ROLNICTWO MOLEKULARNE Produkcja cytokin w roślinach. Patrycja Redkiewicz Dr Anna Góra-Sochacka Prof. dr hab. Agnieszka Sirko 1
CYTOKINY są to małe cząsteczki (gliko)proteinowe regulujące bardzo różnorodne procesy takie jak proliferacja, różnicowanie czy ruchliwość komórek biorących udział w odpowiedzi odpornościowej oraz komórek hemopoetycznych Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94
PODZIAŁ CYTOKIN Interleukiny Hematopoetyny Chemokiny Interferony Nadrodzina cząsteczek TNF Inne cytokiny Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94
FUNKCJE CYTOKIN Ann. N.Y. Acad. Sci. 1056: 16 29 (2005).
CYTOKINY STOSOWANE JAKO LEKI Cytokiny Interferon-α (INF-α) Interferon-β (INF-β) Interferon-γ (INF-γ) Erytropoetyna-α (EPO-α) Preparaty dostępne jako leki Intron A (Schering Plough) Roferon A (Hoffman La Roche) Betaseron (Bayer) Avonex (Biogen Idec) Actimmune (Intermune Pharma) Eprex (Cilag Jansen) Epogen (Amgen) Procrit (Ortho Biotech) Chronic hepatitis B Chronic hepatitis C Hairy cell leukemia Chronic myeloloid leukemia, Condyloma acuminate, AIDS-related Kaposi s sarcoma Relapsing multiple sclerosis Malignant osteopetrosis Chronic granulomatous disease Anemia due to chronic renal failure, HIV infected patients, chemotherapy, primary bone marrow disorders IL-2 G-CSF GM-CSF Aldesleukin (Novartis) Metastatic renal cell cancer, metastatic melanoma Neupogen Neutropenia (Hoffman La Roche) Leukine /Sargramostin (Bayer) Leukemia, Bone marrow /stem cell transplants Int. J. Mol. Sci. 2011, 12, 3536-3552
PRZEGLĄD LITERATURY (1995-2011)
Cytokina Materiał roślinny Elementy kasety ekspresyjnej Metoda Poziom produkcji Erytropoety na G-CSF zawiesina komórkowa Nicotiana tabacum zawiesina komórkowa N. tabacum GM-CSF zawiesina komórkowa N. tabacum GM-CSF zawiesina komórkowa N. tabacum GM-CSF zawiesina komórkowa Oryza sativa GM-CSF zawiesina komórkowa O. sativa GM-CSF zawiesina komórkowa O. sativa promotor 35S CaMV, terminator 35S CaMV promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz translancji; terminator genu nos promotor 35S CaMV, sekwencja wzmacniająca translację z wirusa TEV, etykieta His, terminator T7 promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, terminator nos promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu, wyciszenie genu kodującego α-amylazę za pomocą RNAi do poziomu 8.2% promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu, wyciszenie genu kodującego cysteinową proteinazę za pomocą RNAi mikrowstrzeli wanie mikrowstrzeli wanie mikrowstrzeli wanie 0.0026% TSP; 25 pg/l 105 μg/l 150 µg/l (wewnątrz kom.); 250 µg/l (wydzielane) 180 780 µg/l 129 mg/l (25% wydzielanych białek) do 280 mg/l do 290 mg/l GM-CSF zawiesina komórkowa O. sativa promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu; współekspresja genu kodującego syntetyczny inhibitor proteaz (spi-ii) mikrowstrzeli wanie do 250 mg/l
GM-CSF liście Saccharum promotor MUbi-1 z kukurydzy i SCubi-9 z trzciny cukrowej mikrowstrzeli wanie 0,02% TSP GM-CSF nasiona N. tabacum promotor gluteiny Gt1, Gt3, peptyd sygnalny gluteiny, terminator nos 0,005-0,03% TSP GM-CSF nasiona O. sativa promotor gluteiny Gt1, peptyd sygnalny gluteiny, terminator nos 1.3% TSP GM-CSF nasiona O. sativa GM-CSF liście Nicotiana benthamiana Promotor gluteiny Gt13a (specyficzny dla endospermy nasion), peptyd sygnalny gluteiny, terminator nos, optymalizacja kodonów wektor pochodna PVX: promotor 35S CaMV, etykieta His wektor wirusowy PVX 0,5-14 μg/ nasiono 0,2-2% TSP IL-2; IL-4 zawiesina komórkowa N. tabacum promotor 35S CaMV, terminator T7 Transformacja 0,09 mg/l 0,45 mg/l
IL-10; IL-4 IL-18 IL-2 IL-10 liście N. tabacum liście N. tabacum bulwy S. tuberosum liście N. tabacum IL-4 liście N. tabacum, bulwy S. tuberosum TNF-α Solanum tuberosum promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, t-cupwzmacniacz translacji, ELP, KDEL, terminator nos promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz translancji, terminator nos promotor patatyny; terminator nos 1. promotor 35S CaMV, etykieta His, peptyd kierujący do chloroplastów oraz kaseta bez etykiety His 2. promotor 35S CaMV, etykieta His; peptyd kierujący do mitochondriów promotor 35S CaMV, sekwencja KDEL kierująca białka na szlak sekrecyjny promotor 35S CaMV, Ω wzmacniacz translancji, sekwencja SEKDEL kierująca białka na szlak sekrecyjny 0,27% TSP (IL-10); 0,086% TSP (IL-4) 0,004 0,051% TSP; 351 ng/g 115 U/mg TSP 1. 7 ng/mg TSP (bez His); 43 ng/mg TSP (z His) 2. brak akumulacji 0,1% TSP w tytoniu; 0,08% TSP w ziemniaku 15 µg/g tkanki
IL-12 liście N. tabacum promotor 35S CaMV, terminator 35S CaMV IL-12 IL-12 liście i owoce Lycopersicon esculentum zawiesina komórkowa N. tabacum promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem, terminator 35S CaMV promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, Ω-wzmacniacz translancji IL-13 liście N. tabacum promotor 35S CaMV z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji; wzmacniacz translacji z wirusa AMV, KDEL, terminator nos Kardiotrof ina-1 liście N. tabacum, chloroplastów IFN-α2b liście N. tabacum, chloroplastów 1. promotor rrn (promotor 16S RNA) i wzmacniacz translacji (5 UTR genu 10 faga T7) 2. promotor psba i wzmacniacz translacji (5 UTR psba) Kaseta ekspresyjna: 5 UTR/HIS/THR/IFNα2b sklonowana w wektorze chloroplastowym pld-ctv mikrowstrzeliw anie mikrowstrzeliw anie 40ng/g 7,3μg/g liści 4,3μg/g owoców 175μg/l 0,15% TSP 1. 0,14 mg/g 2. do 1,14 mg/g 3mg/g, 20% TSP Postępy Biochemii (2009), 55, 85-94
ROŚLINY TRANSGENICZNE: PBJ (2008) 6, 504-515 Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture Protein Expr. Purif. (2008) 61, 117-121 Improvement of recombinant hgm-csf production by suppression of cysteine proteinase gene expression using RNA interference in a transgenic rice culture Plant Mol Biol (2008) 68, 263-275
ROŚLINY TRANSGENICZNE 1. Konstrukcja kasety ekspresyjnej (wybór promotora) 2. Wprowadzenie kasety do wektora binarnego (np.pbinplus) 3. Transformacja Agrobacterium 4. Transformacja tkanki roślinnej Figlerowicz i wsp. 2006, Biotechnologia 3, 53-66 12
Konstrukcja kasety ekspresyjnej (optymalizacja transkrypcji i translacji) Promotory konstytutywne: CaMV35S (x2) Promotory specyficzne-tkankowo: gluteiny Gt1,Gt3, patatyny Promotory indukowane: W tytoniu ekspresja po zerwaniu liści przy ich cięciu (CropTech Corp., USA (promotor MeGA TM ) Promotor genu peroksydazy z wilca ziemniaczanego, po ekspozycji na zranienie lub UV, 30x silniejszy od promotora 35S CaMV wzmacniacze translancji: z wirusa AMV, Ω, t-cup produkcja w liściach: kierowanie do ER (KDEL)
PBJ(2008),6,504-515 A novel platform for biologically active recombinant human interleukin-13 production Funkcje: może być stosowana w leczeniu cukrzycy I typu Roślina: N.tabacum Ekspresja: stabilna, promotor CaMV35S z podwójnym wzmacniaczem transkrypcji, wzmacniacz translancji z wirusa AMV,6xhistag, KDEL Poziom produkcji: 0,15%TSP
Analiza Western blot transgenicznych roślin Deglikozylacja
trawienie trypsyną, ph 8 pepsyna, ph 1.2 pankreatyna, ph 6.8
Badanie aktywności komórki TF-1 oczyszczona IL-13
Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in transgenic rice cell suspension culture Protein Expr. Purif. (2008) 61, 117-121 Roślina: zawiesina komórkowa O.sativa Ekspresja: stabilna, promotor amylazy ryżu, peptyd sygnalny amylazy ryżu; współekspresja genu kodującego syntetyczny inhibitor proteaz (spi-ii) Poziom produkcji: do 250mg/l
Fig. 5 Measurement of hgm-csf accumulation in suspension culture medium Fig.4 Protease activity in suspension culture medium derived from transgenic callus