Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Transkrypt

1 Vol. 6/2007 Nr 3(20) Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy u dzieci The Subsets of Lymphocytes in Autoimmunological and Non-Autoimmunological Thyroid Diseases in Children ¹Iwona Beń-Skowronek, ¹Leszek Szewczyk, ²Jadwiga Sierocińska-Sawa, ²Elżbieta Korobowicz 1 Klinika Endokrynologii i Neurologii Dziecięcej Akademii Medycznej w Lublinie 2 Katedra i Zakład Patomorfologii Klinicznej Akademii Medycznej w Lublinie Adres do korespondencji: dr n. med. Iwona Beń-Skowronek, Klinika Endokrynologii i Neurologii Dziecięcej, Akademia Medyczna w Lublinie, Lublin, ul. Chodźki 2, tel , skowroneki@interia.pl Słowa kluczowe: tarczyca, subpopulacje limfocytów Key words: thyroid, subsets of lymphocytes STRESZCZENIE/ABSTRACT Patologiczne interakcje subpopulacji limfocytów prowadzą do rozwoju autoimmunologicznych schorzeń tarczycy. Celem naszej pracy była ocena rozmieszczenia głównych subpopulacji limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy u dzieci. Badania dotyczyły tkanki tarczycowej 120 dzieci: 30 z chorobą Gravesa-Basedowa, 24 z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto, 36 z wolem guzkowym obojętnym i 30 z wolem koloidowym oraz 30 preparatów tarczyc pobranych od dzieci zmarłych z powodu wypadków, innych chorób nieautoimmunologicznych oraz dzieci operowanych z powodu torbieli szyi lub nadczynności przytarczyc. Wykonywano odczyny immunohistochemiczne z przeciwciałami monoklonalnymi CD3, CD4, CD8, które pozwalały identyfikować limfocyty T, z CD79 alfa, które identyfikowały limfocyty B oraz CD1a komórki dendrytyczne (DakoCytomation Denmark). Na podstawie oceny liczebności subpopulacji limfocytów i ich rozmieszczenia w tarczycy można wnioskować, że współdziałanie limfocytów T-pomocniczych CD4+ i limfocytów B prowadzi do produkcji przeciwciał niemających działania destrukcyjnego. Podobnie w subpopulacji limfocytów T CD8+ przeważa funkcja supresorowa nad cytotoksyczną. W zapaleniu tarczycy typu Hashimoto dochodzi do nasilenia reakcji cytotoksycznych ze strony limfocytów CD8, limfocytów B występujących bardzo licznie pomimo małej liczby limfocytów CD4+. W wolu guzkowym obojętnym i koloidowym obserwuje się zwiększenie liczby limfocytów w porównaniu z grupą kontrolną jednak bez tworzenia nacieków o cechach obwodowej tkanki limfatycznej. Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20):9-20 Pathological interactions between subsets of lymphocytes lead to development of autoimmunological thyroid diseases. The aim of the study was estimation of distribution of main lymphocyte subsets in autoimmunological and non-autoimmunological thyroid diseases in children. Patients and methods. The study concerned 120 children: 30 9

2 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20):9-20 affected with GD, 24 Hashimoto thyroiditis, 36 nodular goiter, 30 colloid goiter and 30 children without a thyroid disease. After thyreoidectomy, thyroid specimens were stained with hematoxyline-eosin (HE). T-cells were detected by CD3+, CD4+, CD8+ antibodies, B-cells by CD79+ alpha antibodies and the antigen presenting dendritic cells (APC) with CD1a+ antibodies (DakoCytomation). Results. It was evaluated that the interaction between T-helper cells CD4+ and B-cells in Graves disease leads to production of antibodies, which have no destructive character. Likewise in CD8+ subsets of suppressor/cytotoxic T-cells, the suppressor function was predominant. In the Hashimoto thyroiditis cytotoxic reactions of the T suppressor/cytotoxic cells CD8+ and the B-cells dominated. Numerous B- cells occurred despite a low number of T-helper cells in the thyroid tissue. In the nodular goiter and colloid goiter an increase in the number of lymphocytes in comparison to the control group was observed, however, formation of infiltrations was without attributes of the peripheral lymphatic tissue. Pediatr. Endocrinol., 6/2007;3(20):9-20 Wstęp Choroby autoimmunologiczne tarczycy (autoimmune thyroid disease AITD) rozwijają się u 1-2% populacji, częściej u kobiet. Jeszcze częstszymi schorzeniami tarczycy są choroby klasyfikowane jako nieautoimmunologiczne wole koloidowe miąższowe, wole guzkowe, niedoczynność tarczycy wykrywane są one u 5-15% populacji dobrze zaopatrzonej w jod (a u większej liczby osób w populacjach żyjących na terenie niedoboru jodu). Co więcej, u wielu pacjentów obserwujemy ewolucję zmian w tarczycy, kiedy to wole proste staje się wolem nadczynnym lub wolem guzkowym zaś tarczyca w chorobie Gravesa-Basedowa w wyniku leczenia zmienia się w wole guzkowe. AITD rozwijają się na skutek wpływów środowiskowych i reakcji endogennych u osób predysponowanych genetycznie [1]. Liczne prace skupiają się na badaniu procesów regulacyjnych reakcji autoimmunologicznych w tarczycy [2,3,4]. Funkcje regulacyjne odgrywają tu zwłaszcza białka adhezyjne i cytokiny, które oznaczane były przed i w trakcie leczenia AITD [1,5,6]. Obecnie wiadomo, że gdy tolerancja immunologiczna zostaje przełamana, komórki śródbłonka żyłek postkapillarnych są indukowane i dochodzi w tym obszarze do przechodzenia leukocytów poza ścianę naczyń krwionośnych [1,7]. Antygeny własnych tyreocytów są prezentowane i rozpoznawane przez własne limfocyty T-pomocnicze. Wzrost aktywności limfocytów T-pomocniczych we krwi obwodowej prowadzi do proliferacji i aktywacji limfocytów B oraz ich przekształcania się w komórki plazmatyczne, które produkują przeciwciała przeciwtarczycowe [1,8,9]. Znajomość mechanizmów reakcji autoimmunologicznych prowadzi do poszukiwania nowych metod leczenia AITD ingerujących w interakcje pomiędzy limfocytami [10]. Cel pracy ocena liczby i rozmieszczenia w tkance tarczycowej głównych subpopulacji limfocytów w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy u dzieci. Materiał i metody W badaniu uczestniczyło 120 dzieci w wieku lat: 30 z chorobą Gravesa-Basedowa, 24 z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto, 36 z wolem koloidowym miąższowym, 30 z wolem guzkowym zaś 30 rówieśników bez schorzeń tarczycy stanowiło grupę kontrolną. Badane dzieci były leczone w Klinice Endokrynologii i Neurologii Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Lublinie oraz w Poradni Endokrynologicznej Wojewódzkiego Szpitala w Rzeszowie. U wszystkich pacjentów po badaniu fizykalnym oznaczano poziom TSH, tyroksyny wolnej (ft4), a w przypadku nadczynności tarczycy również trójjodotyroniny całkowitej (TT3) w surowicy krwi obwodowej (ABBOTT). U wszystkich dzieci określano również poziom przeciwciał przeciwtarczycowych przeciw tyreoperoksydazie (TPO Ab) i tyreoglobulinie (TG Ab) metodą LIA (Lumitest BRAHMS Diagnostica GMbH, Berlin Germany), zaś u dzieci z nadczynnością tarczycy oznaczano ponadto poziom przeciwciał przeciw receptorowi dla TSH metodą RIA lub LIA (Lumitest BRAHMS Diagnostica GmbH, Berlin, Germany). Oznaczenia poziomów autoprzeciwciał przeciwtarczycowych były podstawą do rozpoznania chorób autoimmunologicznych tarczycy (AITD). Dzieci z nadczynnością tarczycy leczone były metizolem w dawce początkowej 0,9-0,5mg/kg m.c./dobę przez 4-6 tygodni, a potem, gdy uzyskano eutyreozę w dawce podtrzymującej 5 mg/dobę w połączeniu z małą dawką l-tyroksyny 25μg/dobę. Leczenie trwało od 18 do 36 miesięcy. Dzieci z zapaleniem tarczycy Hashimoto, z wolem koloidowym i guzkowym leczone były l-tyroksyną w dawkach μg od 6 do 36 miesięcy. 10

3 PierwszBeń-Skowronek I. i inni Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy... Grupę kontrolną stanowiły dzieci zmarłe z powodu wypadków, innych chorób nieautoimmunologicznych oraz dzieci operowane z powodu torbieli szyi lub nadczynności przytarczyc. Czynność tarczycy oceniano na podstawie wywiadu. Charakterystykę badanej populacji przedstawiono w tabeli 1. Tab. 1. Charakterystyka badanych dzieci Tab. 1. Description of patients Rozpoznanie Liczba badanych TSH ft4 TPO Ab TG Ab TRAB mu/l ng/dl U/l U/l U/l Morbus Graves-Basedow 30 0,007-0,001 3,3-5, Thyroiditis Hashimoto 24 0,6-98,8 0,1-2, x Struma nodosa 36 0,2-4,1 0,8-2, x Struma colloides 30 0,21-3,9 0,8-2, x Grupa kontrolna 30 0,27-4,2 x x x x Tab. 2. Subpopulacje limfocytów w schorzeniach autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych tarczycy u dzieci Tab. 2. The subsets of lymphocytes in autoimmunological and non-autoimmunological thydoid diseases Grupa badana Graves disease Hashimoto thyroiditis Struma nodosa Struma colloides Kontrola miąższ nacieki miąższ nacieki miąższ miąższ miąższ Subpopulacje limfocytów CD3+ CD4+ CD8+ CD79+ CD1a+ średnia SD średnia SD średnia SD średnia SD średnia SD średnia SD średnia SD Badania histopatologiczne Ocenie poddano wycinki miąższu tarczycy utrwalane w formalinie i zatapiane w parafinie po tyreoidektomii lub w przypadku grupy kontrolnej uzyskane w wyniku badań autopsyjnych. Skrawki grubości 4μm barwione były hematoksyliną i eozyną i poddawane rutynowej ocenie diagnostycznej, co weryfikowało ostatecznie rozpoznanie choroby tarczycy u dziecka. W seryjnie krojonych preparatach wykonywano odczyny immunohistochemiczne z przeciwciałami monoklonalnymi CD3+, CD4+, CD8+, które pozwalały identyfikować limfocyty T z podziałem na limfocyty T-pomocnicze i T supresorowo/ cytotoksyczne. Limfocyty B identyfikowane były poprzez przeciwciało CD79alfa, a komórki dendrytyczne poprzez CD1a. Do znakowania limfocytów używano przeciwciał monoklonalnych DakoCytomation Denmark. Charakterystykę badanych subpopulacji limfocytów przedstawia tabela 2. Wykonane odczyny immunohistochemiczne oceniane były w mikroskopie Axiostar plus. Limfo- 11

4 Praca oryginalna cyty były liczone w kamerze Sony Colour Camera Exwave HAD przy użyciu systemu MultiScan5 software and hardware with Show Time Plus, S-VHS frame greabber i komputera IBM Pentium. Określano liczbę limfocytów w tkance tarczycowej poprzez liczenie limfocytów oznaczonych poszczególnymi przeciwciałami w polu widzenia mikroskopu. Oceniano 1000 komórek w co najmniej 10 polach widzenia przy powiększeniu 400 razy. Wyniki wyrażono w postaci średniego odsetka subpopulacji limfocytów ±SD. Określano istotność statystyczną różnic, używając testu Mann-Whitney U test. Za statystycznie istotne uznawano różnice przy p<0,05. Obliczano korelacje pomiędzy liczebnością limfocytów a czasem stosowania leczenia, używając testu Pearsona i Supermana. Obliczeń matematycznych i statystycznych dokonywano przy użyciu programu Statistica 5.0. Badania zostały zaakceptowane przez lokalną Komisję Bioetyczną przy Akademii Medycznej w Lublinie. Wyniki W tarczycy w grupie kontrolnej występowała niewielka liczba limfocytów. Były one zazwyczaj rozrzucone pomiędzy pęcherzykami tarczycowymi Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20):9-20 i nie tworzyły typowych struktur charakterystycznych dla grudek chłonnych. Największy odsetek stanowiły wśród nich limfocyty B CD 79+ 4,07% [tab. 2, ryc. 1]. W preparatach tarczycy pochodzących od pacjentów z AITD limfocyty występowały licznie i często tworzyły nacieki komórkowe oraz namnażały się w grudkach chłonnych. W tarczycach dzieci z chorobą Gravesa-Basedowa obserwowano liczne limfocyty T CD3+, które stanowiły 30,3% komórek nacieków jednojądrzastych i 5,07% komórek w tkance tarczycowej nieobjętej naciekiem [tab. 2]. W grudkach chłonnych limfocyty te skupiały się w strefie grasiczozależnej. W subpopulacji limfocytów T oznaczano subpopulacje limfocytów T-pomocniczych (CD4+) i T supresorowo/cytotoksycznych (CD8+) Limfocyty T-pomocnicze występowały w niewielkim odsetku (1,17%) w śródmiąższu miąższu tarczycy oraz w nieco większym (4,72%) w naciekach komórek jednojądrzastych. Limfocyty T pomocnicze nie przekraczały błony podstawnej pęcherzyków tarczycowych. W grudkach chłonnych były obecne zarówno w centrach rozmnażania, jak i w strefach zagęszczenia [fot. 2]. Limfocyty T supresorowo/cytotoksyczne w tkance tarczycowej występowały w podobnym od- Ryc. 1. Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w chorobie Graves-Basedova Fig. 1. The subsets of lymphocytes in thyroid tissue in Graves disease 12

5 PierwszBeń-Skowronek I. i inni Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy tarczycy... Fot.1. Tyreocyty wykazujące reakcję z CD1a w tarczycy pacjenta z choroba Graves-Basedowa. Pow. 400x Phot. 1. The thyrocytes with CD1a reactions in the thyroid of patient with Graves disease. Magn. 400x Fot. 2. Limfocyty T-pomocnicze CD4+ w grudce chłonnej i miąższu tarczycy pacjenta z chorobą GravesaBasedowa. Pow. 200x Phot. 2. The T-helper cells CD4+ in the lymphatic follicle and in the thyroid tissue in patient with Graves disease. Magn. 200x Fot. 3. Limfocyty T-supresorowo/cytotoksyczne CD8+ w grudce chłonnej i miąższu tarczycy pacjenta z chorobą Gravesa-Basedowa. Pow. 200x Phot. 3. The T-suppressor/cytotoxic cells CD8+ in the lymphatic follicle and in the thyroid tissue in patient with Graves disease. Magn. 200x Fot. 4. Limfocyty T-supresorowo/cytotoksyczne CD8+ w miąższu tarczycy pacjenta z chorobą GravesaBasedowa. Pow. 400x Phot. 4. The T-suppressor/cytotoxic cells CD8+ in the thyroid tissue in patient with Graves disease. Magn. 400x setku jak limfocyty T-pomocnicze 1,59%, były umiejscowione w większości pęcherzyków tarczycowych, często znajdowały się wewnątrz pęcherzyków pomiędzy tyreocytami, tuż nad błoną podstawną lub w świetle pęcherzyków. W naciekach komórkowych obserwowane były trzykrotnie częściej (11,39%). W grudkach chłonnych rozproszone były równomiernie w strefie zagęszczania. Miąższ tarczycy, w którym obserwowano limfocyty CD8 nie wykazywał cech uszkodzenia, cytolizy ani zwiększonej apoptozy. Tyreocyty miały typową budowę komórek aktywnych, walcowatych lub sze- ściennych, widoczny był rąbek szczoteczkowy [fot. 3,4]. Limfocyty B CD79+ (formy młode i dojrzałe limfocytów) produkujące przeciwciała przeciwtarczycowe obecne były przede wszystkim w naciekach komórkowych, gdzie stanowiły 39,86% komórek. Stanowiły prawie połowę populacji komórek centrów rozmnażania i ponad połowę populacji komórek w strefach zagęszczenia grudek chłonnych. W miąższu tarczycy ich liczba była znacznie mniejsza, porównywalna z liczbą limfocytów T 6,59%. Limfocyty B obecne były w tkance między13

6 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20):9-20 Ryc. 2. Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycy w thyroiditis Hashimoto Fig. 2. The subsets of lymphocytes in thyroid tissue in thyroiditis Hashimoto pęcherzykowej, ale przenikały również do samych pęcherzyków tarczycy i występowały pomiędzy tyreocytami oraz wewnątrz pęcherzyków. Komórki dendrytyczne stanowiły bardzo mały odsetek komórek tkanki tarczycowej 0,16% w miąższu i 0,58% w naciekach [tab. 2, ryc. 2]. Wydaje się, że mają one charakter niedojrzałych komórek welonowych reagujących z przeciwciałem CD1a. Znajdowały się one najczęściej tuż pod błoną podstawną pęcherzyków tarczycowych. W niektórych miejscach same tyreocyty wykazywały dodatnią reakcję z przeciwciałem CD1a, co może świadczyć o ich właściwościach zbliżonych do komórek prezentujących antygen [fot. 1]. W preparatach tarczycy pochodzących od pacjentów z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto obserwowano większą liczbę limfocytów niż u dzieci z chorobą Gravesa-Basedowa. Tworzyły one masywne nacieki i liczne grudki chłonne. Tyreocyty w obszarach nacieków jednojądrzastych były często zniszczone, miały cechy cytolizy i apoptozy, były to komórki sześcienne lub płaskie, struktura pęcherzyków tarczycowych była zatarta. Liczba limfocytów T CD3+ była większa w interstitium niż w naciekach jednojądrzastych. Odsetek limfocytów T CD3+ był tu statystycznie istotnie większy niż w tarczycach dzieci z chorobą Gravesa (p<0,01) i wynosił 14,9%. W naciekach komórkowych 13,58%. Praktycznie brak było limfocytów T-pomocniczych CD4+ (0,07% w interstitium i 0,15% w naciekach). Dominowały komórki supresorowo/cytotoksyczne 13,65% w miąższu i 20,15% w naciekach), które wnikały pod błonę podstawną pęcherzyków tarczycowych, pozostawały w ścisłym kontakcie z tyreocytami, niszcząc je tyreocyty w sąsiedztwie limfocytów CD8+ miały cechy cytolizy [fot. 5]. Najliczniejszą subpopulacją limfocytów w tarczycach objętych procesem zapalenia Hashimoto były limfocyty B, które stanowiły 10,63% w tkance śródmiąższowej oraz aż 51,9% komórek nacieków limfocytarnych. Rozmieszczone one były zarówno pod, jak i nad błoną podstawną pęcherzyków tarczycowych, pomiędzy komórkami nabłonkowymi i wewnątrz pęcherzyków. Liczne z nich miały cechy plazmocytów komórek produkujących przeciwciała przeciwtarczycowe [fot. 6]. Komórki dendrytyczne prezentujące antygen były równie nieliczne jak w chorobie Gravesa-Basedowa i tylko nieco bardziej liczne niż w grupie kontrolnej [tab. 2, ryc. 3]. 14

7 PierwszBeń-Skowronek I. i inni Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy... Fot. 5. Limfocyty T-supresorowo/cytotoksyczne CD8+ w miąższu tarczycy pacjenta z zapaleniem typu Hashimoto. Pow. 400x Phot. 5. The T-suppressor/cytotoxic cells CD8+ in the thyroid tissue in patient with Hashimoto thyroiditis. Magn. 400x W tarczycach pacjentów z wolem guzkowym obojętnym i wolem koloidowym obserwowano znacznie mniej limfocytów, które nie tworzyły nacieków i grudek chłonnych. Bardziej nasiloną reakcję immunologiczną obserwowano w wolu guzkowym obojętnym, gdzie odsetek limfocytów T CD3+ sięgał 14,9% (podobnie jak w Fot. 6. Limfocyty B CD79 alfa+ w miąższu tarczycy pacjenta z zapaleniem typu Hashimoto. Pow. 400x Phot. 6. The B-cells CD79 alpha+ in the thyroid tissue in patient with Hashimoto thyroiditis. Magn. 400x thyroiditis Hashimoto). Odnotowano 2,1% limfocytów T-pomocniczych CD4+ i 9% limfocytów CD8+ przy liczbie limfocytów B CD79 alfa+ - 05,9%, mniejszej niż w AITD a nieco większej niż w grupie kontrolnej. Komórki prezentujące antygen CD1a+ stanowiły tylko 0,1% [tab. 2, ryc. 4]. Ryc. 3. Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycy w wolu guzkowym obojętnym. Fig. 3. The subsets of lymphocytes in thyroid tissue in the nodular goiter 15

8 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20):9-20 Ryc. 4. Subpopulacje limfocytów w wolu koloidowym. Fig. 4. The subsets of lymphocytes in thyroid tissue in the colloid goiter Ryc. 5. Subpopulacje limfocytów w tarczycy z grupy kontrolnej Fig. 5. The subsets of lymphocytes in thyroid tissue in the control group 16

9 PierwszBeń-Skowronek I. i inni Subpopulacje limfocytów w tkance tarczycowej w autoimmunologicznych i nieautoimmunologicznych chorobach tarczycy... W wolu koloidowym liczba limfocytów TCD3+ była niewielka 0,36%. Limfocyty pomocnicze CD4+ stanowiły 1,02%, a CD8+ 4,38% nieco więcej niż w grupie kontrolnej, różnice te były jednak statystycznie istotne (p<0,05). Limfocyty B CD79 alfa+ spotykane były rzadko w wolu koloidowym (0,28%) rzadziej niż w grupie kontrolnej i niż w innych schorzeniach tarczycy. Bardzo mało było też komórek dendrytycznych [tab. 2, ryc. 5]. Obserwowano odwrotną korelację pomiędzy długością czasu leczenia metizolem a liczebnością subpopulacji limfocytów CD3+, CD4+ oraz CD79 alfa+ w tkance tarczycy. Brak było korelacji pomiędzy czasem stosowania l-tyroksyny a liczebnością subpopulacji limfocytów w zapaleniu tarczycy Hashimoto. Dyskusja Analiza profilu subpopulacji limfocytów w AITD wskazuje na znaczne różnice w odsetkach limfocytów T i B w chorobie Gravesa-Basedowa i wolu Hashimoto. Pierwotną przyczyną tych różnic jest prawdopodobnie inny mechanizm prezentacji antygenów. W chorobie Gravesa-Basedowa komórki prezentujące antygen mają najczęściej charakter niedojrzałych komórek dendrytycznych wykazujących ekspresję CD1a, zlokalizowanych okołopęcherzykowo [11]. Prezentacja autoantygenów tarczycowych z kompleksem antygenów zgodności tkankowej HLA MCH klasy II prowadzi do aktywacji limfocytów T pomocniczych CD4+ zarówno subpopulacji Th1, jak i Th2. Interleukiną pobudzającą dla limfocytów Th1 jest IL2, a dla TH2 IL4. U pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa występuje mieszane pobudzenie Th1/Th2 z przewagą Th2 [12]. Podobnie jak w naszych badaniach, Kabel i wsp. [13], Voorby i wsp. [14], Mooij i wsp. [15] odnotowali wzmożoną prezentację antygenów klasy II na komórkach nabłonkowych tarczycy, które nabierały właściwości komórek prezentujących antygen [13,14,15]. W przenikaniu limfocytów T do tarczycy odgrywają istotną rolę kompleksy VLA-4/ VCAM-1 i LFA-1/ICAM regulujące adhezję i przenikanie przez ścianę naczyń krwionośnych, podobne działanie ma L-selektyna [16,17,18,19]. W nadczynności tarczycy G-B większość limfocytów zgromadzona jest w naciekach komórkowych, w których dochodzi do tworzenia się grudek chłonnych. Nacieki te nie mają jednak charakteru destrukcyjnego, ale są zorganizowane jak obwodowa tkanka limfatyczna [20,21]. Limfocyty T-pomocnicze powodują Th2 zależną aktywację limfocytów B, ich namnażanie się i przekształcanie się w plazmocyty oraz produkcję przeciwciał przeciwtarczycowych. W naszych badaniach obserwowaliśmy te zjawiska, stosując do znakowania komórek B przeciwciało CD79 alfa, które wiąże się zarówno z dojrzałymi, jak i młodymi formami limfocytów B. Podobne obserwacje do naszych odnotował Armangol [23], stwierdzając nacieki komórkowe z obecnością centrów rozmnażania u 54% pacjentów z chorobą Gravesa. Odsetek limfocytów T supresorowo/ cytotoksycznych CD8+ był istotnie wyższy niż w grupie kontrolnej. Te komórki rozproszone w tarczycy i w naciekach wydają się pełnić bardziej rolę regulacyjną niż cytotoksyczną, gdyż nie obserwuje się w ich sąsiedztwie zmian cytolitycznych w komórkach nabłonka tarczycowego. We krwi opisywano obniżenie odsetka tych komórek na początku choroby Gravesa-Basedowa [3,24,25,]. Należy jednak wziąć pod uwagę, że obserwowane przez nas interakcje limfocytów w tarczycach pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa dotyczą późnego okresu choroby, po długim (ponad 24 miesiące) leczeniu Metizolem, który działa zarówno na tyrocyty, jak i zmniejsza reakcję immunologiczną obniża liczbę limfocytów T-pomocniczych i może zwiększać liczbę limfocytów T-supresorowo/cytotoksycznych [1,26], co jest przyczyną odwrotnej korelacji liczby limfocytów i czasu leczenia metizolem. W tkance tarczycowej pochodzącej od pacjentów z chorobą Hashimoto liczba limfocytów T była podobna w śródmiąższu, jak i w naciekach komórkowych. W naciekach dominowały limfocyty B produkujące przeciwciała niszczące strukturę pęcherzyków tarczycowych i tyreocytów. Limfocyty o fenotypie CD8+ pełniły przede wszystkim funkcje cytotoksyczne, czego efektem są destrukcyjne zmiany w tyreocytach położonych w ich sąsiedztwie. Podobne obserwacje odnotowali Paolieri i wsp. [26] i Swatani i wsp. [27], którzy stwierdzili, że w naciekach z limfocytów T dominują komórki posiadające receptory alfa/beta łączące się z antygenami MCH klasy I i zdolne do reakcji cytotoksycznych. Huer [28] opisał wzrost ekspresji interferonu gamma, IL-2 i CD25 na limfocytach naciekających tarczycę w Hashimoto thyroiditis. Są to cytokiny związane z reakcjami cytotoksycznymi. Ostatnie badania wskazują na rolę peroksydazy tarczycowej (TPO) jako autoantygenu powodującego namnażanie się limfocytów T w tkance tarczycowej [29,30,31,32]. Interesującym zjawiskiem jest bardzo mała liczba limfocytów T-pomocni- 17

10 Praca oryginalna czych CD4+ w tarczycy przy ogromnej liczbie limfocytów B. Najnowsze badania Nagayama i wsp. [36] wskazują, że w populacjach limfocytów CD4+ i CD8+ mieszczą się suppopulacje komórek regulatorowych T-reg: CD4+CD25+ [33] i CD8+CD122+ [34,35], jak też komórki NK. Dysfunkcja lub brak limfocytów CD4+ prowadzi do rozwoju chorób autoimmunologicznych w tym choroby Hashimoto [37]. Sama aktywacja limfocytów B do produkcji przeciwciał przeciwtarczycowych przy braku limfocytów T-pomocniczych w tarczycy może zachodzić w innych narządach limfatycznych, o czym świadczy możliwość przeniesienia immunokompetentnych komórek podczas przeszczepów szpiku lub u zwierząt doświadczalnych [30,38] oraz zwiększenie odsetka tych limfocytów we krwi obwodowej [39]. Ostatnie badania Nakano i wsp. wskazują na istotną rolę apoptozy w zmniejszeniu liczby limfocytów regulatorowych CD4+ CD25+ w thyroiditis Hashimoto [40]. Wole koloidowe i wole guzkowe obojętne uważane są za nieautoimmunologiczne choroby tarczycy i opisywane zazwyczaj w ramach grup kontrolnych w pracach dotyczących AITD. Porównanie profilu subpopulacji tarczycy do grupy kontrolnej dzieci niechorujących na choroby tarczycy wskazuje jednak na udział pewnych reakcji autoimmunologicznych w patogenezie tych schorzeń. W wolu guzkowym odsetek limfocytów T CD3+, a zwłaszcza limfocytów Tsupressorowo/ cytotoksycznych CD8+ jest statystycznie istotnie wyższy niż w grupie kontrolnej. Nie prowadzi to co prawda do wzrostu odsetka limfocytów B, ale może sugerować, że w wolu guzkowym istniały ogniska zapalenia tarczycy lub reakcje limfocytów na proliferujące tyreocyty. W wolu koloidowym mamy do czynienia wyłącznie z niewielkim, ale statystycznie istotnym wzrostem odsetka limfocytów CD8+ (p<0,05) oraz spadkiem liczby limfocytów B CD79+ w porównaniu z grupą kontrolną. Wnioski Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20): W chorobie Gravesa-Basedowa do produkcji przeciwciał przeciwtarczycowych o charakterze głównie stymulującym prowadzi współdziałanie limfocytów T-pomocniczych i limfocytów B; czynność supresyjna limfocytów CD8+ dominuje nad czynnością cytotoksyczną, a liczebność subpopulacji tych limfocytów jest skorelowana prawdopodobnie z długością leczenia metizolem. 2. W zapaleniu tarczycy typu Hashimoto duża liczba limfocytów B w miąższu tarczycy przy niewielkiej liczbie limfocytów T-pomocniczych CD4+ może wskazywać na rolę pozatarczycowej tkanki chłonnej w stymulacji odpowiedzi immunologicznej. W zapaleniu tarczycy typu Hashimoto subpopulacja limfocytów CD8+ ma głównie właściwości cytotoksyczne. 3. W wolu guzkowym obojętnym i w wolu koloidowym liczba limfocytów T, zwłaszcza T supresorowo/cytotoksycznych CD8+ jest statystycznie istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej. Badania wykonano w ramach grantu 2P05E04327 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego. PIŚMIENNICTWO/REFERENCES [1] Weetmann A.P., De Groot L.J., 2007, Autoimmunity to the Thyroid. Chapter 7 in The thyroid and its diseases-book chapters. org [2] Segundo C., Rodriguez C., Aguilar M., Garcia-Poley A., Gavilan L., Bellas C., Brieva J.A.: Differences in thyroid infiltrating B lymphocytes in patients with Graves disease: relation ship to antibody detection. Thyroid, 2004:14, [3] Ben-Skowronek I., Walter Croneck B., Szewczyk L.: Analysis of thyroid autoantibodies and lymphocyte subsets at girls with hyperthyroidism. J. Endocrinol. Invest., 1997:20(suppl. 5), 24-th Annual Meeting of the European Thyroid Association. Munich. Abstr. [4] Ben-Skowronek I., Walter Croneck B., Szewczyk L.: The increase of thyroid autoantibodies and CD5+B cells in children with Graves disease. Horm. Res., 1998:50(suppl. 3), 64, 37-th Annual Meeting of the European Society for Pediatrics Endocrinology (ESPE) Florence. Abstr. [5] Bossowski A., Urban M., Stasiak Barmuta A., Turowski D.: Expression of Very Late Antigen-4 and Lymphocyte Function- Associated Antigen 1 on peripheral blood lymphocytes from patients with Gravs disease. Pediatric Research, 2002:52, [6] Ajjan R.A., Weetman A.P.: Cytokines in Thyroid autoimmunity. Autoimmunity, 2003:36, [7] Gołąb J.: Circulation of lymphocytes in: Immunology ed.: Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., PWN Warsaw [8] Stassi G., Di Liberto D., Todaro M. and all.: Control of target cell survival in thyroid autoimmunity by T helper cytokines via regulation of apoptotic proteins. Nature Immunology, 2000:1,

11 Pierwszy Autor i inni Tytuł artykułu [9] Stassi G., De Maria R.: Autoimmune thyroid disease: new models of cells death in autoimmunity. Nat. Rev. Immunol., 2002: 2, [10] Salvi M., Vannucchi G., Campi I., Curro N., Dazzi D., Simonetta S., Bonara P., Rossi S., Sina C., Guastella C., Ratgla R., Becc-Peccoz P.: Treatment of Graves disease and associated opthalmopathy with the anti CD20 monoclonal antibody rituximab: an open study. Eur. J. Endocrinol., 2007:156, [11] Qadbeck B., Eckstein A.K., Tews S. et al.: Maturation of thyroidal dendritic cells in Graves disease. Scand. J. Immunol., 2002: 55, [12] Ajjan R.A., Weetman A.P.: Cytokines in Thyroid autoimmunity. Autoimmunity, 2003:36, [13] Kabel P.J.,Voorby H.A., de Haan M. et al.: Intrathyroidal dendritic cells. J. Clin. Endocronol. Metab., 1989:66, [14] Voorby H.A., Kabel P.J., de Haan M. et al.: Dendritic cells and class II MHC expression on thyrocytes during the autoimmune thyroid disease of the BB rat. Clin. Immunol. Immonopathol., 1990:55, [15] Mooij P., de Wit H.J., Drexhage H.A.: An excess of dietary iodine accelerates the development of a Thyroid associated lymphoid tissue in autoimmune prone BB rats. Clin. Immonol. Immunopathol., 1993:69, [16] Marazuela M., Postigo A., Acevedo A., Diaz-Gonzalez F., Sanchez-Madried F., de Landazouri M.O.: Adhesion molecules from the LFA-1/ICAM 1,3 nd VLA-4/VCAM-1 pathways on T-lymphcytes and vascular endothelium in Graves and Hashimoto s thyroid glands. Eur. J. Immunol., 1994:24, [Medline]. [17] Guerin V., Bene M.C., Amiel C., Hartemann P., Leclre J., Faure G.: Decreased lymphocyte function-associated antigen-1 molecule expression on peripheral blood lymphocytes from patients with Graves disease J. Clin. Endocrinol. Metab., 1989: 69, [Abstract]. [18] Lee J.H., An M.A., Jeon J.S., Song C.U., Shong M., Kim Y.K., Ro H.K.: Circulating intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in sera of patients with Graves disease and Hashimoto disease. Korean J. Inten. Med., 1995:10, [Medline]. [19] Marazuela M., Postigo A., Acevedo A., Dias-Gonzales F., Sanchez-Madried F., de Landazuri M.O.: Adhesion molecule from the LFA-1/ICAM-1,3, and VLA-4/VCAM-1 pathways on T-lymphocytesand vascular endothelium in raves and Hashimotos thyroid glands. Eur. J. Immunol., 1994:24, [Medline]. [20] Voorby H.A., Kabel P.J., de Haan M. et al.: Dendritic cells and class II MHC expression on thyrocytes during the autoimmune thyroid disease of the BB rat. Clin. Immunol. Immunopathol., 1990:55, [21] Mooij P., de Wit H.J., Drexhage H.A.: An excess of dietary iodine accelerates the development of a Thyroid associated lymphoid tissue in autoimmune prone BB rats. Clin. Immonol. Immunopathol., 1993:69, [22] Armengol M.P., Juan M., Lucas-Martin A., Fernandez-Figueras M.T., Jaraquemada D., Gallart T., Pujol-Borrel R.: Thyroid autoimmune disease: demonstration of thyroid antigen-specific B-cells and recombination-activating gene expression in chemokine-containing active intrathyroidal germinal centers. American Journal of Pathology, 2001:159, [23] Sridama V., Pacini F., De Groot L.J.: Decreased suppressot T lymphocytes in autoimmune thyroid diseases detected by monoclonal antibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1982:54, [24] Pacini F., De Groot L.J.: Studies of immunoglobulin synthesis in cultures of peripheral T and B lympgocytes: reduced T- suppresor cell activity in Graves disease. Clin. Endocrinol., 1983:18, [25] Beń-Skowronek I., Sierocinska-Sawa J., Korobowicz E., Szewczyk L.: Lymphocytes in peripheral blond and in the thyroid tissue in children with Graves disease. 25-th International Congress of Pediatrics, Athens 2007 Abstr. [26] Paolieri F., Pronzato C., Battifora M., Fiorino N., Canonica G.W., Bagnasco M.: Infiltrating gamma/delta T-cell receptor positive lymphocytes in Hashimoto s thyroiditis, Graves disease and papillary thyroid cancer. J. Endocrinol. Invest., 1995:18, [27] Iwatani Y., Hidaka Y., Matsuzuka F., Kuma K., Amino N.: Intrathyroidal lymphocyte subsets including unusual CD4+CD8+ cells and CD3loTCR alpha beta lo/-cd4-cd8- cells, in autoimmune thyroid disease. Clin. Exp. Immunol., 1993:93, [28] Heuer M., Aust G., Ode-Hakim S., Scherbaum W.A.: Different cytokine mrna profiles in Graves disease, Hashimoto s thyroiditis, and non autoimmune thyroid disorders determined by quantitative reverse transcriptase, polymerase chain reactions (RT-PCR). Thyroid 1996:6, [29] Ng H.P., Kung A.W.C.: Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T-cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology, 2006:147(6), [30] Badami E., Maiuri L., Quarantino S.: High incidence of spontaneous autoimmune thyroiditis in immunocompetent selfreactive human T-cell receptor transgenic mice. J. Autoimmunity, 2005:24, [31] Gora M., Gardas A., Wiktorowicz W., Hobby P., Watson P.F., Weetman A.P.: Evaluation of conformational epitopes on thyroid peroxidase by antipeptide antibody binding and mutagenesis. Clin. Exp. Immunol., 2004:136, [32] Flynn J.C., Mc Cormick D.J., Brusic V., Wan Q., Panos J.C.,Giraldo A.A., David C.S., Kong Y.C.M.: Pathogenic human thyroglobulin peptides in HLA-DR3 transgenic mouse model of autoimmune thyroiditis. Cell. Immunol., 2004:229, [33] Saitoh O., Nagayama Y.: Regulation of Graves hyperthyroidism with naturally occurring CD4+, CD25+ regulatory T-cells in a mouse model. Endocrinology, 2006:147, [34] Rifa i M., Kawamoto Y., Nakashima I., Suzuki H.: Essential role of CD8+CD122+ T-cells in the maintenance of T-cell homeostasis. J. Exp. Med., 2004:200,

12 Praca oryginalna Endokrynol. Ped., 6/2007;3(20):9-20 [35] Endharti A.T., Rifa i M., Shi Z., Fukuoka Y., Nakahara Y., Kawamoto Y., Takeda K., Isobe K., Suzuki H.: CD8+CD122+ regulatory T-cells produce IL10 to suppress IFN-gamma production and proliferation CD8+ T-cells. J. Immunol., 2005:175, [36] Nagayama Y., Niwa M., McLachlan S.M., Rapoport B.: Schistosoma mansoni and alfa galactosylceramide: prophylactic effect of TH1 immune suppression in a mouse model of Graves hypothyroidism. J. Immunol., 2004:173, [37] Itoh M., Takahashi T., Sakaguchi N., Kuniyasu Y., Shimizu J., Otsuka F., Sakaguchi S.: Thymus and autoimmunity: Production of CD25+CD4+ naturally anergic suppressive T-cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self tolerance. J. Immunol., 1999:162, [38] Drabko K., Winnicka A., Gaworczyk I., Beń-Skowronek I., Skomra D., Kowalczyk J.: Donor origin of Graves disease in a BMT recipient: Evidence from FISH studies of thyroid tissue Bone Marrow Transplant., 2006:37(8), [39] Maziotti G., Sorvillo F., Naclerio C., Tarzati A., Cioffi M., Perna R., Valentini G., Farziati B., Amato G., Carella C.: Type-1 response in peripheral CD4+ and CD8+ T-cells from patients with Hashimoto s thyroiditis. Eur. J. Endocrinol., 2003:148(4), [40] Nakano A., Watanabe M., Iida T., Kuroda S., Matsuzuka F., Miyagichi A., Iwatani Y.: Apoptosis-induced decrease of intrathyroid CD4+CD25+ regulatory T-cells in autoimmune thyroid disease. Thyroid, 2007:17(1),