NOVA Gel Sm/RNP T 708415 Do diagnostyki in vitro Przeznaczenie NOVA Gel TM Sm/RNP jest systemem testów podwójnej dyfuzji do ustalania miana i półilościowego określania przeciwciał przeciwko Sm/RNP, ekstrahowalnemu antygenowi jądrowemu (ENA) w ludzkiej surowicy. Obecność przeciwciał przeciwko Sm/RNP może być wykorzystana w powiązaniu z innymi testami serologicznymi i wynikami klinicznymi w celu wsparcia diagnozy toczenia rumieniowatego układowego oraz innych powiązanych chorób tkanki łącznej. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Pojęcie przeciwciała przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w reakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami i rybonukleoproteinami. 1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lub reumatycznymi, szczególnie SLE. Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta wrażliwość diagnostyczna doprowadziła do włączenia testowania ANA do Poprawionych kryteriów z 1982 r. klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego przez podkomisję Stowarzyszenia ds. reumatologii i zapalenia stawów. 2 Pomimo tego, że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie wyklucza aktywne SLE 3 ), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste. Obecnym trendem w diagnozowaniu i leczeniu chorób tkanki łącznej jest łączenie wrażliwych testów przesiewowych AVA z bardziej swoistymi testami uzupełniającymi, takimi jak dsdna i/lub ENA. Testy ENA są szczególnie ważne, ponieważ dostarczają one informacje diagnostyczne i prognozowe. Autoprzeciwciała przeciwko antygenowi Sm są wysoce swoiste dla SLE i tak jak w przypadku przeciwciał przeciwko dsdna, są traktowane jako przeciwciało markera. Przeciwciała przeciwko Sm zostały ujęte jako kryteria Stowarzyszenia ds. reumatologii i zapalenia stawów w ramach klasyfikacji SLE. 2 Autoprzeciwciała przeciwko RNP znajdują się u pacjentów z SLE oraz również z niektórymi innymi chorobami tkanki łącznej. 1,2,4 Autoprzeciwciała przeciwko RNP są powiązane z względnie łagodnym przebiegiem choroby z niższym występowaniem choroby nerek, natomiast u pacjentów z przeciwciałami Sm występowanie choroby nerek oraz zajęcia ośrodkowego układu nerwowego jest wyższe. 5-7 Zasada badania Test podwójnej dyfuzji, opisany przez Ouchterlony, 8 obejmuje wykorzystanie roztworu antygenu, który pasywnie przechodzi przez żelowe podłoże podtrzymujące w kierunku próbki pobranej od pacjenta i/lub przeciwciała zawierającego kontrolę. Specjalnie wyprofilowane dołki umieszczone w podłożu żelowym, pełnią funkcję zasobników, z których roztwory antygenu i przeciwciała przedostają się do siebie. W punkcie zrównoważenia antygenu i przeciwciała, w żelu tworzy się widoczna linia precypityny. Następnie można określić stan immunologiczny pacjenta, poprzez obserwowanie wzorów sąsiednich linii precypityny, formujących się w żelu, przy użyciu próbki kontrolnej znanej swoistości i nieznanej surowicy pacjenta. Technika podwójnej dyfuzji może być używana z oczyszczonym preparatem Sm/RNP, znaną próbką kontrolną przeciwciał Sm lub RNP oraz surowicą pacjenta, która prawdopodobnie zawiera przeciwciała Sm oraz/lub RNP w celu wykazania immunologicznej tożsamości, braku tożsamości lub częściowej tożsamości. Potwierdzenie aktywności autoprzeciwciał Sm oraz/lub RNP w surowicy pacjenta można zrealizować, jeśli jego linia precypityny w charakterystyczny sposób łączy się z linią utworzoną przez znaną próbkę kontrolną. 1
W pewnych przypadkach wymagane jest półilościowe określanie ilości przeciwciał Sm oraz/lub RNP w surowicy pacjenta. W takich przypadkach płytka NOVA Gel T może być używana do badania seryjnie rozcieńczanych próbek otrzymanych od pacjenta. Wielkość odwrotna najwyższego rozcieńczenia, które tworzy linię wydzielania się, może być wtedy stwierdzone jako miano przeciwciała Sm oraz/lub RNP dla pacjenta. Prawidłowa procedura testowania podwójnej dyfuzji wymaga badana wielu proporcji stężenia antygen przeciwciało, aby nie dopuścić do uzyskania nadmiaru antygenu lub przeciwciała. Nieprawidłowe lub mylne utworzenie linii precypityny może wystąpić w przypadku nadmiaru antygenu lub przeciwciał. Aby tego uniknąć, roztwory surowicy pacjenta powinny być badane wraz z tym samym preparatem antygenu. Można to zrealizować jednocześnie przy ustalaniu stężenia próbki pobranej od pacjenta na płytce NOVA Gel T. Odczynniki 1. Płytki żelowe NOVA Gel T do badań przesiewowych, każda z 7 dołkami, zawierające stabilizatory oraz azydek sodu 0,09% 2. 0,4 ml antygenu Sm/RNP (z grasicy cielęcej), liofizowanej w buforze zawierającym stabilizatory i azydek sodu 0,09% 3. 0,7 ml kontroli Sm, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko Sm w buforze zawierającym azydek sodu 0,09% 4. 0,7 ml kontroli RNP, surowica ludzka zawierająca autoprzeciwciała przeciwko RNP w buforze zawierającym azydek sodu 0,09% Ostrzeżenia 1. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HbsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym kontrola Sm i kontrola RNP powinny być obsługiwane w taki sam sposób jak potencjalnie zakaźny materiał. 9 2. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 3. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 4. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Do uwadniania antygenu zalecane jest używanie wody destylowanej lub dejonizowanej. 4. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmuje to temperaturę początkową odczynników, zapobieganie wylewaniu się odczynników lub próbek otrzymanych od pacjenta z dołków oraz jakość wody stosowanej do uwadniania antygenu. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 5. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 2
Warunki przechowywania Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. Po uwodnieniu antygen zachowuje trwałość przez 2 tygodnie w temperaturze 2 8 C. W razie potrzeby można przygotować 100 µl próbek, które należy przechować w temperaturze -70 o C. Antygen przechowywany w taki sposób zachowuje trwałość przynajmniej przez 1 rok. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2-8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 8 dziurkowanych płytek do miareczkowania NOVA Gel T 2 0,4 ml antygenu Sm/RNP, liofizowanego 1 0,7 ml kontroli Sm 1 0,7 ml kontroli RNP Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety o pojemności 15-100 µl Jednorazowe końcówki mikropipet 0,85% soli fizjologicznej Woda destylowana lub dejonizowana (najlepiej jałowa) Źródło światła lub pudełko do podglądu żelu Sposób przygotowania 1. Uwodnić antygen Sm/RNP Ostrożnie otworzyć fiolkę z antygenem i dodać 0,4 ml destylowanej lub dejonizowanej wody do liofilizatu antygenu. W celu uzyskania optymalnych wyników zalecane jest używanie jałowej wody destylowanej lub dejonizowanej. Pozostawić uwodniony antygen na 5 minut, a następnie dobrze wywirować przed użyciem. 3
2. Napełnianie płytki żelowej Przygotować dwie serie roztworu próbki pacjenta w soli fizjologicznej 0,85%. Napełnić dołki płytki żelowej antygenem (około 80 µl), kontrolą (około 80 µl) oraz roztworami próbki pacjenta (około 80 µl), jak przedstawiono. Wartości napełniania nie są krytyczne, jednak NIE NALEŻY PRZEPEŁNIAĆ DOŁKÓW. Kontrola może być napełniona bezpośrednio z plastikowych gruszek laboratoryjnych lub mikropipet. W przypadku używania gruszek laboratoryjnych należy umieścić końcówkę dozownika w dołku i delikatnie ścisnąć, aby poziom kontroli zbliżył się do górnej krawędzi dołka. Przykryć płytkę natychmiast po napełnieniu. 3. Inkubacja Pozostawić przykryte płytki do inkubacji w temperaturze pokojowej na stabilnej płaskiej powierzchni na 24 godziny. Sprawdzić płytki i zwrócić uwagę na linie precypityny, które powstają pomiędzy próbką od pacjenta a antygenem. Sprawdzić powiązanie tej linii z linią precypityny jednej z kontroli. Ponownie sprawdzić płytki po 48 godzinach, aby przed końcową interpretacją wyników ustalić, czy powstały nowe linie. Kontrola jakości Kontrola Sm oraz/lub RNP powinna być umieszczona na każdej płytce w celu zapewniania, aby wszystkie odczynniki i zabiegi zostały przeprowadzone prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze -70 o C. Aby wyniki testów były traktowane jako wiążące, linia precypityny musi być widoczna pomiędzy kontrolami Sm oraz/lub RNP i dołkami antygenu Sm/RNP. Interpretacja wyników W celu uzyskania optymalnej analizy linii precypityny zalecane jest zastosowanie poniższej procedury: 1. Zdjąć pokrywę płytki. 2. Przytrzymać płytkę w takiej pozycji, aby maksymalnie ograniczyć odbicie powierzchni żelu. 3. Podświetlić płytkę żelową z boku (np. równolegle do powierzchni żelu). Uwaga: Należy zwrócić uwagę, aby źródło światła było zasłonięte przed bezpośrednim widokiem. 4. Linie precypityny są najlepiej widoczne, gdy są umieszczone na ciemnym tle i oglądane pod kątem. 5. Szkło powiększające może pomóc w obserwacji mniej widocznych linii lub w celu rozróżniania niezidentyfikowanych próbek. Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli po 48 godzinach nie ma żadnych widocznych linii precypityny pomiędzy dołkami pacjenta oraz dołkami antygenu. Interpretacja swoistości. W przypadku podwójnej dyfuzji swoistość jest określana poprzez porównanie relacji linii precypityny próbki z liniami znanej kontroli. W przypadku testu NOVA Gel Sm/RNP występują następujące możliwości: 4
Rys. 1: Brak identyfikacji Rys. 2: Tożsamość Sm Linia precypityny przechodzi lub wykazuje brak tożsamości z kontrolami Sm i RNP. Wskazuje to na to, że pacjent reaguje z antygenem ENA innym niż Sm lub RNP. Rys. 3: Tożsamość RNP Linia precypityny pacjenta łączy się lub wskazuje tożsamość z linią kontroli Sm. W tym przypadku pacjent ma przeciwciała przeciwko Sm. Miano próbki jest takie samo jak odwrotność najwyższego rozcieńczenia, które tworzy linię precypityny z antygenem. W tym przypadku można stwierdzić, że pacjent ma przeciwciała przeciwko Sm i miano 8. Rys. 4: Tożsamość Sm i RNP Linia precypityny pacjenta łączy się lub wskazuje tożsamość z linią kontroli RNP. W tym przypadku można stwierdzić, że pacjent ma przeciwciała przeciwko RNP i miano 4. Należy zwrócić uwagę na gniazdo z kontrolą Sm. Jest to brak tożsamości dla Sm. Przedstawia częściową tożsamość z częścią RNP kontroli Sm. Pacjent ma dwie linie precypityny. Jedna z linii przedstawia tożsamość z Sm, a druga przedstawia tożsamość z RNP. W tym przypadku można stwierdzić, że pacjent ma przeciwciała przeciwko Sm i RNP z mianem Sm wynoszącym 2 oraz z mianem RNP wynoszącym 4. 5
Ograniczenia badania 1. Chociaż jest to mało prawdopodobne w przypadku tego testu z powodu serii rozcieńczeń próbki, to prozoning jest możliwy. Efekt prozone zachodzi, gdy występuje przytłaczająca ilość autoprzeciwciał pacjenta w stosunku do antygenu (nadmiar przeciwciał), skutkiem czego linia precypityny powstaje przy krawędzi dołka antygenu. W takich przypadkach zalecane jest ponowne testowanie możliwych pozytywnych próbek przy wyższym rozcieńczeniu w celu wyeliminowania fałszywej negatywnej interpretacji testu. 2. Jeśli do uwadniania antygenu używana jest niejałowa lub zanieczyszczona woda, antygen może wykazywać natychmiastową lub progresywną degradację. W takim przypadku może pojawić się bardzo delikatna linia precypityny lub może nie pojawić się w ogóle. 3. Kontrola Sm nie jest monoswoista i może zawierać pewne RNP. Kontrola Sm przedstawi częściową tożsamość z pacjentem RNP lub kontrolą. 4. Można będzie zauważyć gniazdo, które wskazuje na dołek kontroli RNP z surowicą, która wykazuje tożsamość z kontrolą Sm. Może to oznaczać obecność przeciwciał RNP w surowicy pacjenta przeciwko Sm. 5. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami serologicznymi. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. Spodziewane wartości Test podwójnej dyfuzji NOVA Gel Sm/RNP został użyty do oszacowania różnorodności pacjentów z chorobami tkanki łącznej oraz 200 losowo wybranych dawców krwi. Wyniki znajdują się poniżej: Grupa pacjentów Numer Test NOVA Gel ENA na liczbę pozytywnych Pozytywne Sm Pozytywne RNP SLE 105 15 20 Toczeń polekowy 24 0 0 Reumatoidalne zapalenie stawów 40 0 0 Twardzina 24 0 1 Zapalenie skórno-mięśniowe 14 0 1 Zespół Sjogrena 14 0 1 Normalne 200 0 0 6
Piśmiennictwo 1. Tan E. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. 2. Tan E, et al. The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25:1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ, Myers LL. Significance of antibody to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7:379-390, 1964. 4. Reichlin M, Maddison PJ. Soluble tissue autoantigens which precipitate with sera of patients with connective tissue diseases. In Immunopathology of the Skin, 2nd ed. (EH Beutner, TP Chorzelski, SF Bean, eds) John Wiley and Sons, NY, pp 351-362, 1979. 5. Reichlin M, Mattioli M. Correlation of a precipitin reaction to an RNA protein antigen and a low prevalence of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 286:908-911, 1972. 6. Barada FA, Andrews BS, Davis JS, Taylor RP. Antibodies to Sm in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 24:1236-1244, 1981. 7. Winn DM, Wolfe JF, Lindberg DA, Fristoe FH, Kingsland L, Sharp GC. Identification of a clinical subset of systemic lupus erythematosus by antibodies to the Sm antigen. Arthritis and Rheumatism 22:1334-1337, 1979. 8. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Prog Allergy 5:1, 1958. 9. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999 Fourth Edition (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 7
NOVA Gel jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628415POL Merzec 2011 Wersja 0 8