RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)164743 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 286648 (22) Data zgłoszenia: 28.08.1990 (54) IntCl5: C12J 1/04 C12P 7/54 C12R 1:02 (54) Sposób wytwarzania octu (43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.03.1992 BUP 05/92 (73) Uprawniony z patentu: Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa, PL (72) Twórcy wynalazku: Jerzy Czuba, Warszawa, PL Irena Sikorska, Warszawa, PL Katarzyna Warowna, Warszawa, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.1994 WUP 10/94 (74) Pełnomocnik: Roszkowski Adam, Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego (57) 1. Sposób wytwarzania octu przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter, według znanej technologii, znamienny tym, że do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep Acetobacter aceti MW-2, wyizolowany i przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu o konsystencji półciekłej, zawierającym agar, źródło biostymulatorów, źródło węgla oraz źródła fosforu, azotu, potasu i magnezu oraz alkohol etylowy i kwas octowy. PL 164743 B1
Sposób wytwarzania octu Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania octu przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter, według znanej technologii, znamienny tym, że do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep Acetobacter aceti MW-2, wyizolowany i przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu o konsystencji półciekłej, zawierającym agar, źródło biostymulatorów, źródło węgla oraz źródła fosforu, azotu, potasu i magnezu oraz alkohol etylowy i kwas octowy. 2. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że w półciekłym podłożu stosowanym do izolacji i przechowywania szczepu Acetobacter aceti MW-2 suma stężenia alkoholu etylowego wyrażonego w % objętościowych i stężenia kwasu octowego wyrażonego w g/100 cm3 wynosi 10-14%, korzystnie 11-12%. 3. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że w półciekłym podłożu stosowanym do izolacji i przechowywania szczepu Acetobacter aceti MW-2 jako źródło biostymulatorów stosuje się octowy wyciąg biomasy drożdżowej w dawce 5-15 g/dm3, korzystnie 10 cm3/dm3, jako źródło węgla glukozę w dawce 0,5-2 g/dm3, korzystnie 1 g/dm3, jako źródło fosforu i azotu fosforan dwuamonowy w dawce 0,2-0,8 g/dm3, korzystnie 0,45 g/dm3, jako źródło potasu siarczan potasu w dawce 0,05-0,2 g/dm3, korzystnie 0,13 g/dm3, jako źródło magnezu siedmiowodny siarczan magnezu w dawce 0,1-0,5 g/dm3, korzystnie 0,3 g/dm3. 4. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że dawka agaru dodawanego do podłoża wynosi 0,2-0,5 g/dm3, korzystnie 0,3 g/dm3. 5. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że w odstępach od 3 do 30 dni, w zależności od temperatury hodowli i wzrostu bakterii są one przeszczepiane na świeże podłoże półciekłe. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania octu przy użyciu bakterii rodzaju Acetobacter. W znanym sposobie wytwarzania octu ze spirytusu, przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter otrzymuje się najczęściej ocet o zawartości kwasu octowego powyżej 10%. W procesie wytwarzania octu o takim stężeniu najniższe stężenie kwasu octowego wynosi 5-7 g/1 0 0 cm3. Bakterie rodzaju Acetobacter występujące w naturze nie są oporne na tak wysokie stężenia kwasu octowego. Również bakterie hodowane na ogólnie stosowanych podłożach laboratoryjnych, wyizolowane z fermentorów przemysłowych, nie wykazują takiej oporności. Z dotychczasowej praktyki wynika, że jedynie bakterie obecne w occie zachowują swe korzystne dla procesu technologicznego cechy. W tym celu do uruchomienia fermentacji stosuje się ocet zarodowy. Octem zarodowym jest ocet zawierający alkohol w stężeniu najczęściej 1-2% objętościowych i przechowywany w temperaturze od kilkunastu do dwudziestu kilku stopni Celsjusza, z dostępem powietrza. Sposób fermentacji z wykorzystaniem octu zarodowego, powszechnie stosowany nie gwarantuje warunków, w których fermentacja będzie prowadzona przy użyciu najbardziej korzystnego szczepu bakterii, tym bardziej, że proces fermentacji octowej jest prowadzony w niesterylnych warunkach. Ponadto, występujące zmiany warunków procesu wpływają na zmiany jakościowego składu mikroflory czynnej w tym procesie, a także na degeneracje występującej w danym fermentorze mikroflory. Ocet zarodowy pochodzący z takiego fermentora nie może więc zawierać najkorzystniejszych szczepów bakterii rodzaju Acetobacter.
164 743 3 Przy zastosowaniu wgłębnej metody wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego ponad 10%, w znany sposób, produktywność procesu wynosi 20-30 kg kwasu octowego w przeliczeniu na 1 m3 fermentowanej cieczy w ciągu 24 godzin. Zastosowanie czystej kultury bakterii o korzystnych cechach technologicznych jest podane w patencie bułgarskim nr 18 499. Opisany jest szczep Acetobacter xylinum 049, który może być stosowany w produkcji octu winnego metodą wgłębną. Szczep ten został wyizolowany z fermentora przemysłowego bez wykorzystania czynników mutagennych. Wyizolowaną czystą kulturę przechowuje się na skośnym agarze brzęczkowym zawierającym 3% alkoholu i 0,2% kwasu octowego. Kulturą 48-godzinną z 50 probówek szczepi się 45 dm3wody drożdżowej z dodatkiem 1 % alkoholu i 0,2% kwasu octowego i inkubuje w warunkach wgłębnych w ciągu 48 godzin w temperaturze 28 C. Następnie, cieczą pohodowlaną szczepi się 250 dm3 wina rozcieńczonego do stężenia 6 % alkoholu i zawierającego 0,1% autolizatu drożdżowego. Po 2-3 dniach hodowli przefermentowane wino jest stosowane do szczepienia kolejnych, coraz większych objętości wina. Za każdym razem inoculum stanowi 15-20% objętości szczepionej cieczy. Szczep Acetobacter xylinum 049 wytwarza kwas octowy maksymalnie do stężenia 7,9%, a proces fermentacji w fermentorze wgłębnym trwa 2-4 doby. Szczep ten nie nadaje się do zastosowania w fermentorach ociekowych ze względu na tworzenie dużych ilości śluzu. Ze względu na niskie stężenie kwasu octowego jakie można uzyskać przy użyciu szczepu Acetobacter xylinum nie może on mieć praktycznego zastosowania w procesie wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10%. Celem wynalazku jest optymalizacja procesu wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10% przez zapoczątkowanie fermentacji przy użyciu wyselekcjonowanego szczepu bakterii o znanych, korzystnych cechach biotechnologicznych, charakteryzującego się w szczególności opornością na stężenia kwasu octowego występujące w procesie technologicznym oraz wysoką aktywnością i zdolnością rozmnażania się w tych warunkach. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że bakterie rodzaju Acetobacter wykazujące najwyższą aktywność w procesie fermentacji, hodowane na powszechnie stosowanych podłożach z agarem (na skosach lub płytkach), zawierających do 4% alkoholu, nie/lub zawierających niewielką ilość kwasu octowego nie rosną lub rosną bardzo powoli. Trudności związane ze wzrostem bakterii na podłożach o konsystencji stałej wiążą się z utrudnioną dyfuzją składników podłoża do strefy wzrostu bakterii z pozostałych stref. Ponadto bakterie hodowane na takich podłożach nie wykazują oporności na stężenie kwasu octowego występujące w procesie technologicznym otrzymywania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10 g/ 100 cm3. Powierzchniowa, stacjonarna hodowla bakterii rodzaju Acetobacter na podłożach ciekłych (bez agaru) jest trudna. Bakterie te można hodować przy stężeniach kwasu octowego i alkoholu występujących w procesie technologicznym, jednak wysokie stężenie kwasu octowego w znaczny sposób opóźnia ich wzrost. Pojedyncze komórki bakterii z trudnością utrzymują się na powierzchni cieczy i często, zanim utworzą kożuszek, opadają w głąb cieczy i tam giną ze względu na niedobór tlenu. Podłoże o konsystencji półciekłej według wynalazku, z jednej strony pozwala na dostateczną szybkość dyfuzji składników, z drugiej strony na utrzymywanie się nawet pojedynczych komórek bakterii na powierzchni podłoża. Dzięki temu możliwa jest sprawna hodowla i selekcja bakterii rodzaju Acetobacter przydatnych w procesie technologicznym. Przy zastosowaniu takiego podłoża udało się wyselekcjonować szczep Acetpbacter aceti, bez stosowania czynników mutagennych, wykazujący wysoką oporność na kwas octowy oraz wysoką aktywność i zdolność wzrostu w warunkach procesu technologicznego wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10%. Szczep oznaczony symbolem MW-2, nie wytwarza śluzu i może być stosowany do zapoczątkowania fermentacji octowej w fermentorach ociekowych (generatorach). Nieoczekiwanie okazało się, że przy użyciu wyizolowanego szczepu Acetobacter aceti MW-2, wybranego spośród kilkudziesięciu szczepów bakterii tego gatunku, wyizolowanych z fermentorów przemysłowych, możliwe jest uzyskiwanie w warunkach wgłębnej fermentacji,
4 164 743 octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10%, z produktywnością ponad 70 kg kwasu octowego w przeliczeniu na 1 m3 fermentowanej cieczy w ciągu 24 godzin. Istota wynalazku polega na tym, że w procesie wytwarzania octu do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep Acetobacter aceti MW-2, który został wyizolowany i jest przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu o konsystencji półciekłej zawierającym agar, źródło biostymulatorów, źródło węgla oraz źródła fosforu, azotu, potasu i magnezu oraz alkohol etylowy i kwas octowy. W półciekłym podłożu stosowanym do izolacji i przechowywaniu szczepu Acetobacter aceti suma stężenia alkoholu etylowego, wyrażonego w % objętościowych i stężenia kwasu octowego wyrażonego w g/1 0 0 cm3, podobnie jak w brzeczce fermentacyjnej stosowanej w procesie technologicznym, wynosi 10-14%, korzystnie 11-12%. W podłożu tym jako źródło biostymulatorów stosuje się octowy wyciąg biomasy drożdżowej w dawce 5-15 cm3/dm3, korzystnie 10 cm3/dm3, jako źródło węgla glukozę w dawce 0,5-2 g/dm3, korzystnie 1 g/dm3, jako źródło fosforu i azotu fosforan dwuamonowy w dawce 0,2-0,8 g/dm3, korzystnie 0,45 g/dm3, jako źródło potasu siarczan potasu w dawce 0,05-0,2 g/dm3, korzystnie 0,13 g/dm3, jako źródło magnezu siedmiowodny siarczan magnezu w dawce 0,1-0,5 g/dm3, korzystnie 0,3 g/dm3, czynnikiem nadającym konsystencję podłożu jest agar w dawce 2-5 g/dm3, korzystnie 3 g/dm3. Hodowlę bakterii prowadzi się w temperaturze 15-30 C, korzystnie 18-22 C (przechowywanie w temperaturze pokojowej), lub 26-29 C (hodowla w cieplarce), w odstępach od 3 do 30 dni, w zależności od temperatury hodowli i szybkości wzrostu bakterii są one przeszczepiane na świeże podłoże. Ważnym elementem tej hodowli jest przeszczepianie bakterii w momencie, gdy stężenie alkoholu w podłożu obniży się do 1-1,5% objętościowych. Bakterie rozmnożone na podłożu półciekłym są następnie przenoszone do fermentora o objętości kilku dm3, zawierającego podłoże produkcyjne. Zawartością tego fermentora jest szczepiony fermentor przemysłowy, w którym fermentacja jest prowadzona w znany sposób, czyli po odfermentowaniu alkoholu do 0,2-0,5% objętościowych, 20-50% zawartości fermentora wymienia się na świeżą brzeczkę o zawartości alkoholu 10-14% objętościowych i 1-2% kwasu octowego przy nieprzerywanym napowietrzaniu. Temperaturę fermentacji utrzymuje się na stałym poziomie w granicach 26-34 C, korzystnie 28 C. Cykl ten jest powtarzany w zależności od potrzeb. W miarę wzrostu szybkości fermentacji w obu fermentorach powiększa się intensywność napowietrzania, która nie powinna być wyższa niż 0,21-0,25 objętości powietrza na objętość cieczy na minutę. Po upływie kilku dni, najpierw w fermentorze laboratoryjnym, a następnie w przemysłowym, uzyskuje się przebieg fermentacji z produktywnością około 70 kg kwasu octowego w przeliczeniu na 1 m3 fermentowanej cieczy w ciągu 24 godzin. Szczep Acetobacter aceti MW-2 użyty do sposobu według wynalazku, został wyselekcjonowany w Instytucie Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego z kultury bakterii pobranej z fermentora przemysłowego w ten sposób, że ocet pobrany z fermentora przemysłowego stanowił materiał szczepienny do uruchomienia fermentacji wgłębnej w fermentorze mikrotechnicznym o objętości roboczej 3 dm3. Fermentor ten wyposażony w tlenomierz i możliwość regulacji intensywności napowietrzania pozwalał na prowadzenie hodowli bakterii w warunkach stężeń kwasu octowego i alkoholu występujących w fermentorach przemysłowych z jednoczesnym dostosowaniem intensywności napowietrzania w taki sposób, by nie dopuścić do ograniczenia szybkości fermentacji poprzez niedobór tlenu. W fermentorze tym prowadzono fermentację w ten sposób, że po przefermentowaniu alkoholu do stężenia około 0,5% objętościowych połowę jego zawartości wymieniano na świeżą brzeczkę zawierającą 10-11% objętościowych alkoholu etylowego i około 1 g/100 cm3 kwasu octowego. W sumie z fermentorów przemysłowych wyizolowano kilkadziesiąt szczepów bakterii rodzaju Acetobacter. W odróżnieniu od innych szczepów okazało się, że szczep o symbolu MW-2 nie wykazywał wzrostu po przeszczepieniu na podłoża powszechnie stosowane do identyfikacji bakterii Acetobacter tzn. nie zawierające kwasu octowego. W celu umożliwienia jego identyfikacji, niezbędna okazała się adaptacja komórek poprzez przeprowadzenie co najmniej jednego pasażu na podłożu o niskim stężeniu kwasu octowego, korzystnie na podłożu półciekłym zawierającym 1 g/100 cm3 kwasu octowego i 3% objętościowych alkoholu etylowego.
164743 5 Szczep Acetobacter aceti MW-2 wykazuje wyłącznie metabolizm oddechowy. Tworzy katalazę, utlenia alkohol do kwasu octowego, a następnie do wody i dwutlenku węgla. Utlenia mleczany. Tworzy kwas z glukozy, jest ketogenny względem glicerolu, rośnie na etanolu jako jedynym źródle węgla i energii. Nie tworzy celulozy, nie tworzy brunatnego pigmentu. Komórki są elipsoidalne lub w kształcie krótkich pałeczek, występują pojedynczo, parami lub w łańcuszkach, są nieruchliwe, nie tworzą przetrwalników, są Gram- ujemne. Na podłożach o ph poniżej 4,5 - rosną i utleniają alkohol. Tabela przedstawia biotechnologiczną charakterystykę szczepu Acetobacter aceti MW-2 w warunkach wyrównanego przebiegu wgłębnej hodowli. Tabela Nr kolejny cyklu fermentacyjnego Czas trwania cyklu fermentacyjnego [b] Końcowa zawartość kwasu octowego g/100 cm3 Zawartość biomasy bakterii jako s.m. mg/dm3 Właściwa szybkość tworzenia produktu mg/mg/h 1 14,75 10,28 170,5 23,0 2 14,25 10,28 185,0 23,3 3 14,50 10,35 178,0 23,2 4 14,50 10,30 185,4 22,4 5 14,25 10,02 181,6 21,5 6 15,00 10,38 176,0 23,3 Przykład. Roztwór zawierający składniki pożywki w dawkach na 1 dm3: 10 cm3 octowego wyciągu z biomasy drożdży piekarskich 1g glukozy, 0,45g fosforanu dwuamonowego, 0,13g siarczanu potasu, 0,3g siedmiowodnego siarczanu magnezu, rozlewa się po 90 cm3 do sterylnych kolb stożkowych na 250 cm3 i dodaje po 0,3g agaru do każdej kolby. Kolby, po zamknięciu sterylnym korkiem z waty, na okres 30-40 minut, umieszcza się na wrzącej łaźni wodnej do momentu rozpławienia agaru. Do każdej kolby dodaje się po 7 cm3 lub 8 cm3 lodowatego kwasu octowego. W okresie rozpławiania agaru i stygnięcia, bezpośrednio po dodaniu kwasu octowego, następuje wyjaławianie podłoża. Po ostygnięciu do około 40 C, do kolb dodaje się jałowo po 4,2 cm3 spirytusu rektyfikowanego. Na podłożu tym w warunkach stacjonarnej hodowli powierzchniowej przechowuje się wyizolowany szczep Acetobacter aceti MW-2 przez kilka lat z zachowaniem niezmiennych cech jego przydatności technologicznej. Hodowlę prowadzi się w cieplarce w temperaturze 26-29 C, lub w temperaturze pokojowej. W zależności od warunków hodowli, przeszczepień na kolejne, świeże podłoże dokonuje się w odstępach 3-30 dni. Bakteriami z jednej kolby może być szczepione podłoże w jednej lub w dwóch, trzech kolbach. Jako pośrednie stadium stosuje się fermentor laboratoryjny o objętości kilku dm3. W opisywanym przykładzie stosuje się fermentor o objętości około 4 dm3. Przed przystąpieniem do szczepienia fermentora przygotowuje się w nim 2 dm3 mieszaniny octu i brzeczki fermentacyjnej. Mieszanina ta zawiera 7 g/100 cm3 kwasu octowego i 4% objętościowych alkoholu. Zawartość fermentora pasteryzuje się w temperaturze 70-90 C przez kilka minut. Stosowana brzeczka zawiera 11% objętościowych alkoholu i 1 g/100 cm3kwasu octowego oraz składniki pożywki w następujących dawkach: wyciąg drożdżowy w dawce 0,75 cm3/dm3, glukozę w dawce 1,5 g/dm3, fosforan dwuamonowy w dawce 0,42 g/dm3, siarczan potasu w dawce 0,12 g/dm3, siedmiowodny siarczan magnezu w dawce 0,25 g/dm3. Przed szczepieniem uruchamia się mieszadło w fermentorze i doprowadza temperaturę cieczy do około 28 C. Ciecz zawartą w fermentorze szczepi się biomasą bakterii zebraną z powierzchni podłoża półciekłego z kilku do dwudziestu kilku kolb. Od tego momentu temperaturę cieczy utrzymuje się na stałym poziomie natomiast intensywność mieszania i napowietrzania
6 164743 dostosowuje się do szybkości pobierania tlenu przez bakterie. Najkorzystniejsze jest utrzymywanie w tym okresie stopnia nasycenia cieczy tlenem w granicach 50-70%. Wskazane jest dolewanie do fermentora, co najmniej raz na dobę, po około 100 cm3 mieszaniny octu i brzeczki o podanym wcześniej składzie. Po odfermentowaniu alkoholu do 0,5% objętościowych z fermentora usuwa się część cieczy, pozostawiając około 1,5 dm3 i dodaje taką samą objętość brzeczki. Jednocześnie fermentor przemysłowy napełnia się mieszaniną brzeczki i octu, która zawiera około 4% objętościowych alkoholu i 7 g/100 cm3 kwasu octowego, podobnie jak w fermentorze laboratoryjnym przed jego szczepieniem kulturą bakterii pobraną z podłoża półciekłego. Mieszaninę tę napowietrza się i doprowadza do temperatury 25-28 C. Następnie zawartość fermentora przemysłowego szczepi się inoculum pochodzącym z fermentora laboratoryjnego, w którym prowadzi się fermentacje w znany sposób, przy czym ocet otrzymywany w kolejnych cyklach fermentacyjnych dodaje się, bez przerw w napowietrzaniu, do napowietrzonej brzeczki w fermentorze przemysłowym. Po wlaniu kilku partii cieczy z fermentora laboratoryjnego do fermentora przemysłowego stwierdza się przyrost zawartości kwasu octowego. Po osiągnięciu przyrostu zawartości kwasu octowego powyżej 0,5 g/100 cm3 w ciągu doby proces szczepienia fermentora przemysłowego można uznać za zakończony. Od tego momentu fermentację prowadzi się w znany sposób. Ocet otrzymywany w fermentorze przemysłowym jest następnie stosowany do zapoczątkowania fermentacji w kolejnych fermentorach przemysłowych w znany sposób. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 cgz. Cena 10 000 zł