PL 213132 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 213132 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 367760 (22) Data zgłoszenia: 06.05.2004 (51) Int.Cl. A61K 31/662 (2006.01) A61K 31/198 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Zastosowanie związków 2-amino-1-hydroksyalkanofosfonowych (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: 14.11.2005 BUP 23/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2013 WUP 01/13 (72) Twórca(y) wynalazku: MARCIN DRĄG, Świdnica, PL ANNA MARCINKOWSKA, Radwanice, PL JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Halina Winohradnik
2 PL 213 132 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związków 2-amino-1-hydroksyalkanofosfonowych i ich pochodnych do wytwarzania leku. przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia choroby nowotworowej płuc. Choroby nowotworowe a szczególnie nowotworowe guzy lite są ciągle wiodącą przyczyna śmierci na świecie. Konwencjonalne metody leczenia chorób nowotworowych obejmują metody chirurgiczne, podawanie pacjentowi związków chemioterapeutycznych i ostatnio wprowadzone metody immunologiczne, które polegają na podawaniu przeciwciał lub ich fragmentów połączonych z molekułami leku np. radioizotopami. W organizmie ludzkim, każdej doby powstaje 10 11-10 12 nowych komórek, w kodzie genetycznym każdej z takich komórek jest zaprogramowana umiejętność' do popełnienia samobójstwa. Proces taki nazywany jest apoptozą, inaczej zaprogramowana śmiercią komórki. Komórki nowotworowe na wskutek mutacji genetycznych utraciły zdolność do apoptozy, dlatego rosną bez ograniczeń prowadząc do śmierci organizmu. Ze zgłoszenia PCT/US98/03911 znany jest sposób terapeutycznego indukowania apoptozy w aktywowanych komórkach zapalnych lub w komórkach w miejscu stanu zapalnego poprzez wprowadzenie do tych komórek genu chimerycznego, obejmującego gen indukujący apoptozę kierowany przez promotor indukowanego genu, aktywowanego w stanie zapalnym oraz sekwencję wzmacniającą promotor. W zgłoszeniu PCT/FR96/01568 ujawniono zastosowanie co najmniej jednego agonistycznego ligandu specyficznego dla receptorów typu RAR-. Z innego opisu według zgłoszenia PCT/US97/11564 znane są związki retinoidowe, zawierające grupę adamantylową lub pochodną grupy adamantylowej, wywołujące apoptozę komórek rakowych. Większość leków przeciwnowotworowych w różny sposób i z różną skutecznością indukuje apoptozę komórek rakowych i tym samym eliminuje je z organizmu. Mechanizmy tych procesów w większości przypadków są słabo poznane albo wręcz nieznane. Każdy związek zdolny do indukowania apoptozy jest potencjalnym i cennym lekiem przeciwnowotworowym. Kwasy 2-amino-1-hydroksyalkanofosfonowe i ich pochodne są związkami znanymi w literaturze naukowej i patentowej. Można je otrzymać jedną z metod opisanych w literaturze naukowej (M. Drąg i inni w Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, 1837 lub A.E. Wróblewski i inni w Tetrahedron: Asymmetry, 2001. 12. 2977). Nie są znane żadne biologiczne własności kwasów 2-amino-1-hydroksyalkanofosfonowych. Co za tym idzie, brak jest w literaturze naukowej i patentowej jakichkolwiek wzmianek o ich zdolnościach do indukcji apoptozy komórek nowotworowych. Istotą wynalazku jest zastosowanie związków 2-amino-1-hydroksyalkanofosfonowych o wzorze ogólnym 1, w którym W oznacza naturalny aminokwas w postaci fenyloalaniny lub wodór, R oznacza podstawnik metylowy, metylopropyiowy lub butylowy, a X 1 oraz X 2 jest taki sam i oznacza H lub alkil C 1 do C 2, do wytwarzania leku stosowanego w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby nowotworowej płuc, jako substancji czynnej do wywoływania apoptozy komórek rakowych. Związki będące przedmiotem wynalazku, przeznaczone są do otrzymywania leków, stosowanych w leczeniu raka płuc zarówno drobnokomórkowego jak również niedrobnokomórkowego. Dawki są uzależnione od stanu pacjenta, rodzaju związku, a także od towarzyszącej terapii innymi lekami. Efektywną dawką terapeutyczną dobraną na hodowli komórek rakowych in vitro, jest dawka wystarczająca do indukcji apoptozy komórek rakowych, która zawiera się w granicach od 0,01 mg/kg do 200 mg/kg masy ciała pacjenta, korzystnie w trzech dawkach dziennie. Zdolność do indukcji apoptozy czyni związki będące przedmiotem wynalazku szczególnie przydatnymi w leczeniu guzów litych i zaawansowanych form nowotworów, które nie mogą być leczone na drodze konwencjonalnych metod. W leczeniu chorób nowotworowych płuc związki będące przedmiotem wynalazku, mogą być podawane pacjentowi poprzez każdą farmaceutycznie akceptowalną drogę np. doustnie lub dożylnie, podskórnie lub miejscowo. Związki będące przedmiotem wynalazku mogą być użyte do wytwarzania leków, przeznaczonych do leczenia nowotworów pęcherza, mózgu, karku i głowy, nerek, czerniaka złośliwego, raka jajników, trzustki, prostaty, macicy, skóry, wątroby, jelita grubego, piersi i różnych form białaczki. Zdolność związków według wynalazku do wywoływania apoptozy komórek rakowych przetestowano na komórkach nowotworowych ludzkich z linii limfoblastycznej (Limphoma) chłoniaka T komórkowego - Jurkat rosnących w toni medium i epitelialnej raka płuc (Lung carcinoma) - A549 przylegających
PL 213 132 B1 3 w hodowli do podłoża. zdeponowanych w pracowni hodowli komórkowych Zakładu Biochemii Lekarskiej Akademii Medycznej we Wrocławiu. Charakterystyka poszczególnych linii wraz z danymi literaturowymi, została przedstawiona w opisach poniżej: Linia komórkowa typu JURKAT: Typ komórki - ludzka T komórka leukemiczna DSMZ numer ACC 282. Pochodzenie: krew 14 letniego chłopca z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL) z pierwszym nawrotem w roku 1976; często ten typ komórek jest nazywany JM (JURKAT oraz JM pochodzą od tego samego pacjenta i są klonami siostrzanymi), czasami JM może być subklonem o rozbieżnych cechach. Literatura: Schneider et al.. Int. J. Cancer 19: 621-626 (1977) Deponent komórek: Dr. Jun Minowada. Fujisaki Cell Center, Okayama, Japan. Dane o typie komórek: morfologicznie okrągłe komórki rosnące pojedynczo lub w gromadach w Medium 90% RPMI 1640 H 10% FBS + 2 mm L-glutamine. Subkulturowe optymalne tempo podziału wynosi 1:2 do 1:3 w ciągu każdych 2-3 dni; zawartość po rozmrożeniu około 1 x 10 6 komórek/ml; utrzymuje się na poziomie 0,5-1,5 x 10 6 komórek/ml. Inkubacja przy 37 C w atmosferze 5% CO 2 Czas duplikacji (podwojenia ilości) 25-35 godzin. Maksymalna gęstość przy zbiorze 1,5 x 10 6 komórek/ml. Przechowywanie w zamrożeniu w 70% medium, 20% FBS, 10% DMSO przy ilości 5 x 10 6 komórek/ampułkę. Ludzka linia komórkowa typu A549, kaukaska, rak płuc, ECACC 86012804. Pochodzenie komórek - 58 letni mężczyzna rasy kaukaskiej. Komórki mogą syntezować lecytynę używając cytydynową difosfocholinową ścieżkę metaboliczną. Czasami komórki mogą zawierać ciała inkluzyjne, jednakże nie posiadające żadnych ludzkich patogenów. Morfologia: Epiteliczny, ludzki, kaukaski rak płuc. Deponent: ATCC, USA. Szczególne właściwości i zawartość: Lecytyna, duże stężenia nienasyconych kwasów tłuszczowych (ECACC, Salisbury, Wiltshire). Subkulturowe optymalne tempo podziału wynosi 1:3 do 1:6 przy posiewie w ilości 2-4 x 10,000 komórek/cm 2 używając 0,25% trypsyny lub trypsyny/edta; 5% CO 2 ; 37C. Kariotyp: Hypotryploidalny. Medium hodowlane: Dla linii Jurkat używano medium RPMI-1640 (R8758) firmy Sigma z dodatkiem 10% FBS (Fetal Bovine Serum) firmy Cambrax., dla linii A549 stosowano medium MEM (Minimum Essential Medium Eagle M2279) firmy Sigma z suplementacją 0,292 g/l L-glutaminą i 10% FBS firmy Cambrax. Warunki hodowli: hodowle komórkowe prowadzono w temp. 37 C w atmosferze 5% CO 2. W celu odklejenia komórek linii A549 o podłoża stosowano trypsynizację używając 0,25% Trypsin-EDTA solution (T4049) firmy Sigma. Poniższe przykłady mają na celu lepsze objaśnienie wynalazku, ale w żadnej mierze nie ograniczają jego zakresu. P r z y k ł a d I Związkiem w postaci kwasu 2-amino-1-hydroksy-4-metylopentano-fosfonowego w stężeniach 50 μμ i 250 μμ, traktuje się hodowle komórek Jurkat, obserwując zahamowanie wzrostu na wskutek apoptozy. Przygotowuje się hodowle komórkowe linii Jurkat tej samej liczebności wyjściowej zawieszonych w toni, w objętości 0,9 ml, w dołkach (obraz w mikroskopie - pojedyncze, średnio liczne w polu widzenia). Hodowle pozostawia się do zrównoważenia w medium. Po 24 godzinach obraz w polu widzenia mikroskopu taki sam we wszystkich dołkach hodowlanych - tylko komórki żywe, równomiernie rozmieszczone, niezbyt liczne (liczebność nie ogranicza proliferacji). Roztwory wyjściowe - preparaty o stężeniach wyjściowych - 10 mm rozcieńcza się używając medium hodowlanego dla linii Jurkat do stężenie 0,5 mm i filtruje się przez filtry bakteriologiczne a następnie dodaje się do hodowli uzyskując stężenia efektywne 50 μμ i 250 μμ. Efekty zarejestrowano po 48 godzinach i stwierdzono, że indukcja apoptozy przy stężeniu 50 μμ, wynosi 44% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, przy stężeniu 250 μμ - 77% hamowania. P r z y k ł a d II Indukcję apoptozy przebadano z użyciem chlorowodorku 3'-fenyloalanino-3-amino-1-hydroksypropanofosfonianu dimetylowego w komórkach Jurkat sposobem opisanym w przykładzie I. Indukcja apoptozy, mierzona inhibicją wzrostu wynosi przy stężeniu 50 μμ - 61,1% hamowania wzrostu komórek nowotworowych, przy stężeniu 250 μμ - 81,4%. P r z y k ł a d III Test cytotoksyczności wykonuje się w obecności chlorowodorku 3'-fenyIoalanino-3-amino-1- -hydroksypropanofosfonianu dimetylowego. Przygotowano gęste hodowle komórek linii Jurkat. Roztwory wyjściowe o stężeniu - 10 mm rozcieńcza się używając mediów hodowlanych odpowiednio dla
4 PL 213 132 B1 linii Jurkat do stężenie 0,5 mm. Filtruje się przez filtry bakteriologiczne i dodaje do hodowli komórkowych uzyskując stężenia efektywne w hodowlach odpowiednio 31,25 μμ, 62,5 μμ, 125 μμ, 186 μμ i 250 μμ. Hodowle kontynuowano przez 72 godziny. Komórki zebrano ilościowo i testem z MTT oznaczono przeżywalność. Do obliczeń, za 100% przyjęto absorpcję prób kontrolnych gdzie, taka sama ilość komórek jak w próbach badanych, nie była poddawana działaniu wybranych czynników. Wynik testu przedstawiono na wykresie - fig. 1, który jest charakterystyką przeżywalności komórek mierzonej w procentach w zależności od stężenia związku. Wartości na osi rzędnych ustalano poprzez zmianę absorbancji przy długości fali = 595 nm. P r z y k ł a d IV Test cytotoksyczności wykonano w obecności kwasu 2-amino-1-hydroksyheksanofosfonowego metodą opisaną w przykładzie III przy tych samych stężeniach dla komórek linii Jurkat. Dane eksperymentalne przedstawiono na fig. 2. P r z y k ł a d V Test cytotoksyczności wykonano w obecności chlorowodorku 3'-fenyloalanino-3-amino-1-hydroksypropanofosfonianu dimetylowego metodą opisaną w przykładzie III przy tych samych stężeniach dla komórek typu A549. Dane eksperymentalne przedstawiono na fig. 3. P r z y k ł a d VI Test cytotoksyczności wykonano w obecności kwasu 2-amino-1-hydroksyheksanofosfonowego metodą opisaną w przykładzie III przy tych samych stężeniach dla komórek typu A549. Dane eksperymentalne przedstawiono na fig. 4. Zastrzeżenie patentowe Zastosowanie związków 2-amino-1-hydroksyalkanofosfonowych, o wzorze ogólnym 1, w którym W oznacza naturalny aminokwas w postaci fenyloalaniny lub wodór, R oznacza podstawnik metylowy, metylopropylowy lub butylowy, a X 1 oraz X 2 jest taki sam i oznacza H lub alkil C 1 do C 2, jako substancji czynnej wywołującej apoptozę komórek rakowych, do wytwarzania leku, przeznaczonego do zapobiegania i/lub leczenia choroby nowotworowej płuc.
PL 213 132 B1 5 Rysunki
6 PL 213 132 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)