AN MicroPlate TM. Instrukcja użytkowania. Przeznaczenie: wyłącznie do celów badawczych

Transkrypt

1 AN MicroPlate TM Instrukcja użytkowania Przeznaczenie: wyłącznie do celów badawczych Dystrybutor: BioMaxima S.A. Centrum Mikrobiologii Emapol ul. Budowlanych Gdańsk Tel.: lub (wewnętrzny 52 lub 51) Fax: office_emapol@biomaxima.com 1

2 PRZEZNACZENIE Mikropłytka AN umożliwia identyfikację szerokiego spektrum bakterii beztlenowych i mikroaerofilnych w oparciu o wyniki 95 różnych testów biochemicznych. Systemy Biolog - Microstation ID System lub OmniLog ID System - służą do odczytu i analizy wyników uzyskany przy użyciu płytek AN. OPIS PRODUKTU Rys. 1 Źródła węgla w poszczególnych studzienkach płytki AN. Charakterystyka bakterii przy użyciu płytek AN obejmuje 95 testów fenotypowych, opartych o metabolizm różnych źródeł węgla. Zdolność drobnoustrojów do metabolizowania poszczególnych źródeł węgla obecnych w studzienkach płytki AN określana jest na podstawie wyniku kolorymetrycznej reakcji redoks (zastosowany barwnik redoks to fiolet tetrazoliowy). Wszystkie niezbędne składniki odżywcze i biochemiczne opłaszczone są bezpośrednio w studzienkach 96-dołkowej płytki. Procedura wykonania oznaczenia jest szybka i prosta. Oznaczany szczep bakterii należy wyhodować na płytce Petriego z odpowiednim podłożem agarowym, po czym przygotować właściwej gęstości zawiesinę drobnoustroju w przeznaczonym do tego celu płynie do inokulacji (IF-AN). Następnie, zawiesina przenoszona jest na mikropłytkę AN (po 100 µl na studzienkę) i całość poddawana jest inkubacji (około godzinnej). Bezpośrednio po inokulacji wszystkie studzienki na płytce są bezbarwne. Jednakże w trakcie inkubacji, niektóre ze studzienek przyjmują barwę fioletową. Jest to spowodowane redukcją obecnego w studzienkach barwnika tetrazoliowego na skutek zachodzenia reakcji metabolicznych (sytuacja taka ma miejsce jeżeli drobnoustrój jest zdolny do metabolizowania zawartego w danej studzience źródła węgla). Studzienka A-1 nie zawierająca żadnego źródła węgla 2

3 stanowi kontrolę negatywną i nie powinna przyjmować zabarwienia fioletowego. Każdy identyfikowany drobnoustrój tworzy niepowtarzalny wzór, na który składają się układ i intensywność poszczególnych wybarwień. Porównanie przez system Biolog tego wzoru ze wzorcami w bazie danych stanowi ostatni etap procesu identyfikacji. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI W celu uzyskania precyzyjnych i powtarzalnych wyników powinno się przestrzegać poniższych zaleceń: Przed przystąpieniem do pracy należy dokładnie przeczytać instrukcję użytkowania płytki AN i postępować zgodnie z opisanymi w niej procedurami. Do identyfikacji używamy wyłącznie czystych hodowli (tzw. monokultur). Opisywana technologia nie jest przystosowana do identyfikacji drobnoustrojów z kultur mieszanych. Zastosowane podłoża hodowlane i wielokrotne pasażowanie bakterii może mieć istotny wpływ na ostateczny wynik identyfikacji. Szczepy mogą prezentować odmienne cechy fenotypowe w zależności od tego, jak są one hodowane przed przystąpieniem do wykonania oznaczenia. Realizując poszczególne etapy procedury należy pamiętać o zasadach pracy w warunkach aseptycznych. Zaleca się używanie materiałów jednorazowego użytku np. do przygotowania zawiesiny bakterii, itp. Materiały wielorazowego użytku zawierają niekiedy śladowe ilości detergentów co może mieć negatywny wpływ na ostateczne wyniki identyfikacji. Płytki AN i płyn do inokulacji IF-AN należy przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej. Okresowa kalibracja turbidymetru jest wymagana, podobnie jak każdorazowe sprawdzanie prawidłowości jego wskazań. Co więcej, gęstości przygotowywanych zawiesin bakterii powinny zawsze odpowiadać zakresom wskazanym w odpowiednich procedurach. Płytki AN i płyn do inokulacji IF-AN zawierają substancje wrażliwe na działanie światła i temperatury. Dlatego też, należy je przechowywać w warunkach chłodniczych, w ciemności. Ciemnobrązowe studzienki na płytce AN mogą świadczyć o pogorszenie jej właściwości. Niektóre studzienki mogą mieć zabarwienie żółtawe lub różowe i tym faktem nie należy się przejmować. Opakowanie każdej płytki AN zawiera absorber tlenu. Prawidłowo zapakowana mikropłytka AN wygląda jakby była pakowana próżniowo. Nie należy używać płytki w przypadku stwierdzenia braku szczelności opakowania. Płytki należy przechowywać w temp. 2-8ºC. Nie używać płytek po upływie terminu ważności. Materiały zapewnione: Mikropłytki: Biolog AN MicroPlate (nr kat. 1007) - 10 sztuk w opakowaniu. Przy odbiorze zamówienia należy sprawdzić czy towar nie został uszkodzony podczas transportu. Płytki należy przechowywać w temp. 2-8ºC. Nie należy używać płytek po upływie terminu ważności (data ważności umieszczona jest na opakowaniu każdej płytki). Materiały nie zapewnione: Podłoża hodowlane: BUA (Biolog Universal Anaerobe) Agar, 500 g (nr kat ); BUA Agar + 5% krwi baraniej (BUA + B Agar) (podłoże na płytkach, nr kat ). 3

4 Krążki antybiotykowe: Kanamycyna 1 mg. Płyn do inokulacji: IF-AN w zakręcanej probówce (20 x 113 mm) (nr kat ). Każda probówka zawiera około 14-14,5 ml sterylnego płynu do inokulacji, przygotowanego w warunkach beztlenowych (skład: NaCl 0,40%; Pluronic F-68 0,03%; Gellan Gum 0,02%; NaHCO 3 0,084%; zieleń metylenowa 0,000075%; tioglikolan sodu 0,0015%; ph 7,0-7,2). Inokulatorz TM : Sterylne wymazówki Inokulatorz TM (20x50 - nr kat. 3321; 100x1 nr kat. 3323). Streakerz TM : Sterylne, jednorazowe patyczki do przenoszenia kolonii drobnoustrojów (10x100 - nr kat. 3025; 50x ). Jednorazowe pipety: nr kat Reservoirs: Sterylne, jednorazowe rynienki do przenoszenia zawiesiny drobnoustrojów przy użyciu pipety wielokanałowej (nr kat. 3102). Elektroniczny pipetor wielokanałowy: nr kat Końcówki do elektronicznego pipetora wielokanałowego: Sterylne końcówki w pudełku (nr kat. 3201). Turbidymetr: nr kat Standardy turbidymetryczne: AN (nr kat. 3427). Materiały potrzebne do prowadzenia hodowli drobnoustrojów i inkubacji płytki AN w warunkach beztlenowych. PROCEDURA Przygotowanie wstępne Przed przystąpieniem do wykonania oznaczenia należy doprowadzić mikropłytkę AN i probówki z płynem do inokulacji do temp. pokojowej (około 25ºC) oraz uważnie przeczytać instrukcję użytkowania. Krok 1: Przygotowanie hodowli badanego drobnoustrój na odpowiednim podłożu agarowym Przygotować świeżą hodowlę badanego drobnoustroju (wymagana monokultura) na podłożu rekomendowanym przez firmę Biolog (najlepiej BUA + B Agar) - temp. inkubacji to 26, 30 lub 35-37ºC; warunki beztlenowe. W celu uzyskania możliwie najlepszej izolacji należy dokonywać posiewu metodą redukcyjną. Do badania najlepiej użyć hodowli z drugiego pasażu. Krok 2: Przygotowanie i charakterystyka materiału do badań Wykonać barwienie metodą Grama, co pozwoli zakwalifikować drobnoustrój do jednej z czterech kategorii: Gram-ujemne ziarniaki, Gram-ujemne pałeczki, Gramdodatnie ziarniaki lub Gram-dodatnie pałeczki (taka kategoryzacja ułatwia proces identyfikacji poprzez ukierunkowanie przeszukiwania bazy danych). Drobnoustroje należy hodować w optymalnych dla nich warunkach. Zastosowane podłoże agarowe musi wspomagać wzrost i sprzyjać zachowaniu pełnej aktywności metabolicznej identyfikowanego gatunku. W większości przypadków, drobnoustroje identyfikowane przy użyciu płytki AN powinny być hodowane na podłożu agarowym BUA + B, w warunkach beztlenowych i w temp ºC. Tylko nieliczne gatunki mogą wymagać innej temp. inkubacji: np. 30ºC (Lactobacillus melefermentas, Pectinatus cerevisiiphilus i frisingensis, Tetragenococcus halophilus, Zymomonas 4

5 mobilis, Zymophilus raffinosivorans i paucivorans) lub 26ºC (Lactobacillus collinoides i hilgardii, Leuconostoc gelidum). Dla szybko rosnących Gram-ujemnych pałeczek należy wykonać test wrażliwości na kanamycynę (przy użyciu krążków antybiotykowych o zawartości kanamycyny 1mg). Do badań wykorzystujemy wyłącznie świeże hodowle (aktywność metaboliczna niektórych drobnoustrojów znacznie słabnie w stacjonarnej fazie wzrostu). Zalecany czas inkubacji to dla większości mikroorganizmów godzin. Jeżeli po 48 godzinach inkubacji nie uzyskujemy wystarczającego wzrostu drobnoustroju to należy przedłużyć inkubację o kolejne 24 godziny lub przesiać bakterie na kilka płytek z podłożem agarowym i inkubować godziny. Krok 3: Przygotowanie inokulum Należy sprawdzić czy płyn do inokulacji IF-AN nie zawiera tlenu. Płyn IF-AN powinien być bezbarwny. Jeśli przyjmuje on barwę zielono-niebieską nie należy go używać (jednym ze składników płynu IF-AN jest zieleń metylenowa. Jeżeli płyn nie zawiera tlenu, wówczas zieleń metylenowa pozostaje bezbarwna. Na skutek utlenienia wskaźnika płyn do inokulacji przyjmuje barwę zielono-niebieską). Należy okresowo kalibrować turbidymetr. W tym celu używać odpowiednich standardów turbidymetrycznych (85%T i 65%T) i postępować zgodnie z instrukcjami doręczonymi przez producenta aparatu. Przed każdym oznaczeniem należy wyzerować turbidymetr (ustawić pokrętło turbidymetru na 100%T) przy użyciu probówki zawierającej czysty płyn do inokulacji. Następnie, należy sprawdzić wskazania turbidymetru przy użyciu standardu AN turbidity standard (tę czynność można przeprowadzić jednorazowo, przed serią pomiarów wykonywanych danego dnia). Przed umieszczeniem w turbidymetrze probówkę należy oczyścić papierowym ręcznikiem z wszelkich zabrudzeń. UWAGA: probówki zawierające płyn do inokulacji nie są optycznie jednolite. A zatem, turbidymetr musi być wyzerowany dla każdej probówki z osobna. Podczas przygotowywania homogennej zawiesiny drobnoustroju trzeba pamiętać o zachowaniu warunków beztlenowych. Inokulacja większej ilości płytek AN wymaga przygotowania zawiesin w komorze beztlenowej. Jeżeli jednak planujemy inokulację zaledwie kilku mikropłytek (nie więcej niż 6), wówczas zawiesiny mogą zostać szybko przygotowane w warunkach tlenowych. Jednakże, wszystkie zawiesiny powinny zostać sporządzone w czasie nie przekraczającym 5 minut. Za pomocą sterylnej, bawełnianej wymazówki przenosimy kolonie identyfikowanego drobnoustroju do płynu inokulacyjnego (uważamy, aby nie przenieść podłoża agarowego, na którym hodowano drobnoustrój). Zawiesina musi być homogenna! (nie może zawierać pływających skupisk komórek. Wszelkie grudki i zlepki komórek należy rozetrzeć lub usunąć z płynu do inokulacji przy użyciu wymazówki. Można również nieco odczekać, aż większe fragmenty opadną na dno probówki). Po uzyskaniu homogennej zawiesiny, określamy jej gęstość używając w tym celu turbidymetru. Jeżeli gęstość zawiesiny jest zbyt mała niż podana w instrukcji użytkowania płytki AN należy pobrać więcej materiału, jeśli jest zbyt duża dodajemy odpowiednią ilość płynu do inokulacji. Krok 4: Inokulacja płytki AN Poniższe czynności należy wykonać w warunkach tlenowych, sprawnie i stosunkowo szybko: W przypadku opornych na kanamycynę, Gram-ujemnych, szybko rosnących pałeczek należy otworzyć opakowanie i pozostawić płytkę AN na 20 minut przed inokulacją 5

6 w warunkach tlenowych. Dla wszystkich pozostałych bakterii opakowanie zawierające płytkę AN można otworzyć dopiero wtedy, gdy zawiesina drobnoustroju jest już przygotowana (po otwarciu płytki należy dokonać jej inokulacji w czasie nie przekraczającym 5 minut). Należy odpowiednio oznakować (podpisać) płytkę. Wylać przygotowaną zawiesinę drobnoustroju do sterylnego pojemnika tak, aby można ją było bez problemu pobierać za pomocą pipety wielokanałowej. Nałożyć końcówki na automatyczny pipetor wielokanałowy firmy Biolog lub inny po czym pobrać zawiesinę. Przenieść do studzienek płytki AN po 100 µl zawiesiny (zrobić to w czasie nie dłuższym niż 5 minut). Należy uważać, aby nie przenosić opłaszczenia z jednej studzienki do drugiej oraz nie rozlewać zawiesiny pomiędzy studzienkami. Zaraz po przeniesieniu zawiesiny do studzienek przyjmie ona konsystencję żelową. Przykryć płytkę pokrywką. Pozostawić płytkę na minut w warunkach tlenowych. Krok 5: Inkubacja płytki AN Inkubować płytkę w warunkach beztlenowych (i bez obecności wodoru) przez okres godziny i w temp ºC (lub według potrzeb i wymagań danego drobnoustroju). Zalecane jest używanie jako wskaźnika atmosfery beztlenowej pasków zawierających resazurynę zamiast błękitu metylenowego. Nie inkubować płytek w standardowej komorze beztlenowej (niektóre bakterie beztlenowe wykazują aktywność hydrogenazową i mogą w obecności wodoru redukować barwnik tetrazoliowy zawarty we wszystkich studzienkach płytki AN). WYNIKI Odczyt i interpretacja wyników Mikropłytki AN odczytać przy użyciu oprogramowania MicroLog1, MicroLog2 lub MicroLog3. W tym celu należy postępować zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Do odczytu i interpretacji wyników nie potrzebne są żadne dodatkowe oprogramowania. Intensywne wybarwienie studzienki A-1, która stanowi kontrolę negatywną należy uznać za wynik fałszywie pozytywny. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia identyfikując kilka gatunków bakterii (np. z rodzajów: Actinomyces, Bacteroides oraz Propionibacterium). Zazwyczaj reakcje fałszywie pozytywne prezentują nieznaczny stopień zabarwienia. Nie stanowi to problemu o ile studzienki z reakcjami pozytywnymi przyjmują wyraźny, ciemnofioletowy kolor. Jeżeli jednak identyfikowany drobnoustrój generuje silne tło, co czyni niemożliwym odróżnienie reakcji pozytywnych od negatywnych, wówczas należy powtórzyć oznaczenie inokulując mikropłytkę AN po uprzedniej, 20 minutowej ekspozycji na powietrzu (tzn. w warunkach tlenowych; patrz krok 4) i tabela na str. 7). Większość identyfikowanych bakterii daje wyraźne, ciemnofioletowe reakcje pozytywne. Jednocześnie, w przypadku niektórych drobnoustrojów kolor tych reakcji może być nieco jaśniejszy (np. dla bakterii z rodzaju Clostridium, Eubacterium, Fusobacterium, Prevotella lub Porphyromonas). System poda wynik identyfikacji jeśli współczynnik prawdopodobieństwa SIM po godzinach inkubacji płytki AN osiągnie wartość minimum 0,50. 6

7 Wyjątki Podłoże hodowlane BUA + B Temperatura 35-37ºC 30 lub 26ºC Atmosfera beztlenowa (mikropłytki AN należy inkubować w atmosferze beztlenowej, nie zawierającej również wodoru) Płyn do inokulacji IF-AN Gęstość zawiesiny do inokulacji 65%T Ekspozycja płytek AN na powietrzu (w warunkach tlenowych) - krócej niż 5 minut w warunkach tlenowych tuż przed inokulacją płytki; minut w warunkach tlenowych po inokulacji płytki 20 minut w warunkach tlenowych przed inokulacją płytki w przypadku: a) opornych na kanamycynę, Gramujemnych, szybko rosnących pałeczek; b) szczepów generujących silne tło ( fałszywie pozytywne wybarwienie studzienek) Ilość zawiesiny drobnoustroju w jednej studzience płytki AN 100 ml Czas inkubacji godz. Tabela 1. Podsumowanie kluczowych parametrów wykonania oznaczenia przy użyciu płytki AN ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW W przypadku jakichkolwiek problemów z wykonaniem oznaczenia należy dokładnie zapoznać się z niniejszą instrukcją postępowania i zweryfikować poprawność wykonania jej poszczególnych etapów. Jeżeli wszystkie studzienki w kolumnach są pozytywne (+) należy upewnić się, że: Inkubujemy płytki AN w warunkach beztlenowych i bez obecności wodoru (wiele bakterii beztlenowych posiada właściwości hydrogenazowe i będzie redukowało barwnik tetrazoliowy tworząc fioletowe zabarwienie studzienek w obecności wodoru). Nie przeniesiono żadnych substancji odżywczych do płynu do inokulacji (np. agaru przy pobieraniu kolonii bakterii). Przygotowana zawiesina bakterii jest homogenna. Gęstość przygotowanej zawiesiny drobnoustroju nie jest zbyt wysoka należy również sprawdzić prawidłowość działania turbidymetru. Studzienka A-1 zawiera odpowiednią ilość zawiesiny bakterii, czyli 100 µl. Płytka AN tuż po zainokulowaniu była poddana minutowej ekspozycji na powietrzu. Wykonano test oporności na kanamycynę dla szybko rosnących, Gram-ujemnych pałeczek. Jeżeli wszystkie studzienki są negatywne (-) należy upewnić się, że: 7

8 Płytka AN była przechowywana do momentu użycia w atmosferze beztlenowej (opakowanie płytki AN do momentu jej użycia pozostało szczelne). Używamy do badania świeżej hodowli bakterii i rekomendowanego podłoża hodowlanego. Temperatura i inne parametry inkubacji są odpowiednio dobrane do potrzeb badanego drobnoustroju. Płyn do inokulacji był właściwie przechowywany i ogrzany do temp. pokojowej przed użyciem. Należy również zwrócić uwagę, czy płyn do inokulacji przed otworzeniem probówki nie zawierał tlenu (nadający się do użycia roztwór IF-AN, zawierający jako indykator zieleń metylenową, powinien być bezbarwny). Używamy materiałów jednorazowego użytku (materiały wielorazowego użytku zawierają niekiedy resztki detergentów, które mogą działać toksycznie na bakterie). Gęstość przygotowanej zawiesiny drobnoustroju nie jest zbyt niska należy również sprawdzić prawidłowość działania turbidymetru. Studzienka A-1 zawiera odpowiednią ilość zawiesiny bakterii, czyli 100 µl. Płytka AN nie była wystawiona na działanie tlenu przez czas dłuższy niż 20 minut podczas całego procesu jej przygotowania do inkubacji. Płytka AN była inkubowana w warunkach beztlenowych. Kryteria skuteczności mikropłytki AN zostały określone poprzez utworzenie bazy danych w oparciu o testy na obszernej kolekcji mikroorganizmów z różnych źródeł. Baza danych została zaprojektowana tak, aby podawać wyniki identyfikacji wszystkich ujętych w niej gatunków zgodnie z obowiązującymi normami klasycznych metod identyfikacji i obecnej nomenklatury systematycznej. Aby uzyskać precyzyjne i powtarzalne wyniki wszystkie procedury oraz zalecenia zawarte w niniejszej instrukcji obsługi muszą być ściśle przestrzegane. OGRANICZENIA TESTU Płytka AN została zaprojektowana do identyfikacji czystych kultur bakterii beztlenowych i mikroaerofilnych, zawartych w aktualnej wersji bazy danych. Inne gatunki nie uzyskają prawidłowego wyniku identyfikacji (uzyskamy komunikat brak identyfikacji ). Nietypowe szczepy mogą również prezentować niski stopień podobieństwa do wzorca w bazie danych i dlatego zostaną one określone jako brak identyfikacji. Opisywany produkt może być wykorzystywany wyłącznie do celów badawczych. KONTROLA JAKOŚCI Wszystkie odczynniki firmy Biolog muszą spełnić wewnętrzne standardy kontroli jakości zanim zostaną dopuszczone do sprzedaży. Jednocześnie, każde laboratorium może samodzielnie dokonać kontroli jakości zakupionych materiałów. W tym celu należy wykonać oznaczenia używając wymienionych poniżej gatunków bakterii, stosując się do wytycznych instrukcji użytkowania płytki AN: Bifidobacterium breve ATCC Clostridium sordellii ATCC 9714 Lactobacillus casei ATCC 393 Micromonas micros ATCC Jeżeli używamy liofilizowanych lub uprzednio zamrożonych kultur bakterii należy je przed badaniem pasażować przynajmniej dwukrotnie. Po inkubacji (około godzinnej) należy odczytać wyniki, które powinny odpowiadać tożsamości szczepu wzorcowego użytego do 8

9 badania. Jeżeli wyniki identyfikacji nie są prawidłowe należy prześledzić procedurę badania, sprawdzić czystość szczepów i powtórzyć badanie. POMOC TECHNICZNA Dystrybutor: BioMaxima S.A. Centrum Mikrobiologii Emapol ul. Budowlanych Gdańsk Tel.: lub (wewnętrzny 52 lub 51) Fax: office_emapol@biomaxima.com REFERENCJE 1. Bochner, BR Sleuthing out Bacterial Identities. Nature 339: Bochner, BR Breathprints at the Microbial Level. ASM News 55: Biolog, Inc., US Patent # 5,627,045. OmniLog, MicroPlate, Streakerz oraz Inoculatorz to znaki towarowe firmy Biolog. 9