trudno traktować jako metodę weryfikującą dokładność oznaczenia analitycznego, o tyle połączenie jej z odmiennym podejściem kalibracyjnym może to zadanie spełnić. pierając się właśnie na takim założeniu opracowano koncepcję i sposób realizacji tzw. zintegrowanej metody kalibracyjnej (ICM) [7]. 4. ZITEGRWAA METDA KALIBRACYJA (ICM) Metoda ICM polega na integracji metody CEM i konwencjonalnej metody interpolacyjnej (CIM) [5] w pojedynczej procedurze kalibracyjnej. ajprostsza wersja procedury kalibracyjnej metody ICM składa się z następujących etapów: a) przygotowanie czterech roztworów: roztworu ślepej próby, roztworu wzorcowego (o znanym stężeniu analitu c w ), roztworu próbki (o nieznanym stężeniu analitu c 0 ) i roztworu próbki z dodatkiem roztworu wzorcowego (o łącznym stężeniu analitu c 0 + c w ), b) wykonanie pomiaru sygnałów analitycznych dla przygotowanych roztworów (odpowiednio R 0, R w, R x i R x+w ) w warunkach charakterystycznych dla analitu, 3 Autor pomija tutaj wcale nierzadko spotykane zjawisko ignorowania efektów interferencyjnych, które daje się zauważyć szczególnie wtedy, gdy zabiegi prowadzące do eliminacji tych efektów mogą w znaczny sposób utrudnić lub przedłużyć procedurę analityczną. 117
c) sporządzenie wykresów kalibracyjnych w sposób przedstawiony na rysunku2, d) wyznaczenie dwóch wyników analitycznych: na drodze ekstrapolacyjnej (c x1 ) i na drodze ekstrapolacyjnej (c x2 ), e) ocena statystyczna wyników pod kątem ich podobieństwa (z uwzględnieniem błędów przypadkowych). R R s+w b R w R x a R 0 c -c x2 0 c x1 c w Rys. 2. Graficzne przedstawienie zasady interpolacyjnej metody kalibracyjnej (ICM): wykresy kalibracyjne otrzymane z wykorzystaniem metod CIM (a) i CEM (b) służą do wyznaczenia stężenia analitu w próbce odpowiednio drogą interpolacyjną (c x1 ) i ekstrapolacyjną (c x2 ) Interpretując wyniki uzyskane za pomocą metody ICM zakłada się, że w przypadku występowania nieliniowej zależności kalibracyjnej i (lub) efektu interferencyjnego wynik otrzymany drogą interpolacyjną (c x1 ) jest obarczony błędem wynikającym z tego efektu w innym stopniu, niż wynik uzyskany drogą ekstrapolacyjną (c x2 ). Jeżeli więc oba wyniki analityczne są statystycznie różne od siebie, to można przypuszczać, że są obarczone błędami kalibracyjnymi i należy podjąć dodatkowe kroki zmierzające do ich eliminacji. W przeciwnym wypadku można sądzić o braku efektów kalibracyjnych i wtedy wartość średnia otrzymanych wyników może być traktowana jako dokładne oszacowanie stężenia analitu w próbce ((c x1 + c x2 )/2 c 0 ). Metoda ICM ma zatem w założeniu pełnić rolę strategii analitycznej, która pozwala na weryfikację dokładności wyników analitycznych uzależnionej od błędów kalibracyjnych (patrz rysunek 1). 5. UKŁADY ISTRUMETALE D KALIBRACJI ZA PMCĄ METDY ICM Podstawowa procedura kalibracyjna metody ICM może być rozszerzona w taki sposób, by możliwe było uzyskiwanie zarówno drogą interpolacyjną, jak i ekstrapolacyjną nie tylko dwóch wyników analitycznych [7,8], ale trzech lub nawet czterech [10-12]. Im jednak procedury są bardziej złożone, tym wymagają przygotowania większej liczby roztworów kalibracyjnych, co staje się żmudne i czasochłonne. Z tego powodu zaproponowano, by metodę ICM realizować stosując technikę przepływową [7]. pracowano kilka instrumentalnych układów przepływowych do realizacji metody ICM [7-12]. Trzy z nich przedstawiono schematycznie na rysunku 3. 118
Wszystkie one działają na podobnej zasadzie: a) za pomocą pomp do układów doprowadza się osobnymi przewodami trzy roztwory: roztwór ślepej próby pełniący rolę tzw. roztworu nośnego (), roztwór wzorca (W) i roztwór próbki (S), b) roztwory te dopływają ze ściśle określonymi prędkościami przepływu (p, q, r, s) do zaworu dwupozycyjnego (V), c) zawór kieruje dwa spośród czterech strumieni roztworów do dwóch przewodów (L 1 i L 2 ) o różnej długości; w jednej pozycji zaworu do przewodów dociera roztwór nośny, a w drugiej (tzn. po obrocie rotora o kąt 45 0 ) roztwory wzorca i próbki, d) roztwory płynące w przewodach L 1 i L 2 łączą się w przewodzie L 3 i dopływają do przyrządu pomiarowego (Det), e) przy odpowiednio dobranych prędkościach przepływu strumieni roztworów i długościach przewodów L 1 i L 2 roztwory dopływają do instrumentu w następującej postaci i kolejności: roztwór nośny (+), roztwór wzorca rozcieńczony za pomocą roztworu nośnego (W+), roztwór wzorca rozcieńczony za pomocą roztworu próbki (W+S) i roztwór próbki rozcieńczony za pomocą roztworu nośnego (S+). f) w pojedynczym cyklu kalibracyjnym mierzy się sygnały dla roztworów dopływających do instrumentu pomiarowego w dwóch pozycjach zaworu V. Jeżeli w tak działającym układzie roztwory wzorca i próbki są doprowadzane do zaworu V z jednakowymi prędkościami przepływu, a roztworów nośnika z innym prędkościami (patrz rysunek 3A), to uzyskane informacje pomiarowe umożliwiają wyznaczenie dwóch wykresów kalibracyjnych (w sposób pokazany na rysunku 2). Modyfikacje tego podstawowego układu, polegające ogólnie na dodatkowym różnicowaniu prędkości przepływu strumieni roztworów (rysunek 3B) i ograniczaniu ich objętości za pomocą czterech pętli (α, β, γ, δ) zainstalowanych w zaworze V (rysunek 3C), pozwalają na zmieszanie tych roztworów w nowych stosunkach i uzyskanie nowych informacji pomiarowych [9-11]. W rezultacie, w pojedynczym cyklu kalibracyjnym możliwe jest skonstruowanie trzech, a nawet czterech wykresów kalibracyjnych i obliczenie na drodze interpolacyjnej i ekstrapolacyjnej odpowiednio trzech i czterech wyników analitycznych, stanowiących oszacowania stężenia analitu w próbce. Wykresy takie są przedstawione na rysunku 4. 6. METDA ICM W WERSJI CDM Spośród trzech przedstawionych wersji metody ICM ta ostatnia, pozwalająca na wyznaczenie w pojedynczym cyklu kalibracyjnym czterech wyników analitycznych, posiada szczególne cechy wyróżniające ją od pozostałych. Wynikają one ze specyficznego sposobu sporządzania roztworów układzie przepływowym. tóż, w jednej pozycji zaworu roztwór nośny doprowadza wzorzec i próbkę do przewodu L 3 z prędkościami p i q, a w drugiej pozycji na odwrót z prędkościami q i p. W rezultacie, strumienie roztworu nośnika, wzorca i próbki raz dopływają do instrumentu pomiarowego rozcieńczone w stopniu P, a drugi raz w stopniu uzupełniającym, czyli Q = 1 P. Przedstawia to schematycznie rysunek 5. Ze względu na tę cechę metodę tę można nazwać metodą rozcieńczenia uzupełniającego (ang. complementary dilution metod - CDM) [12]. 119
A r L 2 L 3 S p Det r L 1 W p V B s L 2 L 3 S q Det r L 1 W p V C q L 2 S r α β γ δ L 3 Det p W r V L 1 Rys. 3. Układy przepływowe dostosowane do konstrukcji dwóch (A), trzech (B) i czterech (C) wykresów kalibracyjnych w metodzie ICM: nośnik; W wzorzec; P próbka; odpływ; L 1, L 2, L 3 pętle przepływowe, α, β, γ, δ pętle wstrzykowe; p, q, r, s prędkości przepływu; V zawór dwupozycyjny; Det instrument pomiarowy 120
A R R s+w R s+w b b R w R x a R x -c x2 -c x2 R 0 0 c x1 c w c B R R s+w R s+w b b R x R x R w a a -c x2, -c x2 R 0 0 c x1, c x1 c w c Rys. 4. Graficzne przedstawienie interpolacyjnej metody kalibracyjnej (ICM): wykresy kalibracyjne otrzymane w wyniku działania układów przepływowych przedstawionych na rysunek 3B (A) i 3C (B) służą do wyznaczenia stężenia analitu w próbce odpowiednio drogą interpolacyjną (c x1, c x1 ) i ekstrapolacyjną (c x2, c x2 ) W S W S S W S W Rys. 5. Graficzne przedstawienie, sporządzonych z wykorzystaniem metody CDM, roztworów nośnika (), wzorca (W) i próbki (P) o wzajemnie uzupełniających się stopniach rozcieńczenia. 121
Jeżeli sygnały analityczne zmierzone dla tak przygotowanych roztworów nie są obarczone efektem interferencyjnym i należą do liniowych zależności kalibracyjnych, to wtedy taka specyficzna preparatyka roztworów pociąga za sobą następujące konsekwencje: a) stężenie c x1 wyznacza się interpolacyjnie na podstawie sygnału dla próbki należącego do wykresu kalibracyjnego o innym nachyleniu, niż wykres, do którego ten sygnał zostaje odniesiony; podobna uwaga dotyczy sposobu wyznaczenia stężenia c x1 (patrz rysunek 4B), b) stężenie c x2 wyznacza się ekstrapolacyjnie na podstawie sygnału dla próbki należącego do wykresu kalibracyjnego o innym nachyleniu, niż wykres wyznaczający kierunek ekstrapolacji; podobna uwaga dotyczy sposobu wyznaczenia stężenia c x2 (patrz rysunek 4B), c) stężenia c x1, c x1, c x2 i c x2 są teoretycznie równe sobie i stanowią bezpośrednie oszacowanie prawdziwego stężenia analitu w próbce (w odróżnieniu od stężeń otrzymywanych za pomocą trzech wykresów kalibracyjnych, patrz rysunek 4A), tzn. ich wyznaczenie nie wymaga np. znajomości prędkości przepływu strumieni roztworów w układzie, d) w warunkach stałych pomiarowych błędów przypadkowych stężenia c x1, c x1, c x2 i c x2 są uzyskiwane z teoretycznie jednakowym błędem przypadkowym [13]. Cechy metody ICM w wersji CDM świadczą nie tylko o jej oryginalności, ale także o dużych zaletach analitycznych [12]. Warto zauważyć, że metoda ta może być również bardzo łatwo realizowana w sposób tradycyjny, wymagając jedynie przestrzegania takiego sposobu przygotowania serii roztworów kalibracyjnych, jaki jest przedstawiony na rysunku 5. 7. CHARAKTERYSTYKA AALITYCZA METDY ICM Układy przepływowe służące do realizacji metody ICM mogą być łatwo dostosowane do wykonywania oznaczeń zgodnie z rozmaitymi metodami analitycznymi, a także mogą być łączone z różnymi instrumentami pomiarowymi. a rysunku 6 jest przedstawiony schemat układu do kalibracji z wykorzystaniem metody ICM (w wersji CDM) zaadaptowany do oznaczenia żelaza(iii) metodą sulfosalicylową z użyciem spektrofotometru UV/VIS [12]. 10% kwas 5-sulfosalicylowy W S 2M H 3 aq 425 nm P 1 H 3 H 3 L 2 P 2 V P 3 L 1 L 3 Rys. 6. Układ przepływowy do kalibracji z wykorzystaniem metody ICM dostosowany do spektrofotometrycznego oznaczania żelaza metodą sulfosalicylową: W wzorzec; 122
S próbka; H 3 nośnik; V zawór wstrzykowy; P 1, P 2, P 3 pompy; L 1, L 2 L 3, przewody; odpływ Przykłady wyników analitycznych otrzymanych za pomocą tego układu (po optymalizacji chemicznych i instrumentalnych warunków jego pracy) przedstawiono w tabeli 1 [12]. Tabela 1. Wyniki spektrofotometrycznego oznaczania żelaza (c 0 = 2.50 µg ml -1 ) w próbkach syntetycznych; w nawiasach podano wartości względnego odchylenia standardowego (RSD) w procentach (n=5) c w (µg ml -1 ) c 0 (µg ml -1 ) Stężenie wyznaczone (µg ml -1 ) c 1x c 1x c 2x c 2x c x Błąd 4 (%) 5.00 2.50 2.51 (0.81) 2.53 (1.23) 2.51 (0.44) 2.51 (1.22) 2.51 0.47 5.00 2.50 2.49 (0.37) 2.51 (0.48) 2.49 (0.57) 2.54 (0.85) 2.51 0.41 5.00 2.50 2.51 (0.40) 2.51 (0.47) 2.49 (0.40) 2.47 (0.92) 2.49 0.26 5.00 2.50 2.49 (0.42) 2.47 (0.49) 2.49 (0.24) 2.49 (0.49) 2.49 0.60 5.00 2.50 2.53 (0.44) 2.51 (0.56) 2.53 (0.44) 2.54 (1.46) 2.53 1.17 4.00 2.50 2.50 (1.55) 2.49 (0.71) 2.50 (1.47) 2.49 (1.65) 2.50 0.13 3.00 2.50 2.52 (0.51) 2.48 (0.60) 2.52 (0.51) 2.50 (0.91) 2.50 0.19 RE (%) 0.54 0.52 0.52 0.87 0.44 Jak wykazała analiza statystyczna 5 w każdym przypadku uzyskane wyniki (c x1, c x1, c x2 i c x2 ) niemal zawsze charakteryzują się statystycznie jednorodnymi wariancjami i nie różnią się istotnie od siebie (co świadczy o braku efektów wywołujących błędy kalibracyjne). Ich precyzję należy ocenić jako bardzo dobrą (względne odchylenie standardowe jedynie sporadycznie przekracza 1%). bliczone na ich podstawie wartości średnie pozwalają na oszacowanie prawdziwego stężenia 4 Błąd RE obliczano ze wzoru: [(c x c 0 )/c 0 ] 100%, gdzie c 0 jest prawdziwym (oczekiwanym) stężeniem analitu w próbce 5 Wyniki porównywano ze sobą za pomocą testu t Studenta (α = 0.05), a jednorodność wariancji tych wyników za pomocą testu F max Hartleya (α = 0.05) 123
analitu w próbce z bardzo dobrą dokładnością (tj. z błędem RE na ogół mniejszym od ±1%). Takie wyniki są, jak się wydaje, dostatecznym dowodem na prawidłowe działanie układu przepływowego i upoważniają do używania go w praktyce analitycznej. Dowodzą równocześnie słuszności podstawowych założeń metody ICM jako metody kalibracyjnej. Wyniki zamieszczone w tabeli 1 zwracają uwagę na jeszcze jeden bardzo ważny aspekt metody ICM, który można odnieść do różnych jej wersji (nie tylko do metody CDM). tóż łatwo zauważyć, że niezależnie od liczby wyników uzyskiwanych z wykorzystaniem metody ICM (2, 3 lub 4) średnia ich wartość otrzymana w pojedynczym oznaczeniu jest zawsze mniej dokładna od co najmniej jednego spośród tych wyników. Można jednak teoretycznie udowodnić, że jeżeli wyniki te są statystycznie jednakowe i są obarczone jednakowymi błędami przypadkowymi, to w miarę wzrostu liczby wykonywanych oznaczeń prawdopodobieństwo tego, że średnia dokładność któregokolwiek pojedynczego wyniku jest większa od średniej dokładności średniej wartości tych wyników staje się coraz mniejsza. Powyższe twierdzenie dokumentują krzywe przedstawione na rysunku 7 6. P 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 a b c 0,0 0 4 8 12 16 20 Liczba oznaczeń Rys. 7. Prawdopodobieństwo (P) szansy, że w kolejnych oznaczeniach z wykorzystaniem metody ICM średnia dokładność pojedynczego wyniku spośród 2 (a), 3 (b) i 4 (c) wyników uzyskiwanych z jednakowym błędem przypadkowym równym 3% (względne odchylenie standardowe- RSD) jest większa od średniej dokładności średniej wartości tych wyników Inaczej mówiąc, można przypuszczać, że po wykonaniu serii ok. 20 oznaczeń wyniki uzyskane z wykorzystaniem metody ICM (niezależnie od jej wersji) mają szansę charakteryzować się jako całość większą dokładnością, niż wyniki składowe otrzymane z użyciem metody CIM lub CEM. W przedstawionym powyżej przypadku 6 Wyniki analityczne pojedynczego oznaczenia (o liczbie 2, 3 lub 4) generowano losowo, a wartości prawdopodobieństwa są średnimi wartościami obliczonymi na podstawie 10 000 symulowanych serii 50 oznaczeń, z których każda była powtarzana dziesięciokrotnie 124
doświadczalnym efekt taki osiągnięto po wykonaniu zaledwie 7 oznaczeń żelaza (wskazują na to wyniki zamieszczone w ostatnim wierszu tabeli 1). Do wniosków tych trzeba jednak podchodzić z dużą ostrożnością, bowiem wypływają one z obliczeń statystycznych i oparte są na takich założeniach, które w praktyce nie zawsze mogą być spełnione w dostatecznie dobrym stopniu. Pomimo osiągnięcia wspomnianego efektu w danym dniu po wykonaniu kilku analiz nie można oczekiwać powtórzenia takiego samego rezultatu w innych dniach, a raczej należy liczyć się z tym, że w nieco tylko zmienionych warunkach może on pojawić się po kilkunastu lub nawet kilkudziesięciu analizach. iemniej jednak sam fakt możliwości jego uzyskania jest bezsprzeczny. Zgodnie z podstawową procedurą metody ICM do kalibracji używa się pojedynczego roztworu wzorcowego, co powoduje, że wyniki analityczne wyznacza się na podstawie wykresów kalibracyjnych opartych jedynie na dwóch punktach doświadczalnych (patrz rysunek 2 i 4). Powstaje zatem pytanie, czy stworzenie warunków dla uzyskania większej liczby punktów może pomóc w poprawie precyzji i dokładności wyników, zakładając nawet, że dwupunktowe wykresy kalibracyjne bardzo dobrze odwzorowują liniową zależność kalibracyjną. Wątpliwości te sprawdzono podczas spektrofotometrycznego oznaczania żelaza w próbkach preparatów leczniczych [12]. Pojedynczy cykl kalibracyjny w przypadku metody ICM realizowano przy użyciu zarówno pojedynczego wzorca, jak i serii pięciu roztworów wzorcowych wprowadzanych kolejno do układu przedstawionego na rysunku 6. W tym drugim przypadku wykresy kalibracyjne konstruowano przez dopasowanie funkcji liniowej do punktów doświadczalnych metodą najmniejszych kwadratów. trzymane wyniki zebrano w tabeli 2. Tabela 2. Wyniki spektrofotometrycznego oznaczenia żelaza w próbce syntetycznej (I) i w próbkach preparatów leczniczych: Sorbifer Durules (II), Żelazo + witamina C (III) i Hemofer (IV) o zadeklarowanych zawartościach tego pierwiastka (c 0 ), otrzymane przy użyciu pojedynczego roztworu wzorcowego (c w = 5 µg ml -1 ) i serii wzorców (c w = 1, 2, 3, 4 i 5 µg ml -1 ); (n=5) Pojedynczy roztwór wzorcowy Seria roztworów wzorcowych Próbka c 0 (µg ml -1 ) c x (µg ml -1 ) Wzg. odchylenie standardowe błąd (%) c x (µg ml -1 ) Wzg. odchylenie standardo I 2.5 2.54 0.16 1.4 2.53 1.79 1.3 II 4.0 3.87 1.27 3.3 3.79 0.62 5.2 III 3.0 2.91 0.23 2.9 2.93 0.28 2.4 IV 4.4 4.32 1.53 1.9 4.29 0.69 2.4 błąd (%) 125
a podstawie obliczeń statystycznych wykazano, że kalibracja z użyciem serii wzorców nie przyczyniła się w istotny sposób do poprawy ani ogólnej precyzji ani dokładności oznaczeń. Wniosek ten potwierdziły również inne podobne doświadczenia wykonane różnymi metodami analitycznymi. Można zatem stwierdzić, że w przypadku oznaczeń wykonywanych w warunkach liniowej zależności kalibracyjnej podstawowa wersja metody ICM dostarcza dostateczną ilość informacji pomiarowych dla uzyskania wyników analitycznych o dużej wiarygodności. 8. ZDLŚĆ WERYFIKACYJA METDY ICM Możliwość dokonania identyfikacji błędów kalibracyjnych za pomocą metody ICM sprawdzono na przykładzie oznaczeń wykonanych metodą płomieniowej atomowej spektrometrii absorpcyjnej (ASA). Układ przepływowy przedstawiony na rysunku 3C użyto do oznaczania wapnia w szerokim przedziale stężeń (do 15 µg ml -1 ) wykraczającym poza liniowy zakres zależności kalibracyjnej oraz do oznaczania magnezu w obecności silnie oddziaływującego z nim tytanu. Wyniki oznaczeń przedstawiono odpowiednio w tabelach 3 i 4. Tabela 3. Wyniki oznaczania wapnia ASA w zakresie nieliniowej zależności kalibracyjnej metodą; (n=3) c 0 (µg ml -1 ) Stężenie wyznaczone (µg ml -1 ) c 1x c 1x c 2x c 2x 2.00 2.35 2.32 2.61 2.47 4.00 4.40 4.39 5.18 4.92 6.00 6.26 6.26 8.07 7.14 8.00 8.04 7.77 10.30 9.64 Tabela 4. Wyniki oznaczania magnezu (c 0 = 0.40 µg ml -1 ) w obecności tytanu z wykorzystaniem metody AAS; (n=3) Stężenie Wyznaczone stężenie analitu (µg ml -1 ) interferenta (µg ml -1 ) c 1x c 1x c 2x c 2x 20.0 0.36 0.37 0.41 0.40 50.0 0.33 0.35 0.38 0.39 150.0 0.30 0.33 0.36 0.37 126
W grupie przedstawionych wyników trzy lub wszystkie cztery oszacowania stężenia analitu w danej próbce (c x1, c x1, c x2 i c x2 ) różnią się istotnie od siebie. W obu przypadkach jest to informacja na tyle przekonywująca, by uznać, że wyniki te są obarczone błędami kalibracyjnymi. Powstaje pytanie: jak rozróżnić rodzaj błędu kalibracyjnego, z którym analityk ma do czynienia (czy wywodzi się on z efektu nieliniowości zależności kalibracyjnej, czy z efektu interferencyjnego, czy też z obu efektów jednocześnie) i jakie ewentualnie należy poczynić dalsze kroki w celu wyeliminowania tych błędów. Sposób eliminacji błędu wynikającego z nieliniowości zależności kalibracyjnej jest stosunkowo prosty: należy powtórzyć procedurę kalibracyjną używając tym razem serii roztworów wzorcowych. Wykresy kalibracyjne skonstruowane na podstawie odpowiedniej liczby (od 5 do 8) punktów doświadczalnych powinny w dostatecznie dobrym stopniu odwzorować zależność kalibracyjną. W przypadku występowania efektu interferencyjnego problem jest trudniejszy. Teoretycznie efekt ten powinien być kompensowany na drodze kalibracji ekstrapolacyjnej, czyli odpowiednie dwa wyniki analityczne (c x2, c x2 ) otrzymywane w wyniku zastosowania metody ICM powinny być jednakowe, różne od pozostałych i zbliżone do wyniku prawdziwego. W praktyce analitycznej kompensacja nie zawsze jednak jest całkowita (o czym świadczą choćby wyniki zestawione w tabeli 4) i w związku z tym wyciąganie kategorycznych wniosków z porównania wyników uzyskiwanych drogą ekstrapolacyjną może być zawodne. W przypadku niektórych rodzajów efektów interferencyjnych skuteczną drogą ich eliminacji jest stosowanie kalibracji interpolacyjnej lub ekstrapolacyjnej z użyciem stopniowo rozcieńczanych roztworów wzorca i próbki [5]. Metody te realizowane są zarówno w sposób tradycyjny [13,14], jak i z wykorzystaniem układów przepływowych [15-17], ale w danej analizie zawsze stosuje się je oddzielnie. Układ przepływowy do kalibracji z wykorzystaniem metody ICM w wersji CDM (rysunek 3C) po dokonaniu niewielkich zmian w sposobie jego działania stwarza możliwość realizacji tych metod w sposób łączny [11]. Budowę tego układu przedstawiono na rysunku 8. q L 2 P r α β γ δ L 3 Det W p r V L 1 Rys. 8. Schemat zamkniętego układu przepływowego do kalibracji z wykorzystaniem metody ICM (oznaczenia symboli jak na rysunku 3) 127
Podstawowa procedura kalibracyjna (użycie pojedynczego wzorca) TAK C x1 = C x1 = C x2 = C x2 IE Liniowa zależność kalibracyjna bez efektów interferencyjnych ieliniowa zależność kalibracyjna lub obecność efektów interferencyjnych ieliniowa zależność kalibracyjna TAK Rozszerzona procedura kalibracyjna (użycie serii wzorców) C x1 = C x1 = C x2 = C x2 IE Koniec analizy becność efektów interferencyjnych Kalibracja metodą rozcieńczeń (rozcieńczanie wzorca i próbki) TAK C x1 = C x1 = C x2 = C x2 TAK C x1 = C x1 = C x2 = C x2 IE Użycie środków chemicznych Rys. 9. Schemat ogólnego postępowania prowadzącego do eliminacji błędów kalibracyjnych z jednoczesną weryfikacją ich występowania z wykorzystaniem metody ICM Modyfikacja układu polega na jego zamknięciu w taki sposób, że przewody odprowadzające roztwory wzorca i próbki nie są kierowane na zewnątrz układu, lecz z powrotem do naczyń, z których są czerpane. Cykliczna zmiana pozycji zaworu powoduje teraz, że próbka i wzorzec są stopniowo rozcieńczane za pomocą ściśle określonych porcji roztworu nośnego wprowadzanego z pętli wstrzykowych (α, β, γ, δ; patrz rysunek 3C). Po każdym pojedynczym cyklu kalibracyjnym metody ICM (tzn. po ustawieniu zaworu w dwóch pozycjach) otrzymuje się sygnały, które pozwalają na skonstruowanie czterech wykresów kalibracyjnych (rysunek 4B) odpowiadających roztworom wzorca i próbki na określonych stopniach rozcieńczenia. W ten sposób uzyskuje się komplet wyników analitycznych (c x1, c x1, c x2 i c x2 ), które stanowią interpolacyjne (c x1, c x1 ) i ekstrapolacyjne (c x2 i c x2 ) oszacowania stężenia analitu w stopniowo rozcieńczanej próbce. 128
Jeżeli żaden z opisanych sposobów eliminacji efektów interferencyjnych nie przynosi rezultatu (tzn. wyniki c x1, c x1, c x2 i c x2 są ciągle różne od siebie), to ostatecznym podejściem jest dostarczenie do układu odpowiedniego odczynnika (np. w postaci roztworu nośnego), który ma zdolność usuwania tego efektu na drodze chemicznej. Udowodniono, że połączenie działania takiego odczynnika z zastosowaniem kalibracji ekstrapolacyjnej jest szczególnie skuteczne [17]. Istnieje zatem bardzo duża szansa, że jeżeli nawet efekt interferencyjny nie zostanie tą drogą wyeliminowany (tzn. wyniki c x1 i c x1 nie będą dokładnie wskazywały na wynik prawdziwy), to będzie całkowicie skompensowany (tzn. wyniki c x2 i c x2 będą równe sobie i bliskie wynikowi prawdziwemu). pisane zabiegi układają się w pewien logiczny ciąg postępowania analitycznego, który może być realizowany na zasadzie decyzyjnej. Schemat takiego postępowania jest przedstawiony na rysunku 9. 9. PDSUMWAIE I WISKI Przedstawione wyniki doświadczalne dowodzą, że metoda ICM jest efektywnym narzędziem w wykrywaniu błędów kalibracyjnych, w dużym stopniu determinujących dokładność wyników analitycznych. Jej rola jest szczególnie cenna wobec bardzo małej liczby skutecznych metod, jakie analityk ma do dyspozycji w celu weryfikacji dokładności analitycznej. Układy przepływowe służące do realizacji metody ICM charakteryzują się zaletami bardzo ważnymi z analitycznego punktu widzenia. W szczególności mogą one być : a) zaadaptowane do realizacji różnych metod analitycznych i łączone z różnymi instrumentami pomiarowymi, b) odpowiednio modyfikowane w celu zastosowania określonych sposobów eliminacji efektów interferencyjnych, c) zautomatyzowane i dostosowane do działania pod nadzorem komputera. a szczególną uwagę zasługuje metoda ICM w wersji CDM. Wykazuje ona szereg cennych cech, które są specyficzne dla niej samej i ogólne dla metody ICM: a) jest prosta i koncepcyjnie przejrzysta na wszystkich etapach procedury kalibracyjnej (laboratoryjnym, pomiarowym, interpretacyjnym i obliczeniowym), b) jest łatwa, szybka i mało kosztowna w realizacji, c) pozwala na uzyskiwanie wyników analitycznych o bardzo dobrej precyzji, d) ma szczególnie dużą zdolność weryfikacji dokładności analiz (posługując się w tym celu aż czterema oszacowaniami stężenia analitu w próbce), e) stosowana w analizach seryjnych może przyczynić się do poprawy ogólnej dokładności tych analiz, f) może służyć do śledzenia dokładności analiz na poszczególnych etapach eliminacji błędów kalibracyjnych. Wszystkie te zalety predestynują metodę ICM-CDM do szerokiego wykorzystania w praktyce analitycznej i do stosowania jej w rutynowej pracy analitycznej [11]. siągniecie tego celu byłoby wielką satysfakcją autora i jego Współpracowników. PDZIĘKWAIA Autor serdecznie dziękuje Koleżankom i Kolegom z Zespołu Analitycznych Technik Przepływowych za udostępnienie wyników doświadczalnych i za owocne dyskusje nad przedstawionym materiałem. 129
LITERATURA [1.] Rokosz A, Błędy analizy chemicznej: ich geneza, ocena wielkości i sposoby eliminacji w: Chemia środowiska. Ćwiczenia i seminaria, E. Szczepaniec-Cięciak, P. Kościelniak (ed), t. 2, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1999 [2.] Kościelniak P., Problemy kalibracji procedury analitycznej w spektrometrii płomieniowej, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1989 [3.] Danzer K., Currie L.A., Pure & Appl. Chem., 4, 993 (1998) [4.] Kościelniak P., Wietecha R., Anal. Lett., 36, 861 (2003) [5.] Kościelniak P., poprzedni rozdział. [6.] Kościelniak P., Analusis, 27, 381 (1999) [7.] Kościelniak P., Anal. Chim. Acta, 438, 323 (2001) [8.] Kościelniak P., J. Inst. Sci. Techn. Balikesir Univ., 3, 65 (2001) [9.] Kościelniak P., Kozak J., Herman M., Instrum. Sci. Technol., 30, 251 (2002) [10.] Kościelniak P., Akcin G., Herman M., Kozak J., Wieczorek M., Ann. Chim., 903, 1045 (2003) [11.] Kościelniak P., Kozak J., Herman M., Wieczorek M. Sposób kalibracji oznaczeń analitycznych i układ analizatora do realizacji tego sposobu, Zgłoszenie patentowe nr P-357171, Urząd Patentowy RP 2002 r. [12.] Kościelniak P., Kozak J., Herman M., Wieczorek M., Fudalik A., w przygotowaniu [13.] Kościelniak P., Zesz. auk. UJ, 36, 27 (1993) [14.] Pszonicki L., Skwara W., Talanta, 36, 1265 (1989) [15.] Sperling M., Fang Z., Welz B., Anal. Chem., 63, 151 (1991) [16.] Kościelniak P., Sperling M.,Welz B., Chem. Anal. (Warsaw), 41, 587 (1996) [17.] Kościelniak P., Kozak J., Anal. Chim. Acta., 460, 235 (2002) 130