diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number 2 199-203 Praca poglądowa Review Article Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych Diagnostics of autoimmune diseases of liver and bile ducts Marcin Komorowski, Joanna Cielecka-Kuszyk, Kazimierz Madaliński Pracownia Immunopatologii Zakażeń Hepatotropowych Zakładu Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny, Warszawa Streszczenie Schorzenia autoimmunizacyjne stanowią grupę chorób, u podłoża których leży proces nazywany autoimmunizacją. Polega on na wytwarzaniu przez układ odpornościowy - limfocytów T, limfocytów B i/lub przeciwciał (tzw. autoprzeciwciał) skierowanych przeciw własnym antygenom organizmu. Autoprzeciwciała wykrywane i różnicujące choroby autoimmunizacyjne wątroby i dróg żółciowych są następujące: ANA, ASMA (anty-sma), anty-lkm, AMA, anty-sla/lp, LC-1 oraz ANCA (panca, canca). Do chorób typu autoimmunizacyjnych zaliczamy: autoimmunizacyjne zapalenie wątroby typu I, II i III (AIH I, II, III), pierwotną żółciową marskość wątroby (PBC) oraz pierwotne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych (PSC). Podstawową metodą diagnostyki chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych jest immunofluorescencja pośrednia (IIF). Komercyjnymi testami, powszechnie stosowanymi, są gotowe zestawy produkowane m.in. przez firmę EUROIMMUN. W Zakładzie Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego-PZH stosuje się własną metodę diagnostyczną, którą opisano w tekście. W artykule przedstawiono szczegółową specyfikację wymienionych testów. Inną metodą, stosowaną w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych, jest immunoblotting. Summary Autoimmune diseases belong to the group of chronic disorders characterized by the process called autoimmunisation. The reaction of the immune system consists of the production of T and B lymphocytes and the release of autoantibodies directed against the own antigens of the patient. The following autoantibodies are characteristic for the autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile ducts: ANA, ASMA (anti-sma), anti-lkm, AMA, anty-sla/lp, LC-1 and ANCA (panca, canca). By use of these autoantibodies, the differential diagnosis of autoimmune hepatitis type I, II, III (AIH I, II, III), primary biliary cirrhosis (PBC) and primary sclerosing cholangitis (PSC) can be made. The main diagnostic method for the autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile duct is the indirect immunofluorescence test (IIF). Common commercial methods are ready to use tests produced by EUROIMMUN (Germany). At the Department of Virology, National Institute of Public Health, we have developed our own diagnostic test for IIF. In this article we compare the results of both tests. Another diagnostic method for the autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile ducts is immunoblotting. Słowa kluczowe: autoprzeciwciała, autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, choroby autoimmunizacyjne wątroby i dróg żółciowych, immunofluorescencja pośrednia, pierwotne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych (PSC), pierwotna żółciowa marskość wątroby (PBC) Key words: autoantibodies, autoimmune hepatitis, autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile ducts, indirect immunofluorescence test (IIF), primary sclerosing cholangitis (PSC), primary biliary cirrhosis (PBC) Podziękowanie. Praca częściowo finansowana z grantu badawczego NN 405 132539 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego. 199
Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych Wstęp Schorzenia autoimmunizacyjne stanowią grupę chorób, u podłoża których leży proces nazywany autoimmunizacją. Polega on na wytwarzaniu przez układ odpornościowy, limfocytów T, B i/lub przeciwciał (tzw. autoprzeciwciał) skierowanych przeciw własnym antygenom organizmu. Poniżej przedstawiono autoprzeciwciała wykrywane w chorobach autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych: 1. ANA - przeciwciała przeciwjądrowe, w tym anty-sp100 - przeciwciała przeciw białkom wewnątrzjądrowym oraz anty-gp210 - przeciwciała przeciw białkom tzw. obręczy jądrowej, 2. ASMA (anty-sma) - przeciwciała przeciw mięśniom gładkim, 3. anty-lkm - przeciwciała przeciw mikrosomom wątroby i nerki, 4. AMA (MIT) - przeciwciała przeciwmitochon drialne, typ AMA-M2, 5. anty-sla/lp - przeciwciała przeciw rozpuszczalnym antygenom komórek wątroby i trzustki, 6. LC-1 - przeciwciała przeciwcytozolowe, 7. ANCA (panca, canca) - przeciwciała przeciw cytoplazmie granulocytów (okołojądrowe i cytoplazmatyczne). Autoprzeciwciała te są podstawą różnicowania chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych na następujące typy: 1. Autoimmunizacyjne zapalenie wątroby (AIH): charakteryzuje się przewlekłym procesem zapalnym o nieznanej etiologii, obecnością w surowicy autoprzeciwciał skierowanych przeciwko różnym antygenom struktur tkankowych, podwyższonym poziomem immunoglobulin [1]. Wyróżniamy trzy typy choroby: AIH typu I, dla którego charakterystyczne jest występowanie przeciwciał ANA i/lub ASMA. Przeciwciała ASMA skierowane są głównie przeciwko F-aktynie [1]. AIH typu II, w przypadku którego występują przeciwciała anty-lkm. Wyróżniamy trzy rodzaje przeciwciał anty -LKM: LKM1, LKM2, LKM3. Dla AIH typu II typowe są przeciwciała anty-lkm1 (ich obecność można również wykazać w przypadku zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C). Często też wykrywa się obecność przeciwciał anty-sla/lp, LC-1 [2, 3]. AIH typu III, o przebiegu klinicznym podobnym do AIH typu I oraz charakteryzujące się obecnością przeciwciał anty-sla/lp [2, 3]. 2. Pierwotna żółciowa marskość wątroby (primary biliary cirrhosis, PBC): jest to choroba przewlekła charakteryzująca się niszczeniem drobnych wewnątrzwątrobowych przewodzików żółciowych i towarzyszącą cholestazą. Choroba ta może prowadzić do przewlekłej niewydolności wątroby i marskości. Dla rozpoznania PBC wykorzystywana jest ocena histopatologiczna biopsji wątroby oraz obecność przeciwciał przeciwmitochondrialnych (AMA). W przypadku PBC przeciwciała AMA są swoiste względem podjednostki E2 kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej M2 (przeciwciała AMA M2) [1]. Obiecującymi markerami PBC są również przeciwciała ANA, których docelowymi antygenami są białka wewnątrzjądrowe (intra-nuclear protein, anti-sp100) oraz białka obręczy jądrowej (nuclear rim pore protein, anti-gp210) [4]. 3. Pierwotne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych (primary sclerosing cholangitis, PSC): jest to choroba przewlekła charakteryzująca się uszkodzeniem nabłonka dróg żółciowych z następową reakcją zapalną i włóknieniem okołoprzewodowym. W przebiegu tej choroby mogą występować przeciwciała ANA i ASMA. Cechą charakterystyczną jest także występowanie przeciwciał panca, których antygenem docelowym jest łańcuch 5 beta-tubuliny (TBB5) [4]. Immunofluorescencja pośrednia (IIF) - podstawowa metoda diagnostyczna chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych 1. Zasada metody Immunofluorescencja pośrednia polega na inkubacji skrawków mrożonych odpowiednich tkanek lub rozmazów hodowli komórkowych (stanowiących docelowy antygen) z surowicą pacjentów. W przypadku dodatniej reakcji autoprzeciwciała odpowiedniej klasy (IgA, IgG lub IgM) wiążą się z antygenem. Następnie, powstały kompleks antygen-przeciwciało uwidacznia się za pomocą przeciwciał anty-ludzkich znakowanych fluoresceiną i ocenia się charakterystyczny wzór świecenia przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego. 2. Rodzaje stosowanych testów 2.1. Test komercyjny Zestawy gotowych testów, produkowane m.in. przez firmę EUROIMMUN, które oparte są na technologii BIOCHIP. Technologia ta polega na opłaszczeniu szkiełek nakrywkowych komórkami, wycinkami tkanek i innymi substancjami biologicznymi, które są następnie cięte na milimetrowej wielkości fragmenty (BIOCHIP y). Te z kolei są przyklejane przez komputerowo sterowane automaty do szkiełek podstawowych. Dzięki temu, jest możliwość umieszczenia na jednym polu reakcyjnym obok siebie kilku BIOCHIP ów pokrytych różnymi substratami i ich jednoczesną inkubację z tą samą próbką surowicy (mozaika BIOCHIP ) [5]. W przypadku diagnostyki chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych stosuje się następujące zestawy: panel wątrobowy: test LIVER MOSAIC 8 (EUROIM- MUN); Mozaika BIOCHIP składająca się z 6 substratów - ludzkich komórek nabłonkowych (HEp-2), wątroby małpy, nerki szczura, wątroby szczura, żołądka szczura oraz komórek linii VSM47 anty-aktyna) [5]. panel do wykrywania przeciwciał anty-lkm: test LI- VER MOSAIC 1 (nerka szczura/żołądek szczura) (EUROIMMUN); Mozaika BIOCHIP składa się z 2 substratów: nerka oraz wątroba szczura [5] panel do wykrywania przeciwciał przeciwko granulocy- 200
tom (canca, panca): test Granulocyte Mosaic 3 (EU- ROIMMUN); jest to mozaika BIOCHIP zawierająca granulocyty utrwalone etanolem i formaldehydem, wątrobę małpy i komórki HEp-2 [5]. 2.1.1 Potrzebny materiał biologiczny Surowica pacjenta (100μl), którą należy przechowywać w 2-8 C do 14 dni lub w -20 C do 6 mies. 2.1.2 Aparatura mikroskop fluorescencyjny, płytki reakcyjne, przeznaczone do nanoszenia reagentów (dostarczane przez producenta), zestaw pipet automatycznych regulowanych, szklany kominek bądź kuweta do płukania. 2.1.3 Wymagane odczynniki 10 płytek mikroskopowych, każda z 5 polami (na każdym polu umieszczone są BIOCHIPy ze skrawkami mrożonymi odpowiednich tkanek lub rozmazami hodowli komórkowych), 1,5 ml znakowanej fluoresceiną anty-ludzkiej IgG lub IgM lub IgA, gotowej do użycia, 0,1 ml pozytywnej surowicy kontrolnej; gotowej do użycia, 0,1 ml pozytywnej surowicy; gotowej do użycia, 0,1 ml negatywnej surowicy kontrolnej (negatywna wobec przeciwciał); gotowej do użycia, 2 opakowania soli do przygotowania buforu fosforanowego ph 7,2; każde należy rozpuścić w 1 litrze wody destylowanej, 2 x 2,0 ml Tween 20 (zmieszać z buforem fosforanowym: 2 ml na 1 litr), 3,0 ml środka pokrywającego (gliceryna z buforem fosforanowym ph 8,4), 12 szkiełek nakrywkowych (62 mm x 23 mm) [5]. 2.1.4 Opis postępowania analitycznego próbki surowicy pacjenta należy rozcieńczyć buforem fosforanowym (PBS-Tween), zgodnie z protokołem, surowice kontrolne (pozytywne i negatywne) należy zamieszać pipetą przed użyciem, 25 µl rozcieńczonej surowicy pacjenta i surowic kontrolnych należy nanieść na każde pole reakcyjne płytki reakcyjnej (unikać pęcherzyków powietrza), płytki BIOCHIP umieścić w wycięciach płytek reakcyjnych, inkubować 30 min. w temperaturze pokojowej, po inkubacji płytki BIOCHIP należy spłukiwać strumieniem buforu fosforanowego i natychmiast wkładać je do kuwety z buforem (PBS-Tween) na 1 min., po umyciu płytki reakcyjnej, nanieść na jej pola reakcyjne 20 µl (uprzednio rozcieńczonej według protokołu) surowicy anty-ludzkiej znakowanej fluoresceiną (konjugatu), płytkę BIOCHIP wyjętą z kuwety z PBS-Tween (po osuszeniu papierową chusteczką tylnej powierzchni i brzegów) należy umieścić w wycięciach płytki reakcyjnej, tak by BIOCHIPy zanurzyły się w kroplach, inkubować 30 min. w temperaturze pokojowej, po inkubacji płytki BIOCHIP należy spłukać strumieniem buforu fosforanowego i natychmiast włożyć do kuwety ze świeżym buforem na 1 min., środek pokrywający należy nakroplić na szkiełka nakrywkowe, płytkę BIOCHIP wyjąć z kuwety (osuszyć papierową chusteczką tylną jej powierzchnię, brzegi i powierzchnię dookoła) i umieścić BIOCHIPami skierowanymi ku dołowi na przygotowane szkiełko nakrywkowe [5]. 2.1.5 Interpretacja wyniku a) Preparaty ocenia się w mikroskopie fluorescencyjnym. W przypadku braku różnicy pomiędzy obrazem preparatu inkubowanego z negatywną surowicą kontrolną a surowicą pacjenta stwierdza się brak poszukiwanych autoprzeciwciał. W przypadku obecności autoprzeciwciał obserwuje się charakterystyczny obraz fluorescencji elementów komórkowych substratu, który porównuje się z pozytywną surowicą kontrolną. Dla poszczególnych autoprzeciwciał obserwuje się następujące wzory fluorescencji: ANA: charakterystyczne świecenie komórek Hep-2 (Ryc. 1) oraz wątroby małpy [5], Rycina 1 Wykrywanie autoprzeciwciał ANA metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: komórki Hep-2. AMA: obecność AMA charakteryzuje się ziarnistym, cytoplazmatycznym typem fluorescencji na 6 substratach. Standardowym substratem do oznaczania AMA jest nerka szczura, na której obserwowana jest fluorescencja w obrębie pierwszo- i drugorzędowych kanalików nerkowych. W tym przypadku możliwe jest oznaczenie przeciwciał AMA M2, przez zastosowanie odpowiedniego substratu (system EUROPLUS) [5], ASMA: wykazują fluorescencję w obrębie warstwy mięśniowej żołądka szczura (Ryc. 2), warstwy mięśniowej błony śluzowej oraz w warstwie śluzowej żołądka. Przeciwciała ASMA skierowane są głównie przeciwko F-aktynie, które reagują również z cytoszkieletem komórek Hep-2, komórek linii VSM47 oraz z kanalikami żółciowymi wątroby małpy [5], anty-lkm: na substracie wątroby szczura wykazują fluorescencję w obrębie cytoplazmy hepatocytów (Ryc. 3). 201
Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych Rycina 2 Wykrywanie autoprzeciwciał ASMA metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: żołądek szczura. Rycina 5 Wykrywanie autoprzeciwciał panca metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: granulocyty. Na nerce szczura obserwowana jest fluorescencja w obrębie proksymalnych kanalików nerkowych (Ryc. 4) [5], panca: świecenie typu okołojądrowego granulocytów utrwalonych etanolem (gładka fluorescencja otaczająca wstążkowato jądro granulocytu) (Ryc. 5), które jest często trudne do odróżnienia od przeciwciał ANA. W celu ich rozróżnienia stosuje się substrat wątroby małpy (świecenie jąder granulocytów obojętnochłonnych wyraźniejsze niż jąder hepatocytów), komórki nabłonkowe HEp-2 (świecą tylko przeciwciała ANA) oraz granulocyty utrwalone formaldehydem (stłumienie przeciwciał przeciwjądrowych) [5]. b) Kolejnym etapem badania jest ocena miana autoprzeciwciał (ocena półilościowa), czyli takiego rozcieńczenia surowicy, w którym występuje jeszcze charakterystyczna fluorescencja. Wynik oznaczenia uznaje się za dodatni, kiedy miano autoprzeciwciał ANA, AMA, ASMA i anty-lkm jest wyższe niż 1:100, a autoprzeciwciał panca jest wyższe niż 1:10. 2.2. Test opracowany w Zakładzie Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie. Polega ona na własnoręcznym przygotowaniu skrawków mrożonych tkanek (substratów) utrwalonych na szkiełkach podstawowych. Wycinki tkanek wątroby, nerki, trzustki, żołądka oraz jelita pochodzące z sekcji zdrowego szczura uśmierconego po uśpieniu chloroformem (20-30 min. po zatrzymaniu oddychania), układa się w blok o wymiarach ok. 1x1x1 cm. Następnie tak przygotowany blok, ustawiony na powierzchni metalowego kołeczka, pokrytej warstwą 10% roztworu gliceryny w 0.1M roztworze NaCl w buforze fosforanowym, ph 7.2 (PBS), zamraża się przez zanurzenie w eterze naftowym oziębionym do temp. -80 C w mieszaninie suchego lodu i acetonu. Tak przygotowany blok, zawinięty w folię, przechowuje się w temp. -40 C do dalszego użycia. 2.2.1 Potrzebny materiał biologiczny Próbka surowicy pacjenta (100μl), którą należy przechowywać w 2-8 C do 14 dni lub w -20 C do 6 mies. 2.2.2 Aparatura kriostat z mikrotomem pozwalającym uzyskiwać mrożone skrawki o grubości 6 mikronów, krojone w temp. -18 C, mikroskop fluorescencyjny, zestaw pipet automatycznych regulowanych, komora wilgotna (pudełko plastikowe wyłożone wilgotną bibułą), szklany kominek bądź kuweta do płukania. 2.2.3 Wymagane odczynniki i materiały chloroform; wymagany do uśpienia szczura, eter naftowy, suchy lód i aceton; wymagane do przygotowania łaźni lodowej w celu zamrożenia bloków tkankowych, szkiełka podstawowe (76mmx26mm), Rycina 3 Wykrywanie autoprzeciwciał anty-lkm metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: wątroba szczura. Rycina 4 Wykrywanie autoprzeciwciał anty-lkm metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: nerka szczura. 202
szkiełka nakrywkowe (22mmx22mm), 0.1M roztwór NaCl w buforze fosforanowym, ph 7.2 (PBS), poliklonalne przeciwciała anty-ludzkie IgA, IgM, IgG, kappa, lambda znakowane izotiocjanianem fluoresceiny (FITC), 10% roztwór gliceryny w PBS. 2.2.4 Opis postępowania analitycznego skrawki tkankowe mrożone, po skrojeniu w kriostacie, należy nanieść na szkiełka podstawowe i suszyć w temperaturze pokojowej przez 30 min., następnie utrwalić w acetonie przez 20 min., na tak przygotowane preparaty należy nanieść odpowiednio rozcieńczoną surowicę pacjenta (1:40 w PBS) w ilości 400µl, jako kontrolę negatywną należy stosować skrawek inkubowany w normalnej surowicy ludzkiej odpowiednio rozcieńczonej (1:40 w PBS) w ilości 400µl, inkubować w komorze wilgotnej przez 45 min. w temperaturze pokojowej, po inkubacji preparaty przenieść do kuwety szklanej wypełnionej buforem PBS i płukać 3 razy po 10 min. (za każdym razem bufor PBS należy wymienić na świeży), po osuszeniu obrzeża skrawków na szkiełku, nanieść 100µl przeciwciał anty-ludzkich znakowanych FITC w odpowiednim rozcieńczeniu (1:100 w PBS), inkubować w komorze wilgotnej przez 30 min. w temperaturze pokojowej bez dostępu światła, po inkubacji szkiełka przenieść do kuwety szklanej wypełnionej buforem PBS i płukać 3 razy po 5 min. (za każdym razem bufor PBS należy wymienić na świeży), po osuszeniu obrzeża skrawków na szkiełko należy nanieść kroplę 10% glicerolu w PBS i pokryć szkiełkiem nakrywkowym (nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem), do czasu oceny preparaty przechowywać w lodówce. 2.2.5. Interpretacja wyniku a) Preparaty ocenia się w mikroskopie fluorescencyjnym. W przypadku braku różnicy pomiędzy obrazem preparatu inkubowanego z negatywną surowicą kontrolną a surowicą pacjenta stwierdza się brak poszukiwanych autoprzeciwciał. W przypadku obecności określonych autoprzeciwciał obserwuje się charakterystyczny obraz fluorescencji elementów komórkowych substratu: ANA: świecenie jąder wszystkich elementów komórkowych na wszystkich substratach, ASMA: świecenie cytoplazmy komórek mięśni gładkich (również warstwy mięśniowej tętniczek) wszystkich substratów. W przypadku żołądka obserwujemy również nieswoiste świecenie błony śluzowej i mięśniowej, AMA: charakterystyczny ziarnisty, cytoplazmatyczny typ fluorescencji nerki, wątroby oraz trzustki szczura. W przypadku nerki, obserwuje się fluorescencję w obrębie kanalików nerkowych, natomiast w przypadku trzustki komórek gruczołów wydzielania zewnętrznego i wewnętrznego. Cechą charakterystyczną jest również świecenie cytoplazmy komórek okładzinowych błony śluzowej żołądka (APCA). Stwierdzenie obecności APCA jest pomocne w różnicowaniu pomiędzy AMA i anty- LKM. Test nie pozwala na określenie swoistości przeciwciał względem antygenu M2, co wymaga potwierdzenia innym testem (np. testem EUROIMMUN), anty-lkm: charakterystyczne, cytoplazmatyczne świecenie kanalików nerkowych i hepatocytów. Nie obserwujemy świecenia cytoplazmy komórek okładzinowych APCA i cytoplazmy trzustki, co ułatwia różnicowanie z przeciwciałami AMA, b) Kolejnym etapem badania jest ocena miana autoprzeciwciał (ocena półilościowa), czyli takiego rozcieńczenia surowicy, w którym występuje jeszcze charakterystyczna fluorescencja. Wynik oznaczenia uznaje się za dodatni, kiedy miano autoprzeciwciał ANA, AMA, ASMA oraz anty-lkm jest wyższe niż 1:80. Immunoblotting - inna metoda stosowana w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych. W metodzie tej stosuje się specjalne paski testowe z naniesionymi w postaci linii, wysoko oczyszczonymi antygenami. W pierwszym etapie paski membrany inkubuje się z rozcieńczoną surowicą pacjenta. W pozytywnych przypadkach swoiste przeciwciała klasy IgG (również IgA i IgM) wiążą się z odpowiednimi antygenami. Podczas drugiego etapu inkubacji reagują z nimi sprzężone z enzymem przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim immunoglobulinom klasy IgG (koniugat enzymatyczny). Enzym katalizuje następnie reakcję barwną z roztworem substratu. Pozwala ona na analizę rozszerzonego panelu przeciwciał, m.in.: AMA M2, anty-lkm1, anti-sp100, anti-gp210, SLA/ LP, LC-1. W tym celu stosuje się zestawy komercyjne, np. produkowane przez firmę EUROIMMUN, nazywane EURO- LINE [5]. Piśmiennictwo 1. Bogdanos D, Invernizzi P, Mackay I, et al. Autoimmune liver serology: Current diagnostics and clinical challenges. World J Gastroenterol 2008; 14: 3374-3387. 2. Krawitt EL, Clinical features and management of autoimmune hepatitis. World J Gastroenterol 2008; 14: 3301-3305. 3. Mieli-Vergani G, Vergani D, Autoimmune hepatitis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011; 8:320-9. 4. Czaja A, Autoantibodies as prognostic markers in autoimmune liver disease. Dig Dis Sci 2010; 55:2144 2161. 5. www.euroimmun.pl Zaakceptowano do publikacji: 05.03.2012 Adres do korespondencji: Prof. dr hab. med. Kazimierz Madaliński 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24 tel. +48 22 5421326, fax:+48 22 5421237 e-mail: kmadalinski@pzh.gov.pl; mkomorowski@pzh.gov.pl 203