GEN III MicroPlate TM

GEN III MicroPlate TM Instrukcja użytkowania Przeznaczenie: wyłącznie do celów badawczych Dystrybutor: BioMaxima S.A. Centrum Mikrobiologii Emapol ul. Budowlanych 68 80-298 Gdańsk Tel.: + 48 58 556 52 46 lub + 48 58 349 62 78 (wewnętrzny 52 lub 51) Fax: 58 341 12 49 E-mail: office_emapol@biomaxima.com www.biomaxima.com 1

PRZEZNACZENIE Mikropłytka GEN III umożliwia identyfikację szerokiego spektrum bakterii Gramdodatnich i Gram-ujemnych w oparciu o wyniki 94 różnych testów biochemicznych. Systemy Biolog - Microstation ID System lub OmniLog ID System - służą do odczytu i analizy wyników uzyskany przy użyciu płytek GEN III. OPIS PRODUKTU Rys. 1 Źródła węgla i substancje chemiczne w poszczególnych studzienkach płytki GEN III. Charakterystyka bakterii przy użyciu płytek GEN III obejmuje 94 testy fenotypowe: 71 testów opartych o metabolizm różnych źródeł węgla (Rys. 1, kolumny 1-9) oraz 23 testy wrażliwości chemicznej (Rys. 1, kolumny 10-12). Zdolność drobnoustrojów do metabolizowania poszczególnych źródeł węgla oraz ich wrażliwość na działanie obecnych w studzienkach płytki substancji chemicznych określane są na podstawie wyniku kolorymetrycznej reakcji redoks. Wszystkie niezbędne składniki odżywcze i biochemiczne opłaszczone są bezpośrednio w studzienkach 96-dołkowej płytki GEN III. Procedura wykonania oznaczenia jest szybka i prosta (Rys. 2). Oznaczany szczep bakterii należy wyhodować na płytce Petriego z odpowiednim podłożem agarowym, po czym przygotować właściwej gęstości zawiesinę drobnoustroju w przeznaczonym do tego celu płynie do inokulacji. Następnie, zawiesina przenoszona jest na mikropłytkę GEN III (po 100 µl na studzienkę) i całość poddawana jest inkubacji. Bezpośrednio po inokulacji wszystkie studzienki na płytce są bezbarwne. Jednakże, w trakcie inkubacji niektóre ze studzienek przyjmują barwę fioletową. Jest to spowodowane redukcją barwnika tetrazoliowego na skutek zachodzenia reakcji 2

metabolicznych (sytuacja taka ma miejsce jeżeli drobnoustrój jest zdolny do metabolizowania zawartego w danej studzience źródła węgla lub wykazuje oporność na działanie określonej substancji chemicznej). Studzienka A-1 nie zawierająca żadnego źródła węgla stanowi kontrolę negatywną i nie powinna przyjmować zabarwienia fioletowego (studzienka A-1 stanowi kontrolę negatywną dla 71 testów opartych o metabolizm źródeł węgla). Z kolei studzienka A-10 stanowi kontrolę pozytywną dla 23 reakcji wrażliwości chemicznej (kolumny 10-12) i zawsze powinna przyjmować zabarwienie fioletowe podczas inkubacji płytki GEN III. Każdy identyfikowany drobnoustrój tworzy niepowtarzalny wzór, na który składają się układ i intensywność poszczególnych wybarwień. Porównanie przez system Biolog tego wzoru ze wzorcami w bazie danych stanowi ostatni etap procesu identyfikacji. Rys. 2 Etapy przygotowania próbki do badania 3

Materiały zapewnione: Mikropłytki: Biolog GEN III MicroPlate (nr kat. 1030) - 10 sztuk w opakowaniu. Przy odbiorze zamówienia należy sprawdzić czy towar nie został uszkodzony podczas transportu. Płytki należy przechowywać w temp. 2-8ºC. Nie należy używać płytek po upływie terminu ważności (data ważności umieszczona jest na opakowaniu każdej płytki). Materiały nie zapewnione: Podłoża hodowlane: Biolog Dehydrated Growth Agar, 500 g (BUG Agar) (nr kat. 70101); BUG Agar + 5% krwi baraniej (BUG + B Agar) (nr kat. 71102). Płyny do inokulacji: IF-A (nr kat. 72401); IF-B (nr kat. 72402); IF-C (nr kat. 72403). Inokulatorz TM : Sterylne wymazówki Inokulatorz TM (20x50 - nr kat. 3321; 100x1 nr kat. 3323). Streakerz TM : Sterylne, jednorazowe patyczki do przenoszenia kolonii drobnoustrojów (10x100 - nr kat. 3025; 50x20 3026). Jednorazowe pipety: nr kat. 3019. Reservoirs: Sterylne, jednorazowe rynienki do przenoszenia zawiesiny drobnoustrojów przy użyciu pipety wielokanałowej (nr kat. 3102). Elektroniczny pipetor wielokanałowy: nr kat. 3711-8. Końcówki do elektronicznego pipetora wielokanałowego: Sterylne końcówki w pudełku (nr kat. 3201). Turbidymetr: nr kat. 3532. Standardy turbidymetryczne: 85%T (nr kat. 3441); 65%T (nr kat. 3440). Wybór protokołu wykonania oznaczenia (dobór odpowiedniego płynu do inokulacji płytki GEN III oraz właściwej gęstości zawiesiny drobnoustroju): Ogólna procedura wykonania oznaczenia pozostaje niezmienna. Różnice polegają jedynie na użyciu innych płynów do inokulacji i przygotowaniu zawiesin o różnych gęstościach. Protokół A: używany dla większości identyfikowanych bakterii. Protokół B: używany dla niewielkiej liczby silnie redukujących lub opłaszczonych bakterii (głównie w przypadku pewnych szczepów Aeromonas, Vibrio i przetrwalnikujących Gram-dodatnich pałeczek). Drobnoustroje te mogą dawać fałszywie pozytywny wynik w studzience A-1 przy użyciu protokołu A. Jeśli taka sytuacja ma miejsce, wówczas należy powtórzyć oznaczenie stosując wytyczne zawarte w protokole B. Protokół C1: używany dla wolno rosnących bakterii, tworzących niewielkie kolonie (zwykle nie przekraczające średnicy 1 mm) po 24 godzinnej inkubacji na podłożu BUG + B (przykłady: Rys. 2d oraz lista gatunków poniżej w Tabeli 1). Protokół C2: używany dla wymagających i zwykle wrażliwych na działanie tlenu bakterii, rosnących bardzo wolno lub w ogóle na podłożu BUG + B (lista gatunków poniżej w Tabeli 1). W przypadku braku pewności co do wyboru odpowiedniego protokołu zawsze należy zacząć od protokołu A. Jeśli nie można uzyskać identyfikacji na skutek fałszywie pozytywnej reakcji w studzience A-1 należy przejść na protokół B. Jeżeli natomiast niemożliwe jest uzyskanie identyfikacji na skutek niedostatecznego wybarwienia studzienek, wówczas należy zastosować protokoły C1 lub C2. 4

Tabela 1. Protokoły wykonania oznaczenia przy użyciu płytki GEN III. PROCEDURA Przygotowanie wstępne Przed przystąpieniem do wykonania oznaczenia należy doprowadzić mikropłytkę GEN III i odpowiedni płyn do inokulacji do temp. pokojowej oraz uważnie przeczytać instrukcję użytkowania. Krok 1: Przygotowanie hodowli badanego drobnoustrój na odpowiednim podłożu agarowym Przygotować świeżą hodowlę badanego drobnoustroju (wymagana monokultura) na podłożu rekomendowanym przez firmę Biolog (najlepiej BUG + B lub Agar czekoladowy). Zalecana temp. inkubacji to 33ºC, choć niektóre gatunki mogą wymagać innych warunków temperaturowych (26-37ºC), jak również stężenia CO 2 w zakresie 6,5-10%. Możliwość wykorzystania alternatywnych podłoży hodowlanych musi być potwierdzona. Dla użytkowników pracujących na podłożach agarowych nie zawierających krwi polecane jest podłoże BUG Agar firmy Biolog (jednakże, należy wziąć pod uwagę, iż niektóre gatunki bakterii będą rosły bardzo słabo lub w ogóle na podłożu bez dodatku krwi zwłaszcza gatunki wymienione w Tabeli 1 przy protokołach C1i C2). R2A Agar lub Tryptic Soy Agar (TSA oraz wersja z dodatkiem krwi TSA + 5% KB) mogą być używane zamiast podłoża BUG Agar, aczkolwiek nie umożliwiają one wzrostu tak szerokiego zakresu drobnoustrojów. Ponadto, receptury i właściwości użytkowe tychże podłoży od różnych producentów mogą się różnić. Do badania należy używać wyłącznie świeżych hodowli (zalecany czas inkubacji dla większości szczepów mieści się w zakresie 4-24 godzin). Tworzące przetrwalniki, Gram-dodatnie bakterie należy hodować krócej niż 16 godzin w celu zminimalizowania sporulacji. 5

Krok 2: Przygotowanie inokulum Należy okresowo kalibrować turbidymetr. W tym celu używać odpowiednich standardów turbidymetrycznych (85%T i 65%T) i postępować zgodnie z instrukcjami doręczonymi przez producenta aparatu. Przed każdym oznaczeniem należy wyzerować turbidymetr (ustawić pokrętło turbidymetru na 100%T) przy użyciu probówki zawierającej czysty płyn do inokulacji Przed umieszczeniem w turbidymetrze probówkę należy oczyścić papierowym ręcznikiem z wszelkich zabrudzeń. UWAGA: probówki zawierające płyn do inokulacji nie są optycznie jednolite. A zatem, turbidymetr musi być wyzerowany dla każdej probówki z osobna. Gęstość przygotowanej zawiesiny drobnoustroju musi odpowiadać wytycznym zawartym w odpowiednich protokołach (protokoły A, B i C1 90-98%T; protokół C2-62-68%T). Do przenoszenia bakterii z podłoży hodowlanych do płynu inokulacyjnego najlepiej używać sterylnych, bawełnianych wymazówek. Sposób pobierania materiału obrazuje Rys. 2a, b, c i d (na Rys. 2b, c i d zobrazowano odpowiednio wzrost bakterii szybko, średnio i wolnorosnących. Żółte okręgi na Rys. 2b, c i d wskazują, z jakiego obszaru wzrostu najlepiej pobierać materiał do badań). W przypadku szybko rosnących bakterii zazwyczaj wystarczy pobrać jedną kolonię. W przypadku średnio rosnących bakterii dotykamy wymazówką niewielkiego skupiska kolonii, zaś bakterie wolno wzrastające wymagają przeniesienia materiału z obszaru wzrostu zlewnego. Pocierając wymazówką o ścianki i/lub dno probówki przenosimy pobrany materiał do płynu inokulacyjnego (Rys. 2e). Zawiesina musi być homogenna! (nie może zawierać pływających skupisk komórek. Wszelkie grudki i zlepki komórek należy rozetrzeć lub usunąć z płynu do inokulacji chwytając je przy pomocy wymazówki). Po uzyskaniu homogennej zawiesiny, określamy jej gęstość używając w tym celu turbidymetru (Rys. 2f). Jeżeli gęstość zawiesiny jest zbyt mała należy pobrać więcej materiału, jeśli jest zbyt duża dodajemy odpowiednią ilość płynu do inokulacji. W przypadku, gdy przygotowanie homogennej zawiesiny jest wyjątkowo utrudnione ze względu na właściwości badanego drobnoustroju należy postępować w następujący sposób: Za pomocą np. jałowego drewnianego patyczka pobrać materiał (uważać, aby przy przenoszeniu bakterii nie przenosić również agarowego podłoża hodowlanego) i rozetrzeć o ścianki sterylnej, pustej probówki. Następnie dodać 2 ml płynu do inokulacji. Całość dokładnie i delikatnie wymieszać. Powstała w ten sposób zawiesina stanowić będzie mieszaninę zawieszonych komórek oraz zbitych fragmentów masy komórkowej. Tak przygotowaną zawiesinę należy pozostawić na około 5 minut, aby zawieszone w niej większe fragmenty opadły na dno. Wówczas, pobieramy za pomocą pipety homogenną mieszaninę z górnej części probówki i przenosimy ją do nowej próbówki, zawierającej czysty płyn do inokulacji i w ten sposób przygotowujemy zawiesinę żądanej gęstości. Jeżeli badany drobnoustrój rośnie w postaci wyjątkowo suchych koloni można je zeskrobać z powierzchni agaru używając np. brzegu jałowego szkiełka mikroskopowego i dalej postępować jak wyżej. Krok 3: Inokulacja płytki GEN III Wylać przygotowaną zawiesinę drobnoustroju do sterylnego pojemnika tak, aby można ją było bez problemu pobierać za pomocą pipety wielokanałowej. Nałożyć końcówki na automatyczny pipetor wielokanałowy firmy Biolog lub inny po czym pobrać zawiesinę. 6

Przenieść do studzienek płytki GEN III po 100 µl zawiesiny (Rys. 2g). Należy uważać, aby nie przenosić opłaszczenia z jednej studzienki do drugiej oraz nie rozlewać zawiesiny pomiędzy studzienkami. Zaraz po przeniesieniu zawiesiny do studzienek przyjmie ona konsystencję żelową. Przykryć płytkę pokrywką. Krok 4: Inkubacja płytki GEN III Umieścić płytkę w OmniLogu (Rys. 2h) lub w zwykłej cieplarce. Inkubować przez okres 3-36 godzin w temp. 33ºC (lub według potrzeb i wymagań danego drobnoustroju). WYNIKI Odczyt i interpretacja wyników Mikropłytki GEN III odczytać przy użyciu oprogramowania Microbial Identification Systems firmy Biolog (np. OmniLog Data Collection). W tym celu należy postępować zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Do odczytu i interpretacji wyników nie potrzebne są żadne dodatkowe oprogramowania. Studzienki znajdujące się na płytce GEN III w kolumnach 1-9 powinny być porównane ze studzienką A-1, stanowiącą w tym przypadku kontrolę negatywną (studzienka A-1 powinna pozostać bezbarwna. Czasami można zaobserwować nieznaczne wybarwienie). Wszystkie studzienki o podobnym do A-1 poziomie wybarwienia powinno się uznać za negatywne (-). Natomiast studzienki o zdecydowanie bardziej intensywnym, fioletowym zabarwieniu w porównaniu do studzienki A-1 powinny zostać uznane za pozytywne (+). Studzienki nieznacznie wybarwione lub zawierające małe, fioletowe plamki powinno się określać jako pośrednie - borderline (/). Większość gatunków bakterii daje wyraźne reakcje pozytywne (kolor ciemnofioletowy). Jednakże, w przypadku niektórych drobnoustrojów reakcje pozytywne mogą być nieco słabsze (w kolorze jasnofioletowym). Studzienki znajdujące się na płytce GEN III w kolumnach 10-12 powinny być porównane ze studzienką A-10, stanowiącą w tym przypadku kontrolę pozytywną (studzienka A-10 powinna przyjmować kolor fioletowy podczas inkubacji mikropłytki). Wszystkie studzienki wykazujące choć o połowę słabsze zabarwienie niż studzienka A-10 powinny zostać uznane za negatywne (-) pod kątem wzrostu (co oznacza wrażliwość drobnoustroju na działanie zawartej w studzience substancji chemicznej). Z kolei, studzienki wykazujące zabarwienie zbliżone intensywnością do studzienki A-10 należy uznać za pozytywne (+) pod kątem wzrostu (co oznacza brak wrażliwości drobnoustroju na działanie zawartej w studzience substancji chemicznej). W przypadku trudności z zakwalifikowaniem danej studzienki jako (+) lub (-) najbezpieczniej jest uznać ją za wynik pośredni (/). Intensywne wybarwienie studzienki A-1 należy uznać za wynik fałszywie pozytywny. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia identyfikując zaledwie kilka gatunków bakterii (np. z rodzajów: Aeromonas, Vibrio oraz Bacillus). Wówczas, powinno się powtórzyć oznaczenie postępując zgodnie z wytycznymi protokołu B. W celu uzyskania dokładnych wskazówek co do interpretacji wyników identyfikacji należy zapoznać się z instrukcją obsługi oprogramowania Microbial Identification Systems firmy Biolog. 7

ŚRODKI OSTROŻNOŚCI W celu uzyskania precyzyjnych i powtarzalnych wyników powinno się przestrzegać poniższych zaleceń: Przed przystąpieniem do pracy należy dokładnie przeczytać instrukcję użytkowania płytki GEN III i postępować zgodnie z opisanymi w niej procedurami. Do identyfikacji używamy wyłącznie czystych hodowli (tzw. monokultur). Opisywana technologia nie jest przystosowana do identyfikacji drobnoustrojów z kultur mieszanych. Zastosowane podłoża hodowlane i wielokrotne pasażowanie bakterii może mieć istotny wpływ na ostateczny wynik identyfikacji. Szczepy mogą prezentować odmienne cechy fenotypowe w zależności od tego, jak są one hodowane przed przystąpieniem do wykonania oznaczenia. Realizując poszczególne etapy procedury należy pamiętać o zasadach pracy w warunkach aseptycznych. Zaleca się używanie materiałów jednorazowego użytku np. do przygotowania zawiesiny bakterii, itp. Materiały wielorazowego użytku zawierają niekiedy śladowe ilości detergentów co może mieć negatywny wpływ na ostateczne wyniki identyfikacji. Płytki GEN III i płyny do inokulacji należy przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej. Okresowa kalibracja turbidymetru jest wymagana, podobnie jak każdorazowe sprawdzanie prawidłowości jego wskazań. Co więcej, gęstości przygotowywanych zawiesin bakterii powinny zawsze odpowiadać zakresom wskazanym w odpowiednich procedurach. Płytki GENIII i płyny do inokulacji zawierają substancje wrażliwe na działanie światła i temperatury. Dlatego też, należy je przechowywać w warunkach chłodniczych, w ciemności. Brązowe lub żółte studzienki na płytce GEN III mogą świadczyć o pogorszenie jej właściwości. ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW Jeżeli wszystkie studzienki w kolumnach 1-9 są pozytywne (+) należy upewnić się, że: Płytka GEN III jest przeznaczona do identyfikacji badanego drobnoustroju. Jeśli studzienka A-1 jest fałszywie pozytywna należy powtórzyć oznaczenie postępując zgodnie z wytycznymi protokołu B. Nie przeniesiono żadnych substancji odżywczych do płynu do inokulacji (np. agaru przy pobieraniu kolonii bakterii). Przygotowana zawiesina bakterii jest homogenna. Gęstość przygotowanej zawiesiny drobnoustroju nie jest zbyt wysoka należy również sprawdzić prawidłowość działania turbidymetru. Studzienka A-1 zawiera odpowiednią ilość zawiesiny bakterii, czyli 100 µl. Jeżeli wszystkie studzienki w kolumnach 1-9 są negatywne (-) należy upewnić się, że: Płytka GEN III jest przeznaczona do identyfikacji badanego drobnoustroju (oligotrofy lub wolnorosnące bakterie wrażliwe na działanie tlenu mogą niedostatecznie wybarwiać studzienki płytki GEN III). Używamy do badania świeżej hodowli bakterii i rekomendowanego podłoża hodowlanego. Temperatura i inne parametry inkubacji są odpowiednio dobrane do potrzeb badanego drobnoustroju. 8

Płyn do inokulacji był właściwie przechowywany i ogrzany do temp. pokojowej przed użyciem. Używamy materiałów jednorazowego użytku (materiały wielorazowego użytku zawierają niekiedy resztki detergentów, które mogą działać toksycznie na bakterie). Gęstość przygotowanej zawiesiny drobnoustroju nie jest zbyt niska należy również sprawdzić prawidłowość działania turbidymetru. Studzienka A-1 zawiera odpowiednią ilość zawiesiny bakterii, czyli 100 µl. Kryteria skuteczności mikropłytki GEN III zostały określone poprzez utworzenie bazy danych w oparciu o testy na obszernej kolekcji mikroorganizmów z różnych źródeł. Baza danych została zaprojektowana tak, aby podawać wyniki identyfikacji wszystkich ujętych w niej gatunków zgodnie z obowiązującymi normami klasycznych metod identyfikacji i obecnej nomenklatury systematycznej. Aby uzyskać precyzyjne i powtarzalne wyniki wszystkie procedury oraz zalecenia zawarte w niniejszej instrukcji obsługi muszą być ściśle przestrzegane. OGRANICZENIA TESTU Płytka GEN III została zaprojektowana do identyfikacji czystych kultur Gramdodatnich i Gram-ujemnych bakterii tlenowych, zawartych w aktualnej wersji bazy danych. Inne gatunki nie uzyskają prawidłowego wyniku identyfikacji (uzyskamy komunikat brak identyfikacji ). Nietypowe szczepy mogą również prezentować niski stopień podobieństwa do wzorca w bazie danych i dlatego zostaną one określone jako brak identyfikacji. Opisywany produkt może być wykorzystywany wyłącznie do celów badawczych. Dla każdego izolatu, który został zidentyfikowany jako Salmonella, Shigella, Neisseria gonorrhoeae lub E. coli O157:H7 zalecane jest potwierdzenie serologiczne. Odpowiednie środki ostrożności i dodatkowe potwierdzenie identyfikacji powinny być stosowane wobec wszystkich izolatów podejrzewanych o charakter wysoce patogenny. KONTROLA JAKOŚCI Wszystkie odczynniki firmy Biolog muszą spełnić wewnętrzne standardy kontroli jakości zanim zostaną dopuszczone do sprzedaży. Jednocześnie, każde laboratorium może samodzielnie dokonać kontroli jakości zakupionych materiałów. W tym celu należy wykonać oznaczenia używając wymienionych poniżej gatunków bakterii i stosując się do wytycznych protokołu A: Escherichia coli ATCC 11775 Paenibacillus polymyxa ATCC 842 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Stenotrophomonas maltopkilia ATCC 13637 Jeżeli używamy liofilizowanych lub uprzednio zamrożonych kultur bakterii należy je przed badaniem pasażować przynajmniej dwukrotnie. Po inkubacji należy odczytać wyniki, które powinny odpowiadać tożsamości szczepu wzorcowego użytego do badania. Jeżeli wyniki identyfikacji nie są prawidłowe należy prześledzić procedurę badania, sprawdzić czystość szczepów i powtórzyć badanie. 9

POMOC TECHNICZNA Dystrybutor: BioMaxima S.A. Centrum Mikrobiologii Emapol ul. Budowlanych 68 80-298 Gdańsk Tel.: + 48 58 556 52 46 lub + 48 58 349 62 78 (wewnętrzny 52 lub 51) Fax: 58 341 12 49 E-mail: office_emapol@biomaxima.com www.biomaxima.com REFERENCJE 1. Bochner, BR 1989. Sleuthing out Bacterial Identities. Nature 339:157-158. 2. Bochner, BR 1989. Breathprints at the Microbial Level. ASM News 55:536-539. 3. Biolog, Inc., US Patent # 5,627,045. OmniLog, MicroPlate, Streakerz oraz Inoculatorz to znaki towarowe firmy Biolog. 10