Transkrypcja katalizowanego rybozymu na rybozym aktywny. Aniela Wochner, James Attwater, Alan Coulson, Philipp Holliger [Tłumaczenie z angielskiego: Damian Kosiorowski] Uważa się, że decydującym wydarzeniem w powstawaniu życia było pojawienie się cząsteczki RNA, zdolnej do replikacji pierwotnego genomu RNA. Opiszemy tutaj rozwój i konstrukcję polimerazy rybozymu RNA, zdolnej do syntezowania RNA o długości do 95 nukleotydów. Aby pokonać swoje uzależnienie kolejności, łączone cechy ewoluowały oddzielnie w różnych liniach rybozymu. Dostarczyło to bardziej ogólny sposób polimerazy rybozymu, który był w stanie syntezować szersze spektrum sekwencji RNA, jak wykażemy przez dokładną syntezę enzymatycznie aktywnego RNA, rybozymu endonukleazy młota. To podsumowuje główny aspekt RNA bazowanie na systemie genetycznym: katalizowane RNA w syntezie aktywnych rybozymów z matrycy RNA. W cześniej biologia mogła prościej powoływać się na RNA zarówno w zakresie dziedziczenia, jak i metabolizmu. Dowody na świat RNA (1), poprzedzający współczesne życie, zawierają informacje o centralnej katalitycznej i informacyjnej roli RNA podczas splicingu (usuwania z RNA fragmentów niekodujących intronów i łączenia fragmentów kodujących egzonów), ekspresji genu, i translacji RNA (2-4), a także wszechstronność RNA w tworzeniu specyficznych receptorów i katalizatorów (5, 6). Organizmy domniemanego świata RNA wymagałyby rybozymu polimerazy RNA zarówno dla RNA bazującego na dziedziczeniu, jak i ekspresji genów RNA. Chociaż dziedziczna replikaza wydaje się być utracona, kluczowe aspekty funkcjonalne RNA katalizowana replikacja RNA, mogą być badane przez pełnomocnika z wykorzystaniem nowoczesnych rybozymów generowanych przez selekcję in vitro, takich jak R18 rybozymu polimerazy RNA (Rys. 1A)(7). R18 został wyizolowany z losowej puli sekwencji przez ewolucję i stopniowo konstrukcję wstępnej klasy I ligazy rybozymu (8-10). Mimo, że R18 jest ogólną polimerazą RNA, jego aktywność jest zależna od sekwencji, jak i ograniczona do transkrypcji odcinków RNA o długości do 14 nukleotydów (nt) na matrycę RNA (7). Począwszy od R18, wykorzystaliśmy rozwój RNA i technikę do tworzenia nowych rybozymów polimerazy RNA, z lepszą aktywnością polimerazy i uniwersalnością sekwencji (11). Przedziałowa kulka przyczepianie znacznika. Strategie selekcji in vitro katalitycznie aktywnego RNA często obejmują nabycie (lub utratę) przechwyconego znacznika (12, 13). Ogranicza to bezpośredni wybór dla bardziej zaawansowanych właściwości enzymatycznych, takich jak kataliza wielokrotnie zmienna (multiturnover). Ukierunkowany rozwój polimerazy RNA rybozymów jest komplikowana jeszcze bardziej wskutek niewłaściwego startera (primeru) rozszerzającego wydajność: istotne przedłużenie jednego startera pozostawia sporadyczne zdarzenia, co zmniejsza efektywną wielkość bibliotek rybozymu polimerazy. Ponadto repertuary rybozymów muszą ulec transkrypcji, na przykład, T7 polimeraza RNA, która przewyższa prawdopodobnie rybozymy polimerazy kandydatów i dlatego musi być nieobecna podczas wybranych etapów. Ostatecznie, wrażliwość i specyficzna kolejność wykrywania strategii jest wymagana do odróżnienia transferazy prostych nukleotydów i działania rzeczywistej, matrycowej polimerazy. Opracowaliśmy strategię wyboru, nazwaną znakowaniem przedziałowych kulek (CBT), która wykorzystuje technologię emulsji wody w oleju (14) do łączenia genów rybozymu z tysiącami kopii odpowiedniego rybozymu, przedstawianych poprzez mikrokulki (Rys. S1). CBT oddziela transkrypcję z kolejnych wybranych przedłużeń starterów i pozwala na wybór genetycznych populacji rybozymów zamiast ich pojedynczych cząsteczek. Pobieranie próbek skumulowanych działań tysięcy genetycznych (klonalnych) rybozymów i wzmacnianie sygnału wrażliwej fluorescencji poprzez wzmacnianie toczenia kręgów (RCA)(Rys. S1c, S2 i S3), umożliwiają wykrywanie i izolację rybozymów polimerazy w zależności od ich zdolności przedłużenia startera. Mamy potwierdzoną metodę CBT, wykorzystującą model wyboru genów rybozymu R18, składającego się z nadmiaru nieaktywnych genów R18, dzięki której uzyskano do 10 5 -krotne wzbogacenie aktywnych genów. Wybór rybozymu polimerazy RNA. Staraliśmy się zwiększyć interakcje na linii rybozym starter - matryca, która jest słaba w rybozymie R18 (7, 15, 16), poprzez dodanie losowej sekwencji domeny RNA na końcu 5 w R18, w regionie zaangażowanym w dwustronne interakcje starter matryca (17). Krótki rdzeń RNA (Tab. S1), który uzupełnia R18 poprzez tworzenie helisy (P2)(7) został pominięty z tej selekcji, jako że jego funkcjonalne znaczenie zostało zakwestionowane (16). Selekcja CBT została zastosowana w tej bibliotece (~5 x 10 7 sekwencji)(tab. S2). Opracowaliśmy mikromiareczkowanie płytki, bazujące na analizie (RPA, analiza płytki polimerazy rybozymu)
(Rys. S4), na ekranie dla zainteresowanych klonów. Po trzech rundach CBT, zaobserwowaliśmy wzrost aktywności w poliklonalnym rybozymie (Rys. S5a), i poprzez RPA zidentyfikowaliśmy jeden rybozym (C19) o zwiększonej aktywności polimerazy RNA wśród 22 wyświetlonych klonów (Rys. 2, A i B). C19 różni się od macierzystego rybozymu R18 przez obecność nowej domeny 5, jak również przez pojedynczy punkt mutacji (G93A)(Rys. 1B). Mutacja G93A znajdowała się w regionie P2 rybozymu i była wynagrodzeniem za zmniejszenie aktywności polimerazy spowodowanej brakiem rdzenia oligonukleotydu. W rzeczywistości mutacja powrotna A93G zapewnia aktywność zależną od rdzenia polimerazy RNA C19 (Rys. S5b). Wtórne przewidywanie struktury nowej domeny 5 wskazywało, że składała się ona z 6nt jednoniciowego segmentu sekwencji (ss C19 ) na końcu 5, po którym następuje nawrót domeny (dot. serpentyny)(hp C19 ). ss C19 pokazał komplementarność w stosunku do końca 5 matrycy (TI), która była wykorzystywana do selekcji i kontroli. Wiązanie ss C19 na matrycy było konieczne dla aktywności C19, jako że matryce zawierające kolejne mutacje segmentu komplementarnej sekwencji wykazywały postępującą utratę aktywności (Rys. 2C). Mutacje kompensacyjne w ss C19 (do odtworzenia miejsca hybrydyzacji 6nt) przywracają aktywność, choć nie na stałe, do poziomu C19. Sugeruje to, że ss C19 zwiększa aktywność C19 przede wszystkim (ale nie tylko) poprzez wspieranie rozpoznania i wiązania matrycy w stronę końca 3. Syntezy RNA dalekiego zasięgu. Chociaż C19 wykazało poprawę aktywności polimerazy na matrycy (TI)(Rys. 2B) selekcji, zwiększenie aktywności C19 w porównaniu z R18 było dużo mniej wyraźne na dłuższych matrycach, gdzie ss C19 w miejscu wiązania znajdował się bliżej końca startera (Rys. 2D). Spekulujemy, że C19 mamy strukturalnie dostosowane do przedłużenia starterów w pobliżu miejsca wiązania ss C19. W związku z tym skonstruowaliśmy szereg odmian domen 5 C19, gdzie pojedyncze elementy wtórnej struktury [sekwencje powyżej ss C19 (R10), ss C19 i HP C19 ], lub ich kombinacji, Rys. 1. Rozwój i konstrukcja rybozymów. Wtórne struktury R18 (A)(7), C19 (B), rozplanowane przez mfold (27), tc19 (C), i propozycje wtórnych struktur dla Z (D), oraz tc19z (E). Mutacje wyizolowane z selekcji Z są przedstawione w kolorze purpurowym, sekwencje wyizolowane z selekcji C19 w kolorze pomarańczowym, a skonstruowane reszty w kolorze zielonym. Mutacja A159C przedstawiona do przekształcenia procesowej domeny przez stabilizację helisy. [Uruchamiane przez transkrypcję, 3 -RTT (Tab. S1)]
Rys. 2. Selekcja i konstrukcja C19. (A) RPA klony z biblioteką selekcji N48 po trzech rundach CBT badane dla podstawowej aktywności (próba P1, niebieska) i bardziej rygorystycznej (próba P2, czerwona). Absorpcja 450nm (jako OD) jest przedstawiona znormalizowana dla R18. (B) Rozszerzona aktywność startera rybozymów R18 i C19 na matrycy selekcji TI. (C) Starter rozszerzony przez C19 na matrycach z kolejnymi punktami mutacji (czerwony) w miejscach wiązania ss C19 ( mutacja matrycy ), i z kompensacją mutacji (do odtworzenia miejsca hybrydyzacji 6nt) w C19 ( mutacja matrycy + mutacja C19 ). ss C19 i jego odpowiednie miejsce wiązania są przedstawione w kolorze zielonym. (D) Rozszerzona aktywność startera tc19 w porównaniu z rybozymami R18 i C19 na matrycy TI-3. zostały pominięte (Rys. S6). Jeden z tych wariantów skracania tc19 (Rys. 1C) brakujące sekwencje powyżej ss C19 i HP C19 zastąpione przez przerywnik 4-reszty (A 4 ) adeniny, wykazały poprawę aktywności polimerazy RNA w dłuższej matrycy (TI-3) w porównaniu do macierzystego rybozymu C19 (Rys. 2D) i rozszerzyły 13% starterów o ponad 26nt (Tab. S4). W przypuszczalnym świecie RNA, zarówno replikacje RNA, jak i replikacja matryc, istniałyby pod wielkim naciskiem na koewolucję w kierunku maksymalnej efektywności replikacji. Staraliśmy się naśladować aspekty tego inteligentnego procesu przez zmianę matryc dostosowanych do tc19 za pomocą rozpoznania dalszej strony ss C19. Zastosowaliśmy system selekcji matrycy (Rys. S7) do biblioteki matryc w oparciu o TI-3 (Tab. S1). Po dwóch rundach selekcji matrycy, ~50% odizolowanych wyprowadziliśmy z jednej matrycy (TI-5), w której TI-3 została przedłużona o dwa dodatkowe powtórzenia sekwencji 11nt centralnych. TI-5 może zostać przetranskrybowane do 47nt przez tc19 z 1,5% starterami przedłużonymi poza zakres (Tab. S4). Wygenerowaliśmy szereg matryc bazujących na tych samych zasadach projektowania, zawierających coraz większą liczbę powtórzeń tych 11nt (TI-1 do TI-10)(Tab. S1). Na tych matrycach tc19 mogłaby rozszerzyć startery do 95nt (Rys. 3) z dokładnością (wyrażoną jako prawdopodobieństwo mutacji na włączenie nukleotydu) wynoszącą 2,7 x 10-2 określoną poprzez sekwencjonowanie produktów o pełnej długości rozszerzenia (Rys. S8). Przedłużenie produktów o długości 91nt wytworzono z wydajnością 0,035% całego startera (Tab. S4). Wydajność produktów o pełnej długości jest ograniczona przez wiele czynników, w tym zakończenie łańcucha i rybozymu oraz rozkład produktu (18). Razem skutkują one 7% prawdopodobieństwem zakończenia (średnio) na pozycji matrycy (Tab. S4). Uniwersalność sekwencji. tc19 aktywowało syntezę kilku długich RNA, ale jego aktywność polimerazy, podobnie jak macierzystego R18, pozostawały zależne od matrycy. Pomimo zdolności do rozszerzeń długich starterów na sprzyjających matrycach, synteza z większością sekwencji matrycy RNA była ograniczona. W celu poprawy uniwersalności, przeprowadziliśmy drugą serię eksperymentów dotyczących selekcji, rozpoczynając z biblioteka 5 x 10 7 losowo zmutowanych genów R18. Ten początkowy zbiór został poddany trzem kolejkom selekcji CBT o niskim rygorze, w celu usunięcia z niego szkodliwych mutacji. Następnie wygenerowaliśmy nowe kombinacje neutralnych i pożytecznych mutacji poprzez rekombinację (19), przed zastosowaniem pięciu dodatkowych rund coraz bardziej rygorystycznej selekcji CBT, za pomocą dwóch różnych matryc selekcji w celu wsparcia rozwoju uniwersalności (Tab. S3), po których aktywność tego
poliklonalnego zbioru wzrosła przekraczając niesamowicie aktywność R18. Przegląd RPA zidentyfikował kladę rybozymów (Rys. S4c), z znacznie poprawioną aktywnością, zawierającą od trzech do pięciu mutacji. Przeanalizowaliśmy zasługi tych mutacji do rozwikłania ich wpływu na aktywność polimerazy RNA (Rys. S9). Z połączenia najkorzystniejszych mutacji (C60U, G93A, G95A i A159C) w jedną cząsteczkę RNA otrzymaliśmy Z (Rys. 1D), rybozym polimerazy RNA o zwiększonej uniwersalności sekwencji (Rys. S10). Łączenie mutacji rdzenia Z z przedłużeniem 5 tc19 zaowocowało hybrydowym rybozymem tc19z (Rys. 1E) ze zwiększoną uniwersalnością sekwencji i aktywnością polimerazy. Choć nadal nie zależy ona od sekwencji matrycy, to ten rybozym przewyższył parametrami wszystkie swoje macierzyste rybozymy (R18, tc19 i Z), syntetyzując dłuższe przedłużenia produktów na wielu różnych sekwencjach matrycy starterów (skonstruowany do obejmowania w przybliżeniu równej reprezentacji wszystkich czterech zasad nukleinowych, jak i wszystkich 16 kombinacji dinukleotydu)(rys. 4A). Również tc19z wykazywały dalszą poprawę dokładności (8,8 x 10-3 ), co uzyskano przez sekwencjonowanie produktów o pełnej długości przedłużenia (Rys. S8). Rys. 3. Synteza RNA dalekiego zasięgu na skonstruowanym szeregu matryc TI-n z rybozymów tc19 i R18 (7 dni). n oznacza liczbę powtórzeń sekwencji 11 głównych nukleotydów pomiędzy starterem a miejscami wiązań ss C19. Schemat przedstawia rozszerzenie startera przez tc19 na TI-n. Synteza rybozymu młota poprzez tc19z. Ulepszenie aktywności i dokładności polimerazy RNA w rybozymie tc19 zachęca nas do zbadania syntezy sekwencji RNA, która koduje aktywność katalityczną: rybozym nukleazy młota. W celu ułatwienia, do scharakteryzowania, syntezy dostatecznej liczby rybozymów pełnej długości, wybraliśmy minimalną wersję endonukleazy przeznaczonej do zastosowań terapeutycznych (20)(Rys. 4B). W przeciwieństwie do R18, rybozym polimerazy RNA tc19z może syntetyzować pełnej długości (>24nt) minizymy młota (Rys. 4C z lewej strony i Rys. S11). Zarówno minizymy o długości +24nt, jak i pula dłuższych rozszerzeń produktów ( 27nt) wykazywały aktywność katalityczną i wytwarzały specyficzne sekwencje rozpadu spokrewnionego substratu RNA (Rys. 4C z prawej strony). Fenotyp tc19z powstaje z wkładu każdej z czterech mutacji (C60U, G93A, G95A i A159C), jak również z krótkiego przedłużenia 5 (5 -GUCAUUGAAAA) do macierzystego rybozymu R18. Mutacja C60U stopniowo zwiększa aktywność polimerazy RNA; jest to jedyna mutacja wybrana w rdzeniu katalitycznym i zamieniająca pary zasad G-C na słabsze pary G-U w głównym rdzeniu P6. G93A i G95A do zaakceptowania jednoniciowego regionu P2 w przypadku braku rdzenia lub, alternatywnie, mogą wspierać nowe dwustronne interakcje z matrycą starterów lub procesową domeną rybozymów. A159C znajduje się w domenie procesowej (reszty 98 do 187), jako część dużej asymetrycznej pętli wewnętrznej. A159C pozwala na utworzenie nowych par zasad G133:G159, co powiększa potencjalny rdzeń z 4-par zasad (P12) tworzony przy wybrzuszonych segmentach A129 do U132 (5 -ACCU) i A160 do U163 (5 -AGGU)(Rys. 1, D i E). Rzeczywiście G133U, oddzielna i pożyteczna mutacja, która została wyizolowana podczas selekcji, mogłaby ustabilizować rdzeń P12 w identyczny sposób, poprzez wspieranie tworzenia par zasad U133:A159. Te dwie mutacje, choć indywidualnie pożyteczne [A159C lepsza od G133U (Rys. S9)], zaprzeczają wzajemnie swoim
wpływom po połączeniu. To zdecydowanie sugeruje, że wybraną cechą jest rzeczywiście tworzenie nowej pary zasad na pozycjach pomiędzy 133, a 159, prawdopodobnie w celu przekształcenia domeny procesywności. Niedawno przeprowadzone badania na domenie procesywności ściśle powiązane z rybozymem polimerazy RNA B6.61 sugerują również obecność 4-par zasad rdzenia P12 (21). Rys. 4. Uniwersalność i synteza młota. (A) Przedłużenie startera przez R18, Z, tc19 i tc19z na różnych dwustronnych matrycach starterów (starter P; matryca T; rybozym RZ). (B) Wtórna struktura minizymu endonukleazy młota z syntetyzowanym segmentem rybozymu (zielony) i substratem (czerwony). Zasadnicze reszty katalityczne są opakowane. (C) Fluoroscencyjne przedłużenie startera na matrycy minizymów przez R18, Z, tc19 i tc19z (po lewej stronie). Syntetyzowane tc19z przedłuża produkty wystarczająco długo, aby utworzyć symetryczne minizymy z substratu (+24 i +27 - czerwony) przygotowanego (Rys. S11) i przetestowanego dla aktywności endonukleazy (strona prawa). Jeden do 3% substratu jest pocięte przez minizym kontrolny (+) i przez oba syntetyzowane tc19z minizymy (+24 i +27) o podobnej wydajności (Tab. S5), ale nie w przypadku ich braku (-)(substrat S; pocięty produkt CP). Rys. 5. Wydajność przedłużenia RNA. Widma błędu (określone na osi Y, jako średni procent błędnych dodanych nukleotydów na pozycję) pełnej długości przedłużeń produktów syntetyzowanych przez rybozymy polimerazy RNA: R18 (A), tc19 (B), tc19z (C). Wskaźnik błędu oznacza średnie prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji na pozycji nukleotydu. Dokładność danych dla R18 pochodzi od <<Attwater et al.>>(18).
Znacznik sekwencji ss C19 pojawił się szybko w selekcji i wydaje się pośredniczyć w interakcji z końcem 5 nici matrycy. Ta interakcja przypomina rozpoznawanie docelowego mrna przez prokariotyczny rybosom dzięki sekwencji Shine-Dalgarno (22) i pierwotnych mechanizmów rozpoznawania matrycy w wersji zaproponowanej w hipotezie znacznika genomu (23). Takie rozpoznawanie mogło być korzystne w ustawieniu prebiotyku, gdzie rybozym polimerazy RNA nie rozwija się w izolacji, ale w obecności wielu niepowiązanych oligomerów RNA. W takich warunkach, specyficznych oddziaływań pomiędzy replikazą i pokrewnymi matrycami poprzez znacznik rozpoznawania, które sprzyja polimeryzacji (Rys. 2C), możemy wspierać prymitywna formę selekcji pokrewieństwa, co pozwoliłoby na własną replikację i darwinowską ewolucję, nawet w przypadku braku podziałów w jednostkach protokomórkowych. Replikacja RNA musi przebiegać z minimalną dokładnością, określoną jako próg błędu (24, 25), aby zapobiec uszkodzeniu zakodowanej informacji genetycznej. tc19z zawiera mutację C60U w rdzeniu katalitycznym, jak również kilka innych mutacji, które mogą mieć wpływ na jego dokładność. Określiliśmy łączną dokładność (zarówno delecji, jak i niewbudowywania nukleotydu) różnych rybozymów przez sekwencjonowanie pełnej długości przedłużeń produktów (Rys. 5). Ta metoda mierzy dokładność rybozymu dla syntezy danej sekwencji (7, 18), jednak skrócone przedłużenia produktów nie są badane ze względu na ewentualne błędy (patrz wspierany online tekst S1). Dzięki tej mierze ustaliliśmy dokładność tc19z na poziomie 8,8 x 10-3 (Rys. S8), która sugerowała poprawę w porównaniu do macierzystych rybozymów R18 (4,3 x 10-2 )(18) i pośredniego tc19 (2,7 x 10-2 ). Niektóre sekwencje RNA są syntetyzowane przez tc19z z jeszcze większą dokładnością. Analiza rybozymów młota, syntetyzowanych przez tc19z właśnie ujawniła dwie mutacje na 37 sekwencjonowanych klonów (2 x G A przejścia w 999nt), co wskazuje na dokładność 2 x 10-3 czyli 20-krotnie większą od dokładności macierzystego rybozymu R18. Chociaż porównania są niedoskonałe ze względu na pewne różnice pomiędzy sekwencjami próbkowanymi dla różnych rybozymów, istnieje znaczne ograniczenie w mutacjach przejścia A G w spektrum mutacji tc19z (i w mniejszym stopniu w tc19), co sugeruje zmniejszoną wrażliwość na niewbudowywanie G naprzeciwko U w matrycy. Z drugiej jednak strony dla odwrotnej mutacji przejścia C U (oznaczającej niezarejestrowanie U naprzeciwko G w matrycy) nie zmniejszyła się, wskazując asymetryczność, tzn. rozpoznawanie konkretnej nici chwiejnych par G U przez tc19z. Rybozym polimerazy RNA był powszechnie uważany za ewolucyjna ślepą uliczkę, uwięziony w lokalnej, optymalnej aktywności w znacznym stopniu oporny na dalszy znaczący rozwój (26). Rozpoczynając od R18 wykazaliśmy, że wybór metody CBT w połączeniu z inżynierią RNA mogą doprowadzić do rybozymów polimerazy, takich jak tc19z, które wykazują zwiększoną aktywność polimerazy i dokładność, jak i uniwersalność, a także pozwalają na transkrypcję katalizowanych rybozymów z aktywnych rybozymów na matrycy RNA. Przypisy:
Wsparcie materiałów w internecie: www.sciencemag.org/cgi/content/full/332/6026/209/dc1 Materiały i metody Teksty Rys. S1 do S11 Tab. S1 do S5 Odnośniki 22 listopada 2010; zaakceptowany 15 lutego 2011 10.1126/science.1200752 Przetłumaczył z języka angielskiego [na potrzeby zaliczenia przedmiotu Biologia Obliczeniowa] Damian Kosiorowski WI, Informatyka, III rok