Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Vol. 7/2008 Nr 4(25) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Identyfikacja markerów immunologicznych na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa z zastosowaniem hodowli komórkowych Identification of Immune Markers on the Surface of Thyroid Follicular Cells in Patients with Graves Disease During Cellular Culture 1 Artur Bossowski, 2 Elżbieta Iłendo, 3 Radosław Jaworowski, 4 Anna Stasiak-Barmuta, 1 Mirosława Urban, 5 Anna Moniuszko, 6 Jacek Dadan, 7 Marek Niedziela, 8 Przemysław Pawłowski 1 II Klinika Chorób Dzieci Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku; 2 Zakład Cytogenetyki Uniwersyteckiego Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Białymstoku; 3 I Oddział Chirurgii Ogólnej Szpitala MSWiA w Białymstoku; 4 Zakład Immunologii Klinicznej UM w Białymstoku; 5 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji UM w Białymstoku; 6 I Klinika Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej UM w Białymstoku; 7 Katedra Pediatrii, Klinika Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego UM w Poznaniu; 8 Klinika Okulistyki UM w Białymstoku Adres do korespondencji: dr hab. n. med. Artur Bossowski, II Kl. Ch. Dz. UM. w Białymstoku, ul. Waszyngtona 17, 15-274 Białystok, tel.: (085) 745-07-28, fax: (085) 745-07-30; e-mail: abossowski@hotmail.com Słowa kluczowe: tyreocyty, hodowle komórkowe, choroba Gravesa-Basedowa, ICAM-1, cząsteczki kostymulacji Key words: thyrocytes, cellular culture, Graves-Basedow disease, ICAM-1, costimulatory molecules Praca prezentowana na XVII Sympozjum PTED w Krakowie, 6-8 września 2007 r. STRESZCZENIE/ABSTRACT Wstęp. W patogenezie choroby Gravesa-Basedowa ważną rolę odgrywają cytokiny prozapalne. Wpływają one zarówno na układ immunologiczny, jak i na komórki docelowe poprzez indukcję ekspresji antyapoptotycznych cząsteczek, powodując w ich wyniku oporność tyreocytów na przebiegającą za pośrednictwem CD95 apoptozę. Cel pracy. Celem pracy była ocena ekspresji cząsteczek CD54 (ICAM-1), CD95, CD134, CD152 (CTLA-4) w tkance gruczołu tarczowego pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB) oraz pacjentów z wolem guzkowym nietoksycznym (NTNG) w trakcie trwania hodowli komórkowych przed i po zastosowaniu stymulatorów komórkowych. Materiał i metody. Badany materiał tkankowy tarczycy oczyszczono i rozdrobniono mechanicznie a następnie inkubowano w roztworze kolagenazy z HBSS. Tak uzyskaną zawiesinę komórek przepuszczono przez filtr nylonowy. Hodowlę komórek tarczycy prowadzono w 50 ml flakonach w podłożu hodowlanym zawierającym: RPMI 1640, 10% FBS, HEPES buffer, L-glutaminę, penicylinę i streptomycynę. Po wyizolowaniu tyreocytów (3x10 5 ) hodowlę prowadzono w 6-dołkowych płytkach przez okres 5 dni. Do hodowli dodawano odpowiednio TNF α, IL-1β oraz INF-γ. Identyfikację markerów CD54, CD95, CD134, CD152 na tyreocytach przy użyciu cytometru przepływowego Coulter XP wykonano w trakcie hodowli przed i po zastosowaniu stymulatorów komórkowych. Wyniki. Identyfikacja markerów CD54, CD95, CD134, CD152 wykazała ich znamienną ekspresję w komórkach tarczycy u pacjentów z cho- 9

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;4(25):9-16 robą GB w porównaniu z NTNG. W trakcie hodowli wartości odsetkowe komórek z ekspresją CD95 wykazywały tendencję do zmniejszania się. Zastosowanie stymulatorów doprowadziło do wzrostu ekspresji cząsteczek CD54 i CD134 przy braku zmian w ekspresji CTLA-4 u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. Wnioski. Reasumując można stwierdzić, iż zmiany ekspresji cząsteczek CD54, CD95, CD134 na komórkach pęcherzykowych tarczycy wskazują na różny stopień aktywacji i stymulacji komórkowej w trakcie rozwoju procesu chorobowego tarczycy. Endokrynol. Ped. 7/2008;4(25):9-16. Introduction. In the pathogenesis of Graves disease an important role play proinflammatory cytokines. They influence on immune system and also on destination cells by induction of antiapoptotic molecules expression causing resistance of thyrocytes to apoptosis the programmed cells death, coursed by CD95. The aim of the study was to detect the expression of CD54, CD95, CD134, CD152 in the thyroid tissue in patients with Graves disease (GD) and patients with non-toxic nodular goiter (NTNG) during the cellular culture with or without cellular stimulators. Material and methods. Investigated thyroid tissue was cleaned and then mechanically and enzymatic fragmentation using collagenase with HBSS. So obtained suspension of cells was pass through the nylon-filter. The culture of thyroid cells managed into 50 mls phials in the basis of cultivation containing: RPMI 1640, 10% FBS, HEPES buffer, L-the glutamine, the penicillin and the streptomycin. After isolation of thyrocytes (3x10 5 ) the culture was managed into 6-pit plates through the period of 5 days. In to the culture was added TNF-a IL-1β and INF-γ. Identification of CD54, CD95, CD134, CD152 markers on thyrocytes, before and after use of cellular stimulators was performed using flow cytometry on apparatus Coulter XP. Results. The analysis of CD54, CD95, CD134, CD152 markers expression on thyrocytes showed their elevation in group of patients with GD in comparison to group of patients with NTNG. During the cellular culture percentage of cells with CD95 expression significantly decreased. Application of cellular stimulators led to the height of the expression of CD54 & CD134 molecules, while CTLA-4 was unchanged in Graves patients. Conclusions. In conclusion, changes of the expression of CD54, CD95, CD134 molecules on the thyroid follicular cells suggest the different degree of the activation and stimulation of the cells during the development of the pathological process within thyroid gland. Pediatr. Endocrinol. 7/2008;4(25):9-16. Wstęp Choroby autoimmunologiczne tarczycy: choroba Gravesa-Basedowa (GB) i zapalenie tarczycy typu Hashimoto charakteryzują się reaktywnością na własne antygeny, co może wywołać proces zapalny lub doprowadzić do całkowitego uszkodzenie gruczołu. Przypuszcza się, że głównym patomechanizmem jest prezentacja przez komórki tarczycy ich antygenów reaktywnym limfocytom T przy udziale cząsteczek kostymulacji CTLA-4 oraz CD134. Nacieczenie gruczołu tarczowego jest wynikiem ekspresji receptorów adhezyjnych na powierzchni leukocytów, komórek środbłonka i tyreocytów [1]. Choroba Gravesa-Basedowa jest związana z napływem limfocytów do tarczycy, nasiloną syntezą przeciwciał skierowanych przeciw receptorowi TSH, tyreoglobulinie oraz tyreoperoksydazie. Śródbłonek naczyń tarczycy odgrywa istotną rolę w procesie immunizacji, a poza tym jest źródłem cytokin i cząsteczek adhezyjnych. Nasilona ekspresja tych cząsteczek związana jest z kierowaniem limfocytów do ich miejsc docelowych. W patomechanizmie schorzeń autoimmunologicznych tarczycy ważną rolę odgrywają prozapalne cytokiny. Wpływają one zarówno na układ immunologiczny jak i na komórki docelowe. Istotną rolę w ich oddziaływaniu mają limfocyty regulatorowe typu CD4+CD25+, które blokują czynność komórek Th1 i Th2. W procesach autoimmunologicznych tarczycy dochodzi bowiem do obniżenia odsetka limfocytów T regulatorowych oraz upośledzenia ich funkcji, co tym samym ogranicza mechanizm hamowania syntezy cytokin przez komórki Th. W przypadku zapalenia tarczycy typu Hashimoto dochodzi do przewagi komórek typu Th1, które uwalniając prozapalne cytokiny: IL-1 β, INF-γ czy TNF-α indukują masywną regulację wzrostu ekspresji cząsteczek CD95 i CD95L na powierzchni tyreocytów [2]. Stymulacja ta powoduje aktywację zaprogramowanej śmierci komórki wskutek mechanizmu samo- lub bratobójstwa, doprowadzając w konsekwencji do destrukcji komórek pęcherzykowych tarczycy i rozwoju niedoczynności tarczycy. W chorobie Gravesa-Basedowa dochodzi natomiast do nacieku głównie limfocytów Th2 oraz produkcji IL-4, IL-10, co indukuje ekspresję antyapoptycznych cząsteczek (Bcl-2, Bcl-XL) [3]. Ten mechanizm powoduje oporność tyreocytów na przebiegającą za pośrednictwem CD95 apoptozę, doprowadzając do hiperplazji gruczołu. Zatem zmiany ekspresji obu cząsteczek Fas (CD95) i FasL (CD95L) w schorzeniach autoimmunologicznych tarczycy przebiegających zarówno z nadmierną proliferacją, jak i inwolucją tyreocytów, mogą być wynikiem zaburzeń aktywności procesu apoptozy. Wykazano ponadto wpływ 10

Bossowski Artur. i inni: Identyfikacja markerów immunologicznych powierzchni komórek pęcherzykowatych tarczycy pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa... prozapalnych cytokin (TNF α, IL-1β, INF-γ) uwalnianych z napływających do gruczołu tarczowego limfocytów T na ekspresję cząsteczek adhezyjnych [ICAM-1 (CD54), VCAM-1] i kostymulujących [CTLA-4 (CD152), CD134], obecnych na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy [4]. Celem pracy była ocena ekspresji wybranych markerów immunologicznych w tkance gruczołu tarczowego u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (GB) oraz wolem wieloguzkowym nietoksycznym (NTNG) w trakcie hodowli komórkowej oraz po zastosowaniu stymulatorów komórkowych. Materiał i metody Badanie przeprowadzono w grupie pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa (n = 15, średni wiek 15,1±1,3 lat) oraz pacjentów z wolem wieloguzkowym nietoksycznym (n = 15, średni wiek 16,0±0,8 lat) hospitalizowanych w Poradni Endokrynologicznej przy II Klinice Chorób Dzieci, Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz Klinice Endokrynologii i Diabetologii Wieku Rozwojowego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Pacjenci byli poddani totalnej lub subtotalnej tyreoidektomii w Klinice Chirurgii Ogólnej Endokrynologicznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku oraz Klinice Chirurgii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Rozpoznanie postawiono na podstawie obrazu klinicznego, badań laboratoryjnych, ultrasonograficznych gruczołu tarczowego i biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (FNAB). Pacjentów z nadczynnością tarczycy leczono metizolem w dawce początkowej 0,5-1,0 mg/kg m.c./dobę w połączeniu z propranololem (0,5-1,0 mg/kg m.c./dobę). Dawki leków redukowano (do 5-10 mg/dobę) w zależności od parametrów biochemicznych i klinicznych celem doprowadzenia do stanu eutyreozy przed zabiegiem operacyjnym. Pacjenci z wolem wieloguzkowym otrzymywali L-tyroksynę w dawce 25-75 μg/dobę przez okres 3-12 miesięcy od rozpoznania. Pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa kwalifikowano do badań na podstawie następujących kryteriów: obecność wola IIo, oftalmopatii, TRAb > 5, dodatnich mian przeciwciał anty-tpo i antytg oraz utrzymujących się ponad 3 miesiące od początku rozpoznania stężeń TSH < 0.45. Protokół badań został zatwierdzony przez Komisję Etyczną do spraw badań naukowych przy Uniwersytecie Medycznym w Białymstoku. Krew do badań pobierano na czczo w godzinach rannych z żyły odłokciowej. Odwirowywano w wirówce przez 10 minut przy 2000 obrotów na minutę. Do chwili zebrania odpowiedniej ilości surowic do oznaczeń, przechowywano je w temperaturze -85oC. W badanych surowicach oznaczano przeciwciała przeciwreceptorowe (TRAb) metodą radioreceptorową z użyciem zestawów TRAK human (Brahms Diagnostica GmbH, Berlin, Germany), w których wartość < 1 U/l była traktowana jako negatywna, 1,0-1,5 jako wątpliwa i > 1,5 jako pozytywna. Ocenę stężeń przeciwciał p/peroksydazie (anty-tpo) i p/tyreoglobulinie (anty-tg) przeprowadzono testem immunoenzymatycznym Varelisa (Variable Enzyme Linker Imano Sorbent Assay, Pharmacia Upjohn Diagnostics GmbH Co. KG. Freiburg, Germany). Za Ryc. 1. Zawiesina komórek pęcherzykowych tarczycy w podłożu hodowlanym Fig. 1. Thyrocytes in suspension in culture medium Ryc. 1a. Tkanka tarczycy po trawieniu kolagenazą w podłożu RPMI-1640 Fig. 1a. Thyroid after pickling with collagenase in RPMI-1640 medium Ryc. 1b. Zawiesina komórek pęcherzykowych po podaniu stymulatorów komórkowych (in vitro) Fig. 1b. Thyroid follicular cells in suspension after using of cellular stimulators (in vitro) 11

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;4(25):9-16 wartość prawidłową stężenia przeciwciał anty-tg i anty-tpo uznano < 50 IU/ml. Stężenia hormonów tarczycy oraz TSH w surowicy krwi były oznaczane w mini analizatorze firmy Bio Merieux, France na bazie testu VIDAS (Bio Merieux, France), w połączeniu metody immunoenzymatycznej z fluoroscencyjną. Wartości prawidłowe: ft4 0,71-1,55 ng/dl, ft3 2,6-5,4 ng/dl, htsh 0,32-5 μiu/ml. Badany materiał tkankowy tarczycy oczyszczono i rozdrobniono mechanicznie a następnie inkubowano w roztworze kolagenazy (Sigma Chemical Co.) z Hanks balanced salt solution (HBSS). Tak uzyskaną zawiesinę komórek przepuszczono przez filtr nylonowy (Ryc. 1a). Hodowlę komórek tarczycy prowadzono w 50 ml flakonach w podłożu hodowlanym zawierającym: RPMI 1640, 10% FBS, HEPES buffer, L-glutaminę, penicylinę i streptomycynę. Wyizolowane tyreocyty w ilości 3x10 5 hodowano na 6-dołkowych płytkach przez okres 5 dni w temperaturze 37 o C w atmosferze z zawartością 5-95% CO2. Do hodowli dodawano odpowiednio IL-1β, INF-γ, TNF-α (Ryc. 1b). Identyfikację markerów immunologicznych na tyreocytach przy użyciu cytometru przepływowego Coulter XP wykonano w trakcie hodowli, przed i po zastosowaniu stymulatorów komórkowych. Równolegle prowadzono hodowlę bez dodatku stymulatorów jako kontrolę negatywną. Analiza statystyczna Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wyznaczając dla każdego parametru wartość średnią i odchylenie standardowe. Istotność różnic pomiędzy wartościami średnimi stwierdzono za pomocą testu t-studenta potwierdzając testem U Manna-Whitney a. Za istotną statystycznie uznano wartość t, dla której wartość p była mniejsza od 0,05. Do oceny siły współzależności pomiędzy kolejnymi parametrami zastosowano współczynniki korelacji liniowej Persona i Spearmana. Obliczenia matematyczno-statystyczne wykonano w oparciu o program Statistica 6,0. Tabela I. Charakterystyka badanych grup pacjentów Table I. Clinical characteristics of the examined patients Wiek (lata) Age (years) Grupa z chorobą Gravesa- Basedowa Group with GD Grupa z wolem wieloguzkowym nietoksycznym Group with NTMG 17,1±4,3 16,0±5,2 NS n 15 15 Waga (kg) Weight (kg) Wzrost (cm) Height (cm) 59±7 63±8 NS 1,75 1,76 NS BSA (m ) 1,68 1,7 NS anty-tpo (IU/ml) anti-tpo anty-tg (IU/ml) anti-tg 650±250 55±15 p<0,025 360±40 20±5 p<0,006 TRAb (U/l) (+) ( ) ft4 (ng/dl) 2,04±0,30 1,29±0,2 NS ft3 (ng/l) 3,8±0,5 2,94±0,21 NS TSH (µiu/l) 0,3±0,1 1,1±0,5 p<0,001 GD Graves disease NTMG Non-toxic multinodular goiter 12

Bossowski Artur. i inni: Identyfikacja markerów immunologicznych powierzchni komórek pęcherzykowatych tarczycy pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa... Wyniki W tabeli 1 przedstawiono charakterystykę badanych grup oraz wyniki badań laboratoryjnych pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa i wolem wieloguzkowym nietoksycznym. Pacjenci ze zmianami guzkowymi powyżej 1 cm w badaniu ultrasonograficznym zostali poddani biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej, której wyniki wykazały niezłośliwe zmiany w gruczole tarczowym. Identyfikacja markerów immunologicznych wykazała znamienną ich ekspresję w komórkach tarczycy u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa 41% (ICAM-1, p < 0,0025), 50% (CD95, p < 0,0025), 24% (CD134, p < 0,005), 13% (CD152, p < 0,005), w porównaniu z wolem wieloguzkowym nietoksycznym odpowiednio 24% (ICAM-1), 23% (CD95), 13% (CD134), 6% (CD152). (Ryc. 2). Zastosowanie czynników stymulujących komórki doprowadziło do wzrostu ekspresji CD54, CD134 u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, szczególnie po dodaniu TNF-α (Ryc. 3, 4, 5). W przypadku cząsteczki CD54 po dodaniu INFγ ekspresja wzrosła o 56%, a po dodaniu TNF-α o 70% (p < 0,001). Z kolei ekspresja cząsteczki kostymulującej CD134 po dodaniu INF-γ wzrosła o 26%, a po TNF-α o 28% (p < 0,01). Największy wzrost ekspresji obserwowano po zastosowaniu IL- 1ß o 31% (p < 0,01). W przypadku zaś cząsteczki CD95 po wprowadzeniu stymulatorów komórkowych obserwowano znamienne obniżenie jej ekspresji na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy odpowiednio po IL-1ß o 10%, TNF-α o 20% i INF-γ o 25% (p < 0,01, p < 0,01, p < 0,01), w porównaniu do ekspresji CD95 w hodowli tyreocytów bez udziału stymulatorów. Analiza ekspresji cząsteczki CTLA-4 na tyreocytach w trakcie hodowli komórkowej i po zastosowaniu bodźców stymulujących, nie wykazała znamiennych statystycznie różnic w jej ekspresji u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa. W grupie z wolem wieloguzkowym nietoksycznym nie obserwowano istotnie statystycznego wzrostu ekspresji CD54, CD95, CD134, CD152 na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy. W obu badanych grupach nie wykazano także znamiennych statystycznie zależności pomiędzy stężeniem przeciwciał przeciwtarczycowych i hormonów tarczycy, a odsetkiem tyreocytów z ekspresją CD54, CD95, CD134, CD152 w trakcie hodowli bez stymulatorów i po ich zastosowaniu. % tyreocytów GD Graves disease NTMG Non-toxic multinodular goiter */** istotność statystyczna pomiędzy grupami z GB i WGNT */** statistical significance between group with GD and NTMG Ryc. 2. Ekspresja markerów immunologicznych na powierzchni komórek pęcherzykowych tarczycy po ich izolacji z materiału tkankowego Fig. 2. Expression of immune markers on the surface of thyroid follicular cells after isolation form thyroid tissues % tyreocytów z ICAM-1 ICAM-1 CD95 CD134 CD157 ICAM-1 izo ICAM-1 IL-1b ICAM-1 INF-g ICAM-1 TNF-a * istotność statystyczna pomiędzy grupami GB i WGNT * statistical significance between group with GD and NTMG ** istotność statystyczna pomiędzy grupami GB z izolacją a stymulacją tyreocytów ** statistical significance between group with GD after isolation and stimulation of thyrocytes Ryc. 3. Ekspresja ICAM-1 (CD54) na powierzchni tyreocytów w badanych grupach po zastosowaniu stymulatorów komórkowych Fig. 3. Expression of ICAM-1 (CD54) on the surface of thyrocytes after using of cellular stimulators in examined groups 13

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;4(25):9-16 % tyreocytów z CD134 * istotność statystyczna pomiędzy grupami GB i WGNT * statistical significance between group with GD and NTMG ** istotność statystyczna pomiędzy grupami GB z izolacją a stymulacją tyreocytów ** statistical significance between group with GD after isolation and stimulation of thyrocytes Ryc. 4. Ekspresja cząsteczki CD134 na powierzchni tyreocytów w badanych grupach po zastosowaniu stymulatorów komórkowych Fig. 4. Expression of CD134 molecule on the surface of thyrocytes after using of cellular stimulators in examined groups % tyreocytów z CD95 CD134 izo CD134 IL-1b CD134 INF-g CD134 TNF-a CD95 izo CD95 IL-1b CD95 INF-g CD95 TNF-a */*** istotność statystyczna pomiędzy grupami GB i WGNT */*** statistical significance between group with GD and NTMG ** istotność statystyczna pomiędzy grupami GB z izolacją a stymulacją tyreocytów ** statistical significance between group with GD after isolation and stimulation of thyrocytes Ryc. 5. Ekspresja (CD95) na powierzchni tyreocytów w badanych grupach po zastosowaniu stymulatorów komórkowych Fig. 5. Expression of CD95 molecule on the surface of thyrocytes after using of cellular stimulators in examined groups Dyskusja Zaburzenia ekspresji cząsteczek konstymulacji na powierzchni limfocytów i tyreocytach oraz ich istotne korelacje z poziomem przeciwciał przeciwtarczycowych (TSAb, TBAb) sugerują udział tych molekuł w etiopatogenezie choroby GB oraz mogą być skuteczne w monitorowaniu zastosowanej terapii tyreostatykiem [4]. W patomechanizmie choroby Gravesa-Basedowa ważną rolę odgrywają zjawiska immunologiczne. Wykazano znamienną rolę wielu cząsteczek, m.in. CD152, CD54, CD95, CD134 w rozwoju tego schorzenia. Efektywna aktywacja limfocytów T wymaga sygnału pierwotnego wygenerowanego przez antygen prezentowany przez układ zdolności tkankowej oraz sygnału niespecyficznego przekazywanego poprzez interakcję CD28 z białkiem wiążącym B7 na komórkach prezentujących antygen. CTLA-4 (cytolitic T lymphocyte associated antigen-4, CD152) jest cząsteczką odpowiedzialną za sygnał hamujący dla limfocytów T. Na modelach zwierzęcych objaśniono rolę CTLA-4 w indukcji i rozwoju schorzeń autoimmunologicznych w tym cukrzycy typu I. Wykazano także obecność polimorfizmu CTLA-4 w pozycji 49 egzonu 1 w chorobach autoimmunologicznych tarczycy oraz podwyższone stężenie rozpuszczalnej formy CTLA-4 w surowicy krwi u pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa [5]. Bossowski i in. obserwowali zwiększoną ekspresję molekuł CTLA-4 na powierzchni limfocytów krwi obwodowej pacjentów z chorobą GB oraz znamienną statystycznie zależność pomiędzy cząsteczkami CTLA-4 a autoprzeciwciałami stymulującymi (TSAb) i blokującymi (TBAb) receptor TSH [6]. W naszym materiale na tyreocytach pacjentów z chorobą GB uzyskaliśmy zwiększoną ekspresję CTLA-4 w porównaniu z ich ekspresją na tyreocytach pacjentów z NTNG, wskazując rolę komórek pęcherzykowych tarczycy jako komórek niespecyficznych prezentujących antygen. Wykazano bowiem, iż w patomechanizmie schorzeń immunologicznych tarczycy zachodzą interakcje pomiędzy receptorem TCR (T cell receptor) na zaaktywowanych napływających do tkanki gruczołu tarczycowego limfocytach T, a obecnym na komórkach APC głównym kompleksem zgodności tkankowej (MHC), wynikiem których jest proliferacja limfocytów oraz synteza i uwalnianie przez nie cytokin. Obecność w tych procesach markerów kostymulacji wzmacnia sygnały wymagane dla aktywacji limfocytów i tyreocytów. Taki sygnał mogą 14

Bossowski Artur. i inni: Identyfikacja markerów immunologicznych powierzchni komórek pęcherzykowatych tarczycy pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa... stanowić kompleksy CD28-CTLA-4/B7 oraz rodzina receptorów czynnika martwicy nowotworu: CD134/CD134L (OX-40/OX-40L). W przypadku pierwszego kompleksu glikoproteinowa cząsteczka B7 znajdująca się na komórkach dendrytycznych, aktywnych limfocytach B oraz makrofagach, łączy się z odpowiednimi kontra-receptorami CD28 oraz CTLA-4 na powierzchni limfocytów pomocniczych Th doprowadzając do ich różnicowania w kierunku komórek efektorowych: Th1 oraz Th2. W przypadku braku cząsteczki CD28, rolę kostymulatorów przejmują cząsteczki 4-1BB oraz CD134 (OX-40) obecne na aktywnych limfocytach CD4+ i CD8+. Mają one zdolność do wiązania się z odpowiednimi ligandami 4-1BBL oraz OX-40L obecnymi na powierzchni komórek dendrytycznych, aktywnych limfocytach B oraz makrofagach. Bossowski i in. wykazali, iż zaburzenia ekspresji cząsteczek kostymulacji na powierzchni limfocytów krwi obwodowej oraz ich istotny związek z poziomem przeciwciał przeciwtarczycowych (TRAb) mogą sugerować ich udział w etiopatogenezie choroby Gravesa-Basedowa. Wykazując przewagę populacji komórek z ekspresją CD134 względem populacji 4-1 BB zasugerowali, iż we wstępnej fazie choroby Gravesa-Basedowa dominuje odpowiedź zależna od Th2. Autorzy podkreślają, że ocena ekspresji molekuł OX-40/1-4 BB na limfocytach krwi obwodowej u dzieci z chorobą GB, może stanowić przydatne badanie umożliwiające kontrolę przebiegu aktywności procesu autoimmunologicznego [7]. W naszym materiale uzyskaliśmy zarówno wzrost ekspresji cząsteczki CD134 na tyreocytach pacjentów z chorobą GB względem pacjentów z NTNG, jak również zwiększenie jej ekspresji po zastosowaniu prozapalnych cytokin. Z kolei badania dotyczące oceny zmian ekspresji cząsteczek Fas/FasL (CD95/CD95L) w chorobach tarczycy, mogą wskazywać na przewagę procesu proliferacji nad eliminacją tyreocytów lub odwrotnie oraz określać fenotyp immunologiczny badanego schorzenia. Podczas autoimmunologicznego zapalenia tarczycy cytokiny uwalniane przez makrofagi i limfocyty Th1 wywołują wzrost ekspresji cząsteczek CD95 (8). W chorobie Gravesa-Basedowa w wyniku nacieczenia tkanki gruczołu tarczowego głównie przez limfocyty Th2 oraz zwiększenie syntezy IL-4 i IL-10, dochodzi do przewagi ekspresji cząsteczek antyapoptycznych i tym samym oporności tyreocytów na apoptozę przebiegającą za pośrednictwem CD95. Cząsteczka Fas łącząc się z ligandem FasL indukuje zaprogramowaną śmierć komórki poprzez aktywację kaskady efektorowych kaspaz. Giordano i in. zauważyli, iż stopień ekspresji cząsteczek CD95 i CD95 L na powierzchni tyreocytów istotnie wpływa na zmiany aktywności apoptozy, doprowadzając do rozwoju wola lub jego inwolucji [9]. W powyższej pracy wykazano wzrost ekspresji cząsteczek CD95 na tyreocytach pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa w porównaniu do pacjentów z wolem guzkowym nietoksycznym, podkreślając udział apoptozy w rozwoju procesu autoimmunologicznego. W patogenezie choroby Gravesa-Basedowa istotną rolę odgrywają także cząsteczki adhezyjne, które umożliwiają interakcję komórek. W powyższym badaniu wykazano istotny wzrost ekspresji międzykomórkowej cząsteczki adhezyjnej -ICAM-1 (CD54). Ma ona zdolność wiązania się z cząsteczką LFA-1 (CD11a/CD18) i Mac-1 (CD11b/CD18) na limfocytach T i B oraz na monocytach i granulocytach. Udowodniono, iż ekspresja ICAM-1 rośnie na komórkach śródbłonka i tyreocytach w trakcie rozwijającej się reakcji zapalnej oraz procesach immunologicznych, w tym w schorzeniach tarczycy. Obecność cząsteczek adhezyjnych w obrębie śródbłonka gruczołu tarczowego oraz tyreocytach pośredniczy w nacieku limfocytów w przebiegu procesu immunologicznego [10]. Pesce i in. podkreślają znamienną rolę ICAM-1 w patogenezie choroby Gravesa-Basedowa [11]. W naszym materiale obserwowaliśmy zwiększoną ekspresję ICAM-1 na tyreocytach pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, która wzrastała po zastosowaniu prozapalnych cytokin. W podsumowaniu powyższych badań można stwierdzić, iż ocena ekspresji CD54, CD95, CD134 na komórkach pęcherzykowych tarczycy jest przydatna w monitoringu aktywności procesu immunologicznego w przypadku choroby Gravesa-Basedowa. Dodatkowo zastosowanie stymulatorów komórkowych (odzwierciedlające mikrośrodowisko zapalne) w podłożu hodowlanym, zwiększa aktywność immunologiczną komórek tarczycy w chorobie Gravesa-Basedowa, a najsilniejszymi czynnikami stymulującymi ekspresję powyższych markerów immunologicznych na tyreocytach są TNF-α oraz IL-1ß. Należy także sugerować, iż stymulatory komórkowe wpływają na rezerwy immunologiczne tyreocytów, obecność zaś cząsteczek kostymulacji na ich powierzchni wskazuje rolę tyreocytów jako niespecyficznych komórek prezentujących antygen. 15

Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 7/2008;4(25):9-16 PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Marazuela M., De Landazuri M.O., Larranaga E., Sanchez-Madrid F.: Up-regulated beta1 integrin expression in autoimmune thyroid disorders. Clin. Exp. Immunol., 1997:109(1), 107-15. [2] Urban M., Bossowski A.: Cytokins and adhesion molecules in Graves s disease. Endokrynol. Diabetol. Chor. Przemiany Materii Wieku Rozw., 2000:6(1), 15-9. [3] Bossowski A., Czarnocka B., Bardadin K., Stasiak-Barmuta A., Urban M., Dadan J., Ratomski K., Bossowska A.: Identification of apoptotic proteins in thyroid gland from patients with Graves disease and Hashimoto s thyroiditis. Autoimmunity, 2008:41(2), 163-73. [4] Bossowski A., Czarnocka B., Bardadin K., Urban M., Niedziela M., Dadan J.: Expression of Bcl-2 family proteins in thyrocytes from young patients with immune and nonimmune thyroid diseases. Horm Res., 2008:70(3), 155-64. [5] Saverino D., Brizzolara R., Simone R., Chiappori A., Milintenda-Floriani F., Pesce G., Bagnasco M.: Soluble CTLA 4 in autoimmune thyroid diseases: Relationship with clinical status and possible role in the immune response dysregulation. Clinical Immunology, 2007:123, 190-198. [6] Bossowski A., Stasiak-Barmuta A., Urban M.: Relationship between CTLA 4 and CD28 Molecule Expression on T Lymphocytes and Stimulating and Blocking Autoantibodies to the TSH-Receptor in Children with Graves Disease. Horm. Res., 2005:64, 189-197. [7] Bossowski A., Stasiak-Barmuta A., Urban M., Bossowska A.: Analysis of costimulatory molecules OX40/4-1BB (CD134/ CD137) detection on chosen mononuclear cells in children and adolescents with Graves disease during methimazole therapy. J. Pediatr. Endocrinol. Metab., 2005:18(12), 1365-72. [8] Heter M., Aust G., Ode-Hakim S. et al.: Different cytokinez mrna profiles in Graves disease, Hashimoto s thyroiditis and nonautoimmune thyroid disorders determined by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Thyroid, 1996:6, 97-106. [9] Giordano C., Stassi G., De Maria R., Todaro M., Richiusa P., Papoff G., Ruberti G., Bagnasco M., Testi R., Galluzzo A.: Potential Involvement of Fas and Its Ligand in the Pathogenesis of Hashimoto s Thyroiditis. Science, 1997:275, 960-963. [10] Bossowski A., Urban M., Citko A., Sobotko J., Bossowska A.: Ocena stężenia wybranych cząstek adhezyjnych (sicam-1, svcam-1 i sp selectin) u dzieci i młodzieży w chorobach gruczołu tarczowego. Endokrynol. Diabetol., 2000:6(2), 79-92. [11] Pesce G., Fiorino N., Riccio A. M., Montagna P., Torre G., Salmaso C., Altrinetti V., Bagnasco M.: Different intrathyroid expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in Hashimoto s thyroiditis and Graves disease: analysis at mrna level and association with B7.1 costimulatory molecule. J. Endocrinol. Invest., 2002:25(3), 289-95. 16