RECENZJA Rozprawy doktorskiej lek. med. Mariusza _Weseckiego pt. "Ocena ekspresji CD8, CD68, FOXP3 i inos w tkance guza oraz ich wartość prognostyczna w gruczolakoraku jelita grubego". Powstanie nowotworu i jego dalsza progresja wiąże SIę nierozerwalnie z układem odpornościowym. Praktycznie nie ~a nowotworu, którego rozwój nie wywoływałby reakcji immunologicznej przynajmniej na poziomie jego mikrośrodowiska. Na drodze różnych mechanizmów układ odpornościowy może zarówno wpływać na powstanie nowotworu, jak to ma miejsce w przewlekłych stanach zapalnych, jak i kontrolować jego progresję promując rozwój lub zapobiegając jego powstaniu. Znaczenie prognostyczne nacieków limfocytarnych, w zależności od ich charakteru i lokalizacji w guzie lub jego otoczeniu było tematem wielu prac. Udowodniono, że w przypadku niektórych nowotworów jak na przykład czerniaka złośliwego, charakter nacieku zapalnego jest jednym z najważniejszych czynników rokowniczych. Wydzielono trzy kategorie nacieku limfocytarnego: jego całkowity brak, naciek ograniczony do czoła guza (TILs non brisk) i naciek penetrujący głęboko między gniazda komórek czerniaka (TILs bisk). Uznano, że znaczenie tego parametru jest tak istotne, że powinien on się znaleźć obowiązkowo w każdym raporcie histopatologicznym dotyczącym czerniaka złośliwego, obok oceny głębokości nacieku czerniaka, typu histologicznego, liczby mitoz na mm kwadratowy i informacji o obecności owrzodzenia oraz radykalności zabiegu. Ocena ilościowa nacieków zapalnych w przypadku zmian skórnych jest dużo prostsza niż w przypadku nowotworu gruczołowego jelita grubego. Krytycznym momentem oceny jest dobór pól do oceny. Najlepiej w takim wypadku wybierać pola o największym nasileniu zapalenia (hot spots). Zliczanie limfocytów z ekspresją określonego antygenu w oparciu o pola widzenia na dużym powiększeniu może być utrudnione i obarczone dużym błędem subiektywności 1
na przykład w przypadku gruczolakoraka śluzowego jelita, gdzie zrąb nowotworu zajmuje niewielki procent masy guza, a dominują masy śluzowe z zatopionymi w nich komórkach raka. Między innymi z tego względu w przypadku gruczolakoraków jelita grubego większe znaczenie przypisuje się charakterowi nacieków niż samej tylko ich ilości. Praca lek. med. Mariusza Weseckiego wpisuje się w ten nurt badań. Brak jednoznacznych dowodów, co do znaczenia prognostycznego obecności makrofagów towarzyszących nowotworowi jak i limfocytów T regulatorowych w gruczolakoraku jelita grubego skłoniły doktoranta do zajęcia się tym tematem. W bardzo rozbudowanym wstępie znalazły się ogólne informacje o epidemiologii raka jelita grubego, krótki rozdział na temat przyczyn powstawania tego nowotworu, dróg i mechanizmów jego szerzenia się oraz sposobów leczenia w zależności od lokalizacji. Jednak większość wstępu zajmuje niezwykle szczegółowy OpIS prognostycznych czynników immunologicznych w odniesieniu do mikro środowiska nowotworu. Autor opisuje dokładnie limfocyty naciekające nowotwór (TIL), charakteryzując szczegółowo limfocyty T CD4+ i T CD8+ zarówno regulatorowe jak i efektorowe, cytotoksyczne. W tej części pracy prezentuje szeroko współczesne poglądy na temat znaczenia w/w populacji limfocytów w procesie progresji raka jelita grubego. Wyróżnia subpopulacje komórek regulatorowych CD4+FoxP3+ Treg odporną na apoptozę i terapię onkologiczną, a promującą anglogenezę oraz subpopulacj ę CD8+ F oxp3+ Treg tłumiącą odpowiedź immunologiczną na antygeny komórek nowotworowych. W ostatniej części wstępu doktorant zajmuje się makrofagami o fenotypie MI i M2 związanymi z nowotworami. Opisuje ich znaczenie zarówno hamujące MI w pierwszym etapie rozwój nowotworu, by w kolejnym promować angiogenezę w obszarach hipoksji, i pod wpływem chemokin i cytokin przekształcać się w makrofagi M2 promujące proliferacje i migracje komórek nowotworowych. 2
Lek. med. Mariusz Wesecki zakłada dwa cele pracy. W pierwszym próbuje ustalić znaczenie prognostyczne nacieków guza przez limfocyty regulatorowe T CD8+FoxP3+ i makrofagi towarzyszące guzowi M2 u chorych operowanych z powodu gruczolakoraka jelita grubego. Cel drugi stanowi rozwiniecie celu pierwszego. Doktorant pragnie w oparciu o liczbę limfocytów T regulatorowych CD8+FoxP3+ i intensywność nacieku makrofagów M2 tzn. CD68+iNOS- wykazać grupę chorych zagrożonych zwiększonym ryzykiem pojawienia się nawrotu choroby nowotworowej. Cele pracy uzupełnia pięć hipotez badawczych sformułowanych w formie pytań. Autor precyzyjnie opisuje materiał, który wykorzystał w pracy posiłkując się pięcioma rycinami i jedną tabelą przedstawiającą zwięźle charakterystykę kliniczno-histopatologiczną chorych zakwalifikowanych do badania. Uwagę zwraca bardzo szczegółowa przedstawiona sama metodyka barwień immunohistochemicznych, w tym uwzględniająca tak ważne badania kontrolne. Wątpliwości budzi sama metodyka ilościowej oceny preparatów. Jako praktyk zdaję sobie sprawę z trudności znalezienia pod mikroskopem tych samych 3 pól w dwóch różnych skrawkach każdego z przypadków. Taka ocena była by zdecydowanie bardziej precyzyjna gdybyśmy skorzystali ze skanera i komputerowej analizy obrazu pozwalającej nie tylko na precyzyjną ilościową ocenę ekspresji badanych antygenów, ale przede wszystkim pozwalającej na znalezienie i nałożenie tych samych pól w kolejnych wybarwionych skrawkach. Wybrane metody statystyczne w pełni uwiarygadniają otrzymane w wynikach zależności. Rozdział wyniki jest znakomicie przygotowany. Uzupełnia go 49 dobrze dobranych i opisanych tabel oraz 35 wykresów i 6 kolorowych mikrofotografii. 3
Bardzo duża liczba danych dzięki ilustracji tabelami i wykresami staje SIę zrozumiała i czytelna. Służy temu również rozdział posumowanie wyników, który w punktach puentuje najważniejsze z otrzymanych korelacji i wyników. Obszerna dyskusja została uporządkowana poprzez utworzenie podrozdziałów, w których doktorant analizując swoje wyniki odnosi je do wcześniej prowadzonych badań. Wielokrotnie wskazuje na obecne w piśmiennictwie sprzeczne, meraz wykluczające się poglądy. Dotyczy to zarówno znaczenia prognostycznego nacieków podścieliska raka przez różne subpopulacje limfocytów T CD8+ jak i makrofagów związanych z nowotworem. W rozdziale zalety i ograniczenia pracy lek. med. Mariusz Wesecki pisze o problemach z zebraniem odpowiedniej liczby chorych o podobnym stadium zaawansowania jak i dostrzega i krytycznie podchodzi do problemu oceny immunofenotypu makrofagów towarzyszących nowotworowi. Z czterech przedstawionych wniosków dwa drugi i czwarty stanowią ścisłą odpowiedź na postawione cele pracy, natomiast dwa pozostałe weryfikują hipotezy badawcze pracy. Pracę uzupełnia wykaz bardzo dobrze dobranego i cytowanego piśmiennictwa. Na koniec z obowiązku recenzenta kilka uwag krytycznych. W założeniach metody autor przyznaje, że ze względów technicznych nie było możliwe zabarwienie makrofagów M2 dlatego zdecydowano się na swoiste wybarwienie makrofagów MI za pomocą przeciwciała przeciw syntazie tlenku azotu (inos) i odjęcie ich liczby od ogólnej puli wszystkich makrofagów (CD68+). Z kolei w rozdziale ocena odczynów immunohistochemicznych doktorant przedstawia skalę oceny nacieków CD68+ jako półilościową (praktycznie jakościową) natomiast obecność komórek inos w skali dwustopniowej: (O) brak komórek; (1) obecne co najmniej 3 komórki 4
pozytywne w polu widzenia. Założenia metody w oparciu o taką skalę oczywiście nie mogą być zrealizowane. Skala oceny obecności komórek o fenotypie MI a zatem CD68+ inos(+) w rozdziale wyniki oceny intensywności i charakteru nacieku makrofagów wygląda jeszcze inaczej. Tutaj wyróżniono: brak (O), i naciek minimalny (1 +). W konkluzji autor stwierdza, że we wszystkich badanych przypadkach było brak nacieku komórek o fenotypie MI lub był minimalny, a zatem praktycznie można założyć, że wszystkie makrofagi CD68+ to makrofagi o fenotypie M2. Zdaniem recenzenta to jednak duże uproszczenie i raczej w pracy powinniśmy posługiwać się precyzyjnie nazwą makrofagi CD68+. W tabeli 5 zatytułowanej "Charakterystyka kliniczno-histopatologiczna chorych zakwalifikowanych do badania" w typie histologicznym guza znalazły rozpoznania niezgodne z klasyfikacją WHO wcześniej przytoczoną przez doktoranta. Dysponując bloczkami parafinowymi można było wykonać preparaty histopatologiczne i skorygować błędy nazewnictwa takie jak Adenocarcinoma gelatinosum, adenocarcinoma tubulo-papillare czy adenocarcinoma tubulo-villosum. Ponadto obecnie zgodnie z zaleceniami Polskiego Towarzystwa Patologów opublikowanymi w 2013 roku i cytowanymi przez doktoranta, powinniśmy się posługiwać nazewnictwem w języku polskim lub angielskim. Z powyższej tabeli wynika również, że blisko 1/3 przypadków poddanych analizie stanowiły gruczolakoraki odbytnicy. W przypadku tej lokalizacji jednym z najsilniejszych czynników prognostycznych jest radykalność zabiegu operacyjnego polegająca na całkowitym wycięciu mezorektum. Moim zdaniem się ten parametr podobnie jak uwzględniona chłonnych powinien podlegać analizie. w pracy liczba badanych węzłów 5
Podsumowując, chciałem podkreślić ogromny wkład doktoranta w recenzowaną pracę. Podjął się on niezwykle trudnego zadania zmierzenia się z mechanizmami immunologicznymi wpływającymi na progresję raka. Udowodnił, że stosując w miarę proste metody można także otrzymywać wartościowe wyniki. Praca pod względem edycyjnym jest znakomicie przygotowana, a rozdział wyniki z takim doborem tabel i rycin może stanowić wzór dla tego typu opracowań. Reasumując, pomimo powyższych krytycznych uwag pracę w całości oceniam pozytywnie. Lek. med. Mariusz Wesecki wykazuje ogólną wiedzę teoretyczną w zakresie immunologii, immunohistochemii i chirurgii oraz posiada dużą umiejętność samodzielnego prowadzenia pracy naukowej. Rozprawa doktorska spełnia warunki określone wart. 13 ust. l ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U.Nr 65, poz. 595, z późń.zm.). Upoważnia to mnie do zwrócenia się do Wysokiej Rady Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie lek. med. Mariusza Weseckiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. KIEROWNIK 6