Ocena rozprawy doktorskiej mgr farm. Anny Kasprzyk pt. Farmakokinetyka i dystrybucja narządowa treosulfanu i jego biologicznie aktywnego monoepoksytransformeru. Dzięki postępom transplantologii i farmakokinetyki klinicznej stało się możliwe poznawanie różnych schematów kondycjonowania przygotowujących biorcę do przeszczepień komórek krwiotwórczych (HSCT). Naukowcy wciąż jednak poszukują nowych leków, skuteczniejszych i bezpieczniejszych do terapii kondycjonującej. Jednym z leków stosowanym w kondycjonowaniu jest treosulfan (TREO), analog busulfanu (BU), który w badaniach klinicznych wykazuje dobrą skuteczność i niską toksyczność narządową. Jednak wiedza na temat farmakokinetyki TREO i jego biologicznie aktywnych epoksytransformerów nie została do tej pory w pełni poznana. Ponadto nie zbadano dotychczas dystrybucji treosulfanu i jego biologicznie aktywnego monoepoksytransformeru do narządów oraz szpiku kostnego. Należy więc wysoko ocenić podjęcie przez mgr farm. Annę Kasprzyk ważnych i aktualnych problemów badawczych. Przedłożona do oceny praca została przedstawiona w formie wydruku komputerowego, zawiera 160 stron, 49 tabel, 29 rycin, 6 załączników, 3 strony używanych skrótów, 152 pozycje piśmiennictwa. We wstępie i części teoretycznej Doktorantka omówiła rys historyczny przeszczepiania komórek macierzystych szpiku, schematy kondycjonowania w przeszczepieniach allogenicznych. Przedstawiła również budowę chemiczną, mechanizm działania, zastosowanie i działania niepożądane busulfanu i treosulfanu. Omówiła dokładnie aktywność farmakologiczna TREO, jego działanie przeciwnowotworowe, mielosupresyjne, immunosupresyjne, farmakokinetykę busulfanu, farmakokinetykę treosulfanu i jego biologicznie aktywnych epoksytransformerów. Doktorantka dodatkowo ujęła w tabelach parametry farmakokinetyczne TREO u dorosłych i dzieci po podaniu różnych dawek leku oraz działanie niepożądane po podaniu różnych dawek TREO w ramach kondycjonowania przed HSCT. Wstęp napisany jest w oparciu o odpowiednio dobrane i najnowsze pozycje piśmiennictwa. Przedstawione we wstępie przemyślane zagadnienia i dobrze napisane podrozdziały świadczą o dużej wiedzy Doktorantki, co pozwoliło Jej na rzeczowe sformułowanie celu pracy. 1
Celem pracy było zbadanie farmakokinetyki TREO i jego aktywnego monoepoksytransformeru u pacjentów pediatrycznych poddanych kondycjonowaniu przed HSCT na podstawie zmian ich stężeń w osoczu oraz ocena ich dystrybucji narządowej w modelu zwierzęcym. Projekt badawczy Doktorantka realizowała wykonując następujące zadania badawcze: walidacja metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją tandemowej spektrometrii mas (HPLC-MS/MS) oznaczania TREO i S,S-EBDM w osoczu ludzkim oraz w osoczu i supernatantach homogenatów tkanek szczurów; oznaczenie stężeń TREO i S,S-EBDM w osoczu pacjentów pediatrycznych po podaniu TREO w 1- lub 2-godzinnym wlewie dożylnym w dawce 10, 12 lub 14 g/m 2, oznaczenie stężeń TREO i S,S-EBDM w osoczu i narządach (wątrobie, płucach, nerkach, mózgu, mięśniach i szpiku kostnym) szczurów po dootrzewnowym podaniu TREO w dawce 500 mg/kg m.c., obliczenie parametrów farmakokinetycznych TREO i S,S-EBDM u pacjentów pediatrycznych i szczurów doświadczalnych za pomocą programu WinNonlin, analiza dystrybucji narządowej TREO i S,S-EBDM u szczurów. Do oceny farmakokinetyki treosulfanu i jego biologicznie aktywnego monoepoksytransformeru u pacjentów pediatrycznych oraz analizy dystrybucji tych związków do narządów szczurów opracowano i zwalidowano metodę HPLC z detekcją tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). W celu walidacji metody HPLC-MS/MS oznaczania TREO i S,S-EBDM wyznaczono selektywność, liniowość, granicę oznaczalności, precyzję i dokładność, efekt matrycy oraz stabilność zgodnie z wytycznymi Europejskiej Agencji Leków. Opracowana, zwalidowana metoda umożliwiła dokładne oznaczanie TREO i S,S-EBDM w osoczu pacjentów, w osoczu i tkankach zwierząt oraz pozwoliła Doktorantce uzyskać rzetelne wyniki badań farmakokinetycznych. Mgr farm. Anna Kasprzyk wykonywała pracę doktorską w ośrodku o dużych osiągnięciach, tradycjach i pod opieką doświadczonego Promotora w ustawianiu metod wysokosprawnej chromatografii cieczowej i w prowadzeniu badań farmakokinetycznych. W pracy doktorskiej zwraca uwagę szczegółowy opis technik badawczych dotyczących warunków metody HPLC-MS/MS, przygotowania roztworów stosowanych w metodzie HPLC-MS/MS, roztworów do homogenizacji tkanek, przygotowanie osocza i supernatantów homogenatów tkanek nieobciążonych analitami, przygotowania próbek do krzywych wzorcowych oraz oznaczanie TREO i S,S-EBDM w osoczu ludzkim i szczurzym oraz 2
w supernatantach homogenatów szczurów (tkanka wątrobowa, płucna, mięśniowa, mózgowa, nerkowa i szpik kostny). Opracowane metody analityczne przez Doktorantkę są nowoczesne, oryginalne, a dokładny opis procedur pozwoli zapewne na rutynowe stosowanie tych metod w dalszych pracach badawczych. Cześć doświadczalna pracy, łącznie z analizą parametrów farmakokinetycznych i analizą statystyczną w aspekcie wykonawczym zasługuje na bardzo duże uznanie. Badania farmakokinetyki TREO i S,S-EBDM przeprowadzono u 16 dzieci (4 dziewczynek i 12 chłopców) w wieku 0,4 do 18 lat, które były leczone w Klinice Onkologii, Hematologii i Transplantologii Pediatrycznej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu oraz w Klinice Transplantologii Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. Chore dzieci otrzymywały TREO jako czynnik kondycjonujący przed HSCT w postaci 1 lub 2 godzinnego wlewu dożylnego w dawce dziennej 10, 12, 14g/m 2. Charakterystykę chorych dzieci wraz ze schematem dawkowania przedstawiono w czytelnej tabeli. Parametry farmakokinetyczne TREO (AUC, C max, V ss, Cl tot, k el, t 0,5β ) i S,S-EBDM (AUC, C max, k el, t 0,5β ) wyliczono z wykorzystaniem modelu jedno- lub dwukompartmentowego. Określenie farmakokinetyki S,S-EBDM, biologicznie aktywnego epoksytransformeru TREO u dzieci poddawanych kondycjonowaniu przed HSCT stanowi nowatorskie badanie, bo do tej pory farmakokinetyka S,S-EBDM była badana tylko u zwierząt doświadczalnych (króliki). Badania farmakokinetyczne TREO i jego monoepoksytransformeru przeprowadzono również na 96 szczurach (10-tygodniowych) rasy Wistar. Krew w ilości 5 ml do oznaczania stężeń leku i jego metabolitu pobierane z serca oraz szpiku z kości udowej szczura wymagało od Doktorantki dużego doświadczenia i dużej precyzji w prowadzeniu tego typu badań. Dystrybucję TREO i S,S-EBDM do wątroby, płuc, nerek, mięśni, mózgu i szpiku kostnego szczurów badano po dootrzewnowym podaniu TREO w dawce 500 mg/kg. Parametry farmakokinetyczne obliczono przy użyciu analizy bezmodelowej. Są to również nowatorskie badania Doktorantki, bo dotychczas jedynie mózg i płyn mózgowo-rdzeniowy były rozpatrywane pod katem dystrybucji tkankowej TREO i S,S-EBDM. Uzyskane wyniki badań przeprowadzone na zwierzętach laboratoryjnych i na niewielkiej grupie chorych dzieci mogą stanowić punkt wyjścia do dalszych projektów naukowych i klinicznych. 3
Wyniki przeprowadzonych badań zestawiono w tabelach, na rycinach i poddano wnikliwej analizie statystycznej. Cenne uzupełnienie dokumentacji stanowią załączniki dotyczące chromatografów HPLC-MS/MS oraz wyników oznaczeń treosulfanu i monoepoksytransformeru w osoczu u kolejnych badanych dzieci. W rozdziale Wyniki brakuje komentarzy do wszystkich uzyskiwanych wyników, omówienie wyników badań przedstawiono dopiero łącznie w rozdziale z dyskusją. W tabelach 7 14 pominięto jednostki stężeń TREO i S,S-EBDM. Doktorantka w pracy stosuje określenie pacjent pediatryczny, badaniami objęto chore dzieci. Autorka mogłaby więc używać zamiennie wyrażenia pacjent pediatryczny na określenie chore dzieci. Te drobne uwagi oczywiście nie pomniejszają innych walorów redakcyjnych pracy. W omówieniu przedstawionych wyników Autorka podejmuje dyskusję ze znanymi z piśmiennictwa faktami w odniesieniu do własnych badań. Sposób przedstawienia dyskusji świadczy o głębokiej wiedzy Doktorantki dotyczącej tematu rozprawy. Pozycje piśmiennictwa dobrano ściśle tematycznie z pracą i wszystkie prawidłowo zacytowano. W wyniku przeprowadzonych badań Doktorantka wykazała, że średnia wartość t 0,5β TREO i jego metabolitu S,S-EBDM jest zbliżona. Z klinicznego punktu widzenia jest to bardzo ważne doniesienie, bo wskazuje, że metabolit S,S-EBDM jest eliminowany z organizmu biorcy w podobnym czasie jak lek macierzysty TREO. Krótki biologiczny okres półtrwania TREO i jego monoepoksytransformeru w osoczu u badanych dzieci oraz w osoczu, wątrobie, płucach, nerkach, mózgu, mięśniu udowym i szpiku kostnym szczurów wskazuje, że stosowane schematy kondycjonowania przed HSCT zapewniają całkowitą eliminację tych związków z organizmu biorcy przed wykonaniem przeszczepu. Z badań farmakokinetycznych wynika, że AUC TREO normalizowane do dawki leku nie koreluje z wiekiem lub powierzchnią ciała (BSA) dzieci powyżej 1 roku życia, stąd Doktorantka wnioskuje, że nie istnieje konieczność różnicowania dawki treosulfanu. Analiza dystrybucji narządowej TREO i S,S-EBDM u szczurów pozwoliły Doktorantce na przedstawienie trzech kolejnych wniosków: - brak statystycznie istotnych różnic między k el TREO i k el S,S-EBDM w osoczu, wątrobie, płucach, mięśniu udowym i szpiku kostnym szczurów wskazują, że w tych tkankach eliminacja S,S-EBDM jest limitowana jego tworzeniem się z leku macierzystego. Szybsza eliminacja S,S-EBDM z mózgu, w porównaniu do TREO, sugeruje istnienie różnic w transporcie związków przez barierę krew-mózg; - niewielki stopień dystrybucji TREO i S,S-EBDM do mózgu oraz S,S-EBDM do wątroby może być jedną z przyczyn niskiej neurotoksyczności i hepatotoksyczności TREO; 4
5