ĆWICZENIE IV Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak WYKRYWANIE OBECNOŚCI BAKTERII Z RODZAJU LISTERIA W ŻYWNOŚCI Wstęp Rodzaj Listeria należy do typu Firmicutes wspólnie z rodzajem Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus oraz Clostridium. Listeria monocytogenes, główny przedstawiciel tego rodzaju, jest jednym z sześciu gatunków należących do tego rodzaju. Pozostałe gatunki to: L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri oraz L. grayi. Wśród wyżej wymienionych gatunków tylko dwa są patogenne i są to: L. monocytogenes będący patogenem zarówno ludzi jak i zwierząt oraz L. ivanovii infekująca zwierzęta, głównie owce i bydło. Pojawiają się również nieliczne raporty, w których opisywane są przypadki listeriozy u ludzi wywołanej przez L. ivanovii i L. seeligeri. L. monocytogenes to mała (0,5-2 μm długości i 0,4-0,5 μm szerokości) gramdodatnia ieprzetrwalnikująca pałeczka, wykazująca tendencję do polimorfizmu. W zakresie temperatur 20-25 o C bakteria ta jest zdolna do ruchu przy pomocy rzęsek. Jednak w temperaturze 37 o C produkcja flageliny (białka budującego rzęskę) jest ograniczona, co powoduje brak zdolności poruszania się Bakteria ta jest względnym tlenowcem. Jest katalazo-dodatnia, oksydazoujemna. Wytwarza również β hemolizynę tworzącą strefy przejaśnienia na krwawym agarze L. monocytogenes jest bakterią powszechnie bytującą w środowisku naturalnym. Występuje w glebie, wodzie, roślinach, ściekach, w przewodach pokarmowych wielu gatunków zwierząt domowych i dzikich. Drobnoustrój ten rośnie w bardzo szerokim zakresie temperatur (1-45 o C), ph (4,3-9,6), toleruje wysokie stężenia soli (do 10%) i niską aktywność wodną 0,83. Konsekwencją powszechnego występowania tego mikroorganizmu w środowisku, jego relatywnie wysokiej odporności na czynniki fizyko-chemiczne, a także wyjątkowej w świecie bakterii zdolności nie tylko do przeżycia, ale również do namnażania się w szerokim zakresie temperatur, jest jego obecność w surowcach zwierzęcych i roślinnych oraz produktach spożywczych. Szacuje się, że 99% przypadków listeriozy u ludzi jest spowodowanych spożyciem żywności zanieczyszczonej tym drobnoustrojem. Częsta obecność L. monocytogenes w żywności w połączeniu z wysoką śmiertelnością w wyniku infekcji wywołanej przez ten patogen (sięgającą od 20 do 30%) zdecydowanie wyróżnia listeriozę spośród innych zatruć pokarmowych i stanowi poważny publiczny problem zdrowotny. Celem ćwiczenia jest wykrycie obecności bakterii z rodzaju Listeria, w tym L. monocytegens w różnych rodzajach żywności zgodnie z procedurą opisaną w normie Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Listeria monocytogenes PN EN ISO 11290-1999/A1:2005. Metoda wykrywania obecności Wykrywanie obecności L. monocytogenes w próbkach żywności obejmuje kilka etapów: I. Wstępne namnażanie w płynnej pożywce pół-selektywnej bulion pół-fraser II. Namnażanie wtórne w płynnej pożywce selektywnej bulion Fraser III. Różnicowanie na podłożach agarowych agar ALOA, agar Palcam lub Oxford IV. Identyfikacja na podstawie testów biochemicznnych
I. Schemat badania 1. Odważyć odpowiednią naważkę badanej próbki żywności. 9 x pożywki płynnej selektywnej Próbka badana ( x g lub x ml ) bulion pół Frasera podczas inkubacji zaczernienie pożywki (inkubacja 30 C, 24 godz.±2) 0,1 ml hodowli 2. 10 ml bulion Frasera (inkubacja 37 C, 48 ± 2 godz) 3. Agar Oxford lub Palcam Agar ALOA Agar ALOA Agar Oxford lub Palcam Posiew Agar ALOA - inkubacja w 37 C przez 24 godz.±3 do 48 godz.±3 Agar Oxford lub Palcam inkubacja w temperaturze zalecanej przez producenta przez 24 godz.±3 do 48 godz.±3 agar ALOA zielononiebieskie kolonie otoczone mętną strefą lub nie agar Oxford - kolonie szare, otoczone strefą zaczernienia, 1mm średnicy, po 48 godz. ciemnoszare z zielonkawym odcieniem, pępkowate zagłębienie z wyraźną strefą zaczernienia wokół kolonii. agar Palcam kolonie małe lub bardzo małe, oliwkowozielone lub szarozielone, czasami z czarno zabarwionym środkiem, zawsze z czarną otoczką. Po 48 godz. zielone kolonie, średnicy od 1.5 mm do 2 mm z charakterystycznym wgłębieniem w środku. 4. Testy potwierdzające Z każdej pożywki agarowej pobrać po 1 podejrzanej kolonii Posiew rysowy na podłoże agarowe TSYEA (inkubacja 37 C, 18-24 godz. ) kolonie wypukłe, bezbarwne, nieprzezroczyste
4.1 Testy potwierdzające dla Listeria sp. Katalaza - dodatnia TSYEA Barwienie Grama - G +, cienkie, krótkie pałeczki Zdolność ruchu (inkubacja 25 C, 8 24 godz.) do zmętnienia pożywki Wykrywanie katalazy Pobrać pełne oczko hodowli wyrosłej na TSYEA i zawiesić w kropli roztworu nadtlenku wodoru na czystym szkiełku mikroskopowym. Wynik testu jest dodatni, jeżeli w ciągu 30 s pojawią się pęcherzyki gazu. Kontrola dodatnia - Staphylococcus aureus Kontrola ujemna Enterococcus faecalis Test na wykrywanie zdolności ruchu Posiew kłuty, za pomocą igły inokulacyjnej agaru półpłynnego materiałem pobranym z pożywki TSYEA. Posiewy inkubować w cieplarce w temperaturze 25 o C przez 48 godz. 4.2 Testy potwierdzające dla L. monocytogenes Test na hemolizę Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże agar z krwią, wykonując jednocześnie w przypadku każdej hodowli posiew kłuty w jednym miejscu. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 o C przez 24 godz. Test Camp Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże agar z krwią zgodnie ze schematem przedstawionym poniżej. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 o C przez 24 godz. S - Staphylococcus aureus ATCC 25923 R - Rhodococcus equi ATCC 6939 R S
Fermentacja ramnozy i ksylozy Pobrać materiał z podłoża TSYEA, a następnie posiać na podłoże płynne uzupełnione odpowiednim cukrem. Hodowle inkubować w cieplarce w temperaturze 37 o C przez 24 godz. Po przeprowadzeniu badania stwierdzić, czy w analizowanej próbce a) obecne były bakterie z rodzaju Listeria b) określić gatune II Metody molekularne 1.1. Izolacja DNA metodą lizy termicznej Pobrać kilka kolonii bakteryjnych z podłożu TSYEA i zawiesić w 20 l roztworu 0,25% SDS i 0,05 NaOH. Całość inkubować w 95 o C przez 15 minut, a następnie dodać 180 l zimnej redestylowanej jałowej wody. Zawiesinę wirować 3 minuty przy 13,4 obrotów/min. Supernatant jest źródłem totalnego DNA. 1.2. Określenie przynależności gatunkowej badanych szczepów Listeria spp. metodą PCR W celu określenia przynależności gatunkowej przeprowadzić reakcję amplifikacji DNA metodą PCR stosując odpowiednią parę starterów. Startery, amplifikowane fragmenty genów i wielkość powstających produktów przedstawiono w Tab. 1. Matrycą w reakcji amplifikacji jest DNA otrzymany metodą lizy termicznej. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 l, jej skład przedstawiono w Tab.2. Warunki reakcji amplifikacji: wstępna denaturacja: 95 o C, 4 min, 30 cykli: denaturacja - temp. 94 o C, 30 s; przyłączanie starterów - temp. 60 o C, 30 s; synteza DNA - temp 72 o C, 1 min. Ostatni etap reakcji: 7-minutową synteza w 72 o C w celu wypełnienia jednoniciowych końców zamplifikowanych fragmentów.
Tab.1 Starter Gatunek Produkt amlifikacjii genu Produkt (pz) LisI-F potencjalny regulator LisI-R? transkrypcji 453 LisII-F LisII-R LisIII-F? N-acetylomuramidaza 493 LisIII-R? iap 250 Tab.2 Składnik woda redestylowana bufor do polimerazy Ilość składnika na 1 x próbę 18.3 l 2,5 l Stężenie końcowe składnika mieszanina dntp 1 l 400 M odpowiedni starter F 1 l 400 nm odpowiedni starter R 1 l 400 nm polimeraza Taq 0.2 l 1 U matryca DNA 1 l - 1. 3. Analiza produktów amplifikacji PCR Elektroforeza DNA w żelu agarozowym Rozdział elektroforetyczny prowadzić w 1 % żelu agarozowych w buforze TAE przez 50 min przy napięciu 120 V. Na żel agarozowy nanieść po 10 l odpowiedniej próby, do której wcześniej dodano barwnik do elektroforezy. Po zakończeniu rozdziału żel wybarwić w wodnym roztworze bromku etydyny przez 10 15 min i oglądać UV.