PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS

19 Human papilloma virus and p53 protein expression in patients with laryngeal squamous cell carcinoma: correlation between human papilloma virus and p53 protein expression 1 1, Agnieszka Korolczuk 3 2 SUMMARY The aim of this study was to determine the expression of p53 and prevalence of HPV infection in laryngeal squamous cell carcinoma, and to analyze relationship between HPV infection and P53 expression. The immunohistochemistry (IHC) staining was used to detect the HPV prevalence and P53 expression in 130 specimens of laryngeal squamous cell carcinoma. P53 nuclear expression was detected in 83 (63.8%) out of 130 in 27.7% using IHC of patients with laryngeal squamous cell carcinoma. There the epidemiological and clinicopathological features. There was no statisti (p=0.02), clinical stage (0.4) and localization (p=0.01) and proved that p53 expression was frequently higher in patients with supraglottic localization and in patients with stage III + IV. Nuclear expression of p53 was detected in 25 (69.4%) out of 36 HPV positive specimens from patients with LSCC. There HPV infection (c 2 = 0.67; p=0.41) A multivariate analysis of survival showed that p53 expression and HPV infection was not an independent prognostic factor in laryngeal cancer In conclusion our observations in the current study suggest that the are no relationship between p53 mutation and HPV infection. P53 expression and or HPV presence are not an independent prognostic factor in patients with LSCC cie, epidemiologia human papillomavirus, p53, laryngeal cancer, epidemiology, survival by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów / adres pocztowy: tel. fax projekt nr N N403 287136. Teoria onkogenezy w nowotworach głowy i szyi rozważana jest jako wieloetapowy proces, w którym biorą udział egzogenne i endogenne (genetyczne, hormonalne, fizyczne, chemiczne i biologiczne wirusowe) czynniki rakotwórcze [12 14, 19]. Skutkiem infekcji HPV jest zmiana w regulacji cyklu komórkowego prowadząca do utraty przez komórkę kontroli nad jej proliferacją. Proces unieśmiertelnienia ludzkich keratynocytów jest związany z wirusem onkoproteiny E6 i E7. Powodują one infekcje i/lub degradują produkty komórkowych genów supresorowych P53 i Rb. Sprzyja to rozregulowaniu cyklu komórkowego oraz pojawieniu się niestabilności chromosomalnej, w wyniku czego dochodzi do złośliwej transformacji komórek [8]. Rola wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) w powstawaniu raka płaskonabłonkowego krtani była rozważana od ponad 20 lat i nadal jest kontrowersyjna [6, 12 14]. Rak krtani jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym wśród nowotworów złośliwych głowy i szyi. Rak płaskonabłonkowy jest najczęstszym nowotworem złośliwym krtani obejmującym około 98% przypadków [2]. Wśród znanych czynników ryzyka zachorowań na raka krtani wymienia się palenie tytoniu i picie alkoholu, szczególnie wysokoprocentowego,

20 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS które to czynniki są uważane za główną przyczynę ponad 90% powstawania i zachorowań na raka krtani. Do czynników ryzyka należą także infekcje wirusowe, stan odżywiania oraz dieta [11, 15]. Celem pracy była analiza metodą immunohistochemiczną ekspresji białka P53 i obecności wirusa HPV u pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani oraz analiza korelacji pomiędzy infekcją wirusem HPV i ekspresją białka P53. Badaniem objęto 130 chorych na raka krtani. Wszyscy chorzy na raka krtani zostali poddani leczeniu operacyjnemu w Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej AM w Lublinie w latach 1999 2002 z powodu raka płaskonabłonkowego krtani. W badanej grupie było 112 (86,2%) mężczyzn i 18 (13,8%) kobiet. Wiek chorych wynosił od 32 78 lat (58,6 ± 9,1 roku). Badanie nie obejmowało chorych wcześniej poddanych chemioterapii i/lub radioterapii. Źródłem danych o chorych były historie chorób badanych pacjentów. Klasyfikację TNM oraz stopień zaawansowania klinicznego procesu nowotworowego przyjęto zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Unii do Walki z Rakiem (UICC). Materiałem do badań immunohistochemicznych były skrawki parafinowe pochodzące z wycinków pobranych w trakcie mikrolaryngoskopii diagnostycznej i wycinków do oceny histopatologicznej guza, w których w badaniu histopatologicznym rozpoznano raka płaskonabłonkowego krtani. Odczyny immunohistochemiczne Wycinki utrwalane były w 10% formalinie zbuforowanej i zatapiane w parafinie. Skrawki parafinowe o grubości 4 mm umieszczano na szkiełkach podstawowych pokrytych silanem i odparafinowanych poprzez umieszczanie ich w ksylenie. Następnie uwadniano, przeprowadzając do wody destylowanej przez ciąg roztworów alkoholu etylowego o malejących stężeniach. W celu odmaskowania antygenów odparafinowane skrawki zanurzano w 0,0l M buforze cytrynianowym (ph 6,0). Następnie skrawki, w których oceniano ekspresję PRB, P53 i cykliny Dl, podgrzewano 3 razy po 5 minut w kuchence mikrofalowej (Samsung Electronics 750W), natomiast te skrawki, w których oceniano obecność HPV, ogrzewano w łaźni wodnej w temperaturze 95 C przez 30 min. Po ostygnięciu przeprowadzano w temperaturze pokojowej 10-minutową inkubację skrawków w 3% roztworze nadtlenku wodoru w celu zablokowania aktywności endogennej peroksydazy. Następnie skrawki inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami pierwotnymi: 1. z monoklonalnym mysim przeciwciałem przeciw wirusowi brodawczaka ludzkiego anti Human Papillomavirus, Clone K1H8 firmy DAKO (DANIA) (Code M 3528) w rozcienczeniu 1:50, 2. z monoklonalnym mysim przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiemu białku P53, Clone DO-7 (Code M 7001) firmy DAKO (DANIA) w rozcienczeniu 1:50. Inkubację przeprowadzano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po każdym etapie reakcji skrawki płukano w roztworze TBS. W kolejnym etapie stosowano dla skrawków, w których oznaczano obecność HPV, system LSAB+/HRP, a dla pozostałych przeciwciał system Envision +/HRP i przeprowadzano 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Wizualizację odczynu uzyskano po inkubacji skrawków w roztworze czterochlorowodorku 3,3 -diaminobenzydyny (DAB) w temperaturze pokojowej. W końcowym etapie skrawki podbarwiano hematoksyliną Mayera, odwadniano przez ciąg alkoholi i ksylen i zamykano w balsamie kanadyjskim oraz nakrywano szkiełkiem nakrywkowym. Do każdego odczynu wykonywano kontrolę ujemną i dodatnią. W kontrolach ujemnych przeciwciała pierwotne zastępowano firmowymi kontrolnymi surowicami mysimi lub króliczymi i przeprowadzano reakcje w warunkach identycznych jak w odczynach zasadniczych. Kontrolę dodatnią stanowiły firmowe skrawki kontrolne dla oceny HPV (HPV control slides), a dla oznaczenia P53 skrawki raka gruczołowego okrężnicy wykazującego silną ekspresję P53. Ekspresję odczynów immunohistochemicznych oceniano w 10 polach dużego powiększenia (400x), biorąc pod uwagę obecność odczynu jądrowego w ocenianych komórkach przez dwóch niezależnych doświadczonych patologów. Obecność jądrowego odczynu immunohistochemicznego z przeciwciałami HPV określano jako odczyn dodatni. Dodatni odczyn dla P53 określono, jeżeli liczba komórek wykazujących jądrowy odczyn immunohistochemiczny była 10% komórek nowotworowych. Analiza statystyczna Uzyskane wyniki badań poddano analizie statystycznej. Do wykrycia istnienia różnic między porównywanymi grupami użyto testu c 2, testu t-studenta lub U Manna-Whitney a, analizę log-liniową lub wieloczynnikową analizę regresji logistycznej. Do przeanalizowania i porównania przeżycia po zabiegu w czasie obserwacji zastosowano test log-rank lub test F Coxa oraz model proporcjonalnego hazardu Coxa. Przyjęto 5% błąd wnioskowania i związany z nim poziom istotności p<0,05 wskazujący na istnienie istotnych statystycznie różnic bądź zależności. Analizy statystyczne zostały przeprowadzone za pomocą oprogramowania komputerowego Statistica v. 7.1 (StatSoft, Polska). Dodatnie wybarwienie immunohistochemiczne na obecność przeciwciała przeciw wirusowi brodaw-

21 Tabela I. Tak * c * c * c * c (c * c c * c c * c c * c c G * c poszczególnymi kategoriami danej cechy. czaka ludzkiego anti Human Papillomavirus Clone K1H8 (typy: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56, i 58) stwierdzono u 36 (27,7%) spośród 130 chorych na raka krtani. Charakterystykę kliniczną, epidemiologiczną i histopatologiczną badanej grupy z uwzględnieniem obecności HPV przedstawiono w tabeli I. W analizowanej grupie chorych na raka krtani dodatni odczyn immunohistochemiczny na obecność wirusa HPV stwierdzono w guzie u 31 mężczyzn i 5

22 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela II. Tak * c * c * c * c (c *c c * c c * c c c c G * c kobiet. Guz pierwotny znajdował się w okolicy nadgłośniowej w 17 (47,2%) z 36 próbek z dodatnim HPV, w 17 (47,2%) z 36 w okolicy głośni i w dwóch (5,6%) w okolicy podgłośniowej. Stopień zaawansowania narządowego w 27 (75%) z 36 próbek z dodatnim HPV określono jako T3 lub T4 i w 9 (25%) jako T1 lub T2. Obecność wirusa HPV stwierdzono w 20 (55,6%) z 36 dodatnich próbek pacjentów z węzłami chłonnymi klinicznie niezmienionymi (N0) i w 16 (44,4%) próbkach pacjentów z cechami klinicznych przerzutów do węzłów chłonnych szyi (N1 3). Na podstawie klasyfikacji TNM określono stopień zaawansowania klinicznego. W obserwowanej grupie 36 chorych z HPV dodatnim aż 20 zgłaszających się do leczenia chorych było sklasyfikowanych jako

23 IV i 8 chorych jako III zaawansowania klinicznego nowotworu. II zaawansowania klinicznego nowotworu stwierdzono u 3 chorych, a I u 5. 9 (25%) z 36 próbek z dodatnim HPV zostało sklasyfikowanych jako G1, 22 (61,1%) jako G2 i 5 (13,9%) jako G3. Nie stwierdzono istotnej zależności pomiędzy obecnością wirusa HPV w nacieku nowotworowym raka krtani a cechami epidemiologiczno-kliniczno-histologicznymi. W badanej grupie 130 chorych na raka krtani dodatni odczyn jądrowy na obecność białka P53 stwierdzono u 83 (63,8%) chorych. Charakterystykę kliniczną, epidemiologiczną i histopatologiczną badanej grupy z uwzględnieniem ekspresji białka P53 przedstawiono w tabeli II. W analizowanej grupie 130 chorych na raka krtani dodatni odczyn jądrowy na obecność białka P53 stwierdzono u 74 mężczyzn i 9 kobiet. Guz pierwotny w 48 (57,8%) z 83 próbek z dodatnim wybarwieniem jądrowym na obecność białka P53 znajdował się w okolicy nagłośniowej, w 33 (39,8%) w okolicy głośni i 2 (2,4%) w okolicy podgłośniowej. Stopień zaawansowania narządowego u 63 (75,9%) z 83 pacjentów z dodatnim odczynem jądrowym na obecność białka P53 określono jako T3 lub T4 i u 20 (24,1%) chorych jako T1 lub T2. Węzły chłonne klinicznie niezmienione (N0) stwierdzono u 47 (56,6%) z 83 osób z dodatnim odczynem jądrowym na obecność białka P53, a 36 (43,4%) chorych miało kliniczne cechy przerzutów do węzłów chłonnych szyi (N1 3). Na podstawie klasyfikacji TNM określono stopień zaawansowania klinicznego. W ocenianej grupie 83 chorych z dodatnim odczynem jądrowym na obecność białka P53 w 42 przypadkach zgłaszający się do leczenia chorzy zostali sklasyfikowani jako IV, a 23 chorych jako III zaawansowania klinicznego nowotworu. II zaawansowania klinicznego nowotworu stwierdzono u 7 chorych, a I u 11. W badanej grupie z dodatnim wybarwieniem jądrowym na obecność białka P53 dominował rak średniozróżnicowany G2 u 46 (55,4%) z 83, o wysokim stopniu dojrzałości G1 u 25 (30,1%) z 83 i niskozróżnicowany rak płaskonabłonkowy G3 u 12 (14,5%) z 83. Analiza statystyczna pomiędzy ekspresją białka P53 a cechami kliniczno-epidemiologiczno-patologicznymi wykazała istotną zależność pomiędzy ekspresją białka P53 a stopniem zaawansowania klinicznego raka krtani (porównano podgrupy pacjentów I i II z III i IV ) (p=0,04), cechą N przy porównaniu osobno wszystkich cech N (N0, N1, N2 i N3) (p=0,02) oraz jego lokalizacją przy porównaniu osobno wszystkich lokalizacj (*nadgłośniowa, głośni i podgłośniowa p=0,03) i podgrup (#porównano podgrupy pacjentów z lokalizacją głośniową i nadgłośniową p=0,01) (Tab. II). W analizowanym materiale wykazano, że znacznie częściej ekspresja białka P53 występuje u pacjentów z wysokim stopniem zaawansowania klinicznego raka krtani III i IV w porównaniu z pacjentami z niskim stopniem zaawansowania klinicznego nowotworu I i II. Wykazano również znacznie częstsze występowanie ekspresji białka P53 u pacjentów z lokalizacją nadgłośniową w porównaniu z pacjentami z lokalizacją głośniową i/lub podgłośniową. Istotnie częstsze występowanie ekspresji białka P53 wykazano u pacjentów z węzłami z cechami przerzutów (N1 3) w porównaniu z chorymi z węzłami chłonnymi N0. Analiza wieloczynnikowa z zastosowaniem modelu regresji logistycznej nie wykazała jednoczesnego wpływu wielu zmiennych na ekspresję P53. Przeprowadzona analiza przeżycia z uwzględnieniem wszystkich przyczyn zgonu nie wykazała istotności statystycznej pomiędzy ekspresją białka P53 a przebiegiem klinicznym dla 3-letniego okresu obserwacji (p=0,72) i dla 5-letniego okresu obserwacji (p=0,52). Podobny brak zależności czasu przeżycia od ekspresji białka P53 uzyskano także w przeprowadzonej analizie z uwzględnieniem tylko choroby nowotworowej jako przyczyny zgonu w 3- i 5-letnim okresie obserwacji. W analizowanej grupie 83 pacjentów z ekspresją białka P53 55 (66,3%) chorych przeżyło 3 lata od zabiegu operacyjnego, a 40 (57,1%) z 70 chorych przeżyło 5 lat. Na podstawie analizy jednoczynnikowej (test log-rank) stwierdzono, że ekspresja białka P53 nie jest niezależnym czynnikiem prognostycznym. Analiza wyników leczenia wykazała, że ekspresja białka P53 nie miała istotnego związku z długością czasu przeżycia pacjentów chorych na raka krtani. Przeprowadzona analiza przeżycia z uwzględnieniem wszystkich przyczyn zgonu nie wykazała istotnej statystycznie różnicy pomiędzy obecnością wirusa HPV w nacieku nowotworowym raka krtani a przebiegiem klinicznym w 3-letnim okresie obserwacji (p=0,7) i 5-letnim okresie obserwacji (p=0,46). Zbliżone wyniki uzyskano także w przeprowadzonej analizie przeżycia z uwzględnieniem tylko choroby nowotworowej jako przyczyny zgonu w 3- i 5-letnim okresie obserwacji. Ekspresję białka P53 stwierdzono u 83 (63,9%) spośród 130 chorych na raka krtani. Obecność HPV badanego metodą immunohistochemiczną stwierdzono u 36 (27,7%) ze 130 chorych na raka krtani. Ekspresję białka P53 stwierdzono u 25 (69,4%) z 36 chorych na raka krtani z wykazaną obecnością wirusa HPV. Zależność pomiędzy ekspresją białka P53 a obecnością wirusa HPV badanego metodą immunohistochemiczną nie była statystycznie istotna (c 2 =0,67; p=0,41). W badaniach własnych ekspresję białka P53 stwierdziliśmy u 25 (69,4%) z 36 chorych na raka krtani z wykazaną obecnością wirusa HPV za pomocą metody IMH. Analizy zależności pomiędzy ekspresją białka P53 a obecnością wirusa HPV nie wykazały statystycznej istotności. Zbliżone wyniki uzyskali Ma i wsp. [10],

24 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Anwar i wsp. [1] i Borresen i wsp. [2]. Natomiast inni autorzy wykazali korelację pomiędzy obecnością E6 i E7 HPV 16 i 18 a ekspresją białka P53 [4, 5, 9, 18]. Ma i wsp. [10], stosując metodę PCR, w grupie 102 chorych na raka krtani stwierdzili obecność HPV w 60 (58,8%) przypadkach. W grupie pacjentów z dodatnim HPV obecność wysoko onkogennych typów HPV 16, 18 i 33 stwierdzono u 30 chorych. Ekspresję białka P53 stwierdzono u 60 (58,8%) ze 102 chorych. Ekspresję białka P53 stwierdzono w 35 (58,3%) z 60 przypadków z HPV dodatnim, nie stwierdzono korelacji pomiędzy obecnością HPV a ekspresją P53 w raku krtani [10]. Anwar i wsp. [1] stwierdzili obecność ekspresji białka P53 w 11 (69%) z 16 preparatów raka krtani z HPV dodatnim. Borresen i wsp. [3] wykazali podwyższenie poziomu białka P53 w 59% przypadków wykazujących obecność wysoko onkogennych typów HPV. Salam i wsp. [16] wykazali nadekspresję P53 u 50 (57,5%) z 87 chorych na raka krtani. Natomiast nie stwierdzili obecności białka P53 w błonie śluzowej grupy kontrolnej pobranej z niezmienionej nowotworowo krtani. Autorzy nie stwierdzili korelacji pomiędzy ekspresją P53 a czynnikami kliniczno-patologicznymi raka krtani. Autorzy wykazali obecność wirusa HPV u 8 (22,2%) z 36 chorych. Stwierdzili obecność wirusa HPV u 4 z 20 chorych, u których stwierdzono ekspresję P53. Gorgoulis i wsp. [7] stwierdzili ekspresję P53 u 77,5% z 40 pacjentów z rakiem krtani. Obecność wirusa HPV wykazano u 28% chorych na raka krtani. Autorzy stwierdzili istotną zależność pomiędzy ekspresją P53 a paleniem papierosów oraz odwrotną zależność pomiędzy obecnością wirusa HPV a ekspresją P53. Haraf i wsp. [8] w grupie 66 chorych z płaskonabłonkowym rakiem głowy i szyi wykazali obecność mutacji genu P53 u 24% pacjentów oraz u 18% pacjentów z obecnością wirusa HPV. Istotną zależność stwierdzono pomiędzy obecnością wirusa HPV a lokalizacją raka w migdałkach oraz odwrotną korelację z ekspresją P53. Wykazano także odwrotną korelację pomiędzy ekspresją P53 a paleniem tytoniu i piciem alkoholu. Nie stwierdzono istotnej korelacji pomiędzy ekspresją P53 a obecnością wirusa HPV. Wyniki własne i cytowane wyniki innych autorów nie potwierdzają wyników badań in vitro wykazujących, że białko P53 może być degradowane za pośrednictwem powstawania kompleksu z wirusem HPV 16 i HPV 18 kodującym białko E6 za pomocą proteolizy mediatorów ubikwitiny [17]. Rozważania Scheffnera i wsp. [17] dotyczące wysokiej niestałości białka P53 linii komórkowej HeLa (tj. linia HPV 18 dodatnia wywodząca się z hodowli komórkowej raka szyjki macicy) są zgodne z uzyskanymi przez nich wynikami wykazującymi, że kodujące onkoprotiny E6 HPV 16 lub 18 sprzyjają degradacji białka P53. Brachman i wsp. [4] ocenili obecność mutacji eksonu 2-11 genu P53 i obecność fragmentu E6 DNA wirusa HPV16 i 18 w grupie 30 raków płaskonabłonkowych głowy i szyi. Obecność E6 HPV16 stwierdzono w dwóch przypadkach, natomiast E6 HPV18 w jednym przypadku. Mutacje genu P53 stwierdzono w 16 (53%) z 30 badanych raków płaskonabłonkowych między kodonem 126 a kodonem 307 odpowiadającym eksonowi 5-9 genu P53. Autorzy nie stwierdzili obecności mutacji genu P53 u pacjentów z E6 HPV 16 i HPV 18 dodatnim. Korelację pomiędzy obecnością HPV a ekspresją P53 potwierdzili Jacob i wsp. [9], którzy oceniali częstotliwość występowania HPV w 44 naciekach raka krtani i w 6 niezmienionych nowotworowo błonach śluzowych krtani oraz ich udział w ekspresji białka PCNA i białka P53. Autorzy nie stwierdzili obecności wirusa HPV w prawidłowej błonie śluzowej, natomiast w nacieku raka krtani obecność HPV stwierdzono w 15 (34%) z 44 badanych przypadków. Autorzy stwierdzili wzajemną korelację i statystyczną istotną zależność pomiędzy obecnością HPV a ekspresją białka P53 w raku krtani. We własnej grupie analiza zależności pomiędzy ekspresją białka P53 a obecnością fragmentu genomu E6/E7 HPV 16 badanego metodą nested- -PCR nie wykazała statystycznej istotności (p=0,12). Analiza zależności pomiędzy ekspresją białka P53 a obecnością wirusa HPV nie wykazała statystycznej istotności przy badaniu metodą IMH (p=0,33) ani metodą PCR/DEIA (p=0,72). Białko E6 tworzy stabilny kompleks z produktem genu P53 [20]. Kompleks ten ulega ubikwitynizacji w proteosomach. Tym samym stężenie białka P53 w komórce obniża się niekorzystnie [17]. Uzyskane przez nas wyniki wykazują także częstszą obecność ekspresji białka P53 u chorych na raka krtani, u których nie wykazano obecności wirusa HPV niż u chorych z wirusem HPV. Odpowiednie stężenie białka P53 w komórce jest niezbędne do regulacji proliferacji, wzrostu i różnicowania się komórek [17]. Inaktywacja genu P53 przez mutacje punktowe lub przez onkogenne białko E6, znosząc działanie białka P53 regulującego cykl podziałowy komórek i ułatwiający jej wzrost, zwiększa częstość występowania spontanicznych mutacji przyczyniających się do utrwalenia niestabilności chromosomalnej w komórkach zarażonych przez wirusa HPV wysokiego ryzyka onkogennego. Jednak degradacja P53 przez E6 nie jest jedyną funkcją tych onkoprotein wirusa. Wzajemne oddziaływanie między E6 i P53 najwyraźniej wystarcza do zniesienia takich funkcji P53, jak przyłączenie się do DNA, transaktywacja, transrepresja i transkrypcja [5]. Na podstawie uzyskanych wyników nie wykazano istotnego związku pomiędzy obecnością wirusa HPV a występowaniem ekspresji białka P53. Ekspresja biał-

25 ka P53 lub obecność wirusa HPV nie są czynnikami prognostycznymi u chorych z rakiem krtani. 1. Anwar K, Nakakuki K, Imai H, Naiki H., Inuzuka M. Over- -expression of p-53 in human laryngeal carcinoma. Int J Cancer1993, 53, 952 956. 2. Bień S, Kaminski B, Żyłka S, Mężyk R, Piasta Z, Markowski J, wsp.: Ewolucja obrazu epidemiologicznego i klinicznego raka krtani i krtaniowej części gardła w Polsce w latach 1991 2001. Otolaryngol. Pol., 2005, 59, 169 181. 3. Borresen AL, Helland A, Nesland J, Holm R, Trope C, Kaern J: Papillomaviruses, p53, and cervical cancer. Lancet 1992, 339, 1350 1351. 4. Brachman DG, Graves D, Vokes E, Beckett M, Haraf D, Montag A, i wsp. Occurrence of p53 gene deletions and human papilloma virus infection in human head and neck cancer. Cancer Res. 1992, 52, 4832 4836. 5. Crook T, Wrede D, Tidy JA, Mason WP, Evans DJ, Vousden KH: Clonal p53 mutation in primary cervical cancer: association with human-papillomavirus-negative tumours. Lancet 1992, 339, 1070 1073. 6. Garcia-Milian R, Hernandez H, Panade L, Rodrriguez C, Gonzalez N, Valenzuela C, I wsp.: Detection and typing of human papillomavirus in benign and malignant tumours of laryngeal epithelium. Acta Otolaryngol 1998, 118,754 758. 7. Gorgoulis V, Rassidakis G, Karameris A, Giatromanolaki A, Barbatis C, Kittas C: Expression of p53 protein in laryngeal squamous cell carcinoma and dysplasia: possible correlation with human papillomavirus infection and clinicopathological findings. Virchows Arch 1994, 425, 481 489. 8. Haraf DJ, Nodzenski E, Brachman D, Mick R, Montag A, Vokes EE, I wsp.: Human papilloma virus and p53 in head and neck cancer: clinical correlates and survival. Clin Cancer Res 1996, 2, 755 762. 9. Jacob SE, Sreevidya S, Chacko E, Pillai MR: Cellular manifestations of human papillomavirus infection in laryngeal tissues. J. Surg. Oncol. 2002, 79, 142 150. 10. Ma XL, Ueno K, Pan ZM, Hi SZ, Ohyama M, Eizuru Y: Human papillomavirus DNA sequences and p53 overexpression in laryngeal squamous cell carcinomas in Northeast China. J. Med. Virol. 1998, 54, 186 191. 11. Maier H, Dietz A, Gewelka U, Heller WD, Weidauer H: Tobacco and alcohol and the risk of head and cancer. Clin Invest1992, 70, 320 327. 12. Morshed K, Stenzel A, Szymański M, Różyńska K, Siwiec H, Gołąbek W, Wojcierowski J: Detection of human papillomavirus typ 16 and 18 in laryngeal cancer using PCR. Otolaryng Pol 2001, 55, 29 33. 13. Morshed K, Polz-Dacewicz M, Szymański M, Polz D. Short- -fragment PCR assay for highly sensitive broadspectrumdetection of human papillomaviruses inlaryngeal squamous cell carcinoma and normal mucosa, clinico-pathological evaluation. Eur Arch Otorhinolaryngol 2008, 265, Suppl 1, 89 96. 14. Morshed K: Association between human papillomavirus infection and laryngeal squamous cell carcinoma. J Med Viorl. 2010, 82; 1017-1023. 15. Muscat JE, Wynder EL: Tobacco, alkcohol, asbestos, and occupational risik factors for laryngeal cancer. Cancer 1992, 69, 2244 2251. 16. Salam M, Rockett J, Morris A: The prevalence of different human papillomavirus types and p53 mutations in laryngeal carcinomas: is there a reciprocal relationship?. Eur. J. Surg. Oncol. 1995, 21, 290 296. 17. Scheffner M, Wemess BA, Huibregtse LM, Levine AJ, Howley PM: The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53. Cell 1990, 63, 1129 1136. 18. Scheffner M, Munger K, Byrne JC, Howley PM: The state of the p53 and retinoblastoma genes in human cervical carcinoma cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 1991, 88, 5523 5527. 19. Weinstein IB: The origins of human cancer: molecular mechanisms of carcinogenesis and their implications for cancer prevention and treatment twenty-seventh G.H.A. Clowes memorial award lecture. Cancer Res 1988, 48, 4135 4143. 20. Werness BA, Levine AJ, Howley PM.: Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53. Science 1990, 248, 76 79.