Fosfataza alkaliczna CIP Calf Intestine Phosphatase- pochodzenie: jelito cielęce BAP Bacterial Alcaline Phosphatase- pochodzenie: E. coli SAP Shrimp Alcaline Phosphatase- pochodzenie: krewetki Pandalus borealis Enzym standardowo oznaczany w surowicy krwi (ALP) pochodzący z kości; wątroby i jelit Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK) Terminalna deoksynukleotydo- Transferaza (TdT) Fosfataza alkaliczna (hydrolaza o aktywności fosfatazy- hydrolizuje wiązanie fosfomonoestrowe powodując defosforylację cząsteczki) CIP jest termolabilnym glikoproteidem złożonym z dwóch identycznych podjednostek o masie 96kDa (inaktywowana w 68 o C) BAP jest termostabilnym monomerem (47kDa) odpornym na działanie zw. organicznych (fenoli) usuwa grupę 5 fosforanową w obecności Mg 2+ i Zn 2+ pozostawiając w tym miejscu grupę OH Stosowana do defosforylacji wszystkich rodzajów cząstek kwasów nukleinowych w przypadku cząstek jednoniciowych zapobiega autoligacji (tworzeniu się struktury spinki do włosów) w przypadku dwuniciowych cząstek służy do zamiany reszty fosforanowej na znacznik fluorescencyjny 5 p-dna lub 5 p-rna alkaliczna fosfataza 5 OH-DNA lub 5 OH-RNA 1
Kinaza polinukleotydowa T4 (transferaza; katalizuje transfer reszty fosforanowej z ATP na 5 koniec DNA i RNA) pochodzenie: E.coli zakażone fagiem T4 tetramer złożony z identycznych podjednostek o masie 33kD aktywna w stosunku do (5 oraz 3 ) wszystkich rodzajów cząsteczek kwasów nukleinowych katalizuje transfer fosforanu z ATP na koniec 5 cząsteczki DNA (lub RNA), która nie posiada reszty fosforanowej ponieważ powstała w procesie chemicznej syntezy, lub uległa defosforylacji reakcja podstawienia "forward reaction" katalizuje przeniesiene reszty fosforanowej z 5 końca cząsteczki DNA (lub RNA) na ADP a następnie przeniesienie fosforanu na inną cząsteczkę DNA (lub RNA), która nie posiada na 5 końcu reszty fosforanowej reakkcja wymiany exchange reaction stosowana głównie do fosforylacji syntetycznych oligonukleotydów (starterów) do reakcji PCR Terminalna deoksynukleotydo Transferaza (TdT) (katalizuje przyłączanie nukleotydów do końca 3 OH DNA w cząsteczkach jednoniciowych lub dwuniciowych przy lepkich końcach; nie wymaga obecności starterów!!!) pochodzenie: trzustka cielęca dimer złożony z podjednostek o masie 26 i 80kD wykazuje bardzo małą aktywność w stosunku do rybonukleotydów niezbędne do aktywności tego enzymu są jony Co 2+ (CoCl 2 ) stosowana do tworzenia homopolimerowych końców na nici DNA (ogonków) w metodzie TUNEL polegającej na znakowaniu wolnych końców DNA z dwóch stron (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotindutp nick end labelling) służącej do identyfikacji apoptozy 2
Odpowiadają za stopień skręcenia superheliksu; biorą czynny udział w replikacji rozplatając podwójną helisę DNA (helikazy) DNA Topoizomeraza I o rozcina jedną nić DNA w szkielecie cukrowo-fosforanowym; (odpowiada za usuwanie z cząsteczki DNA skrętów relaksacja) DNA Topoizomeraza II (DNA gyraza) o rozcina obie nici DNA i łączy je ponownie wiązaniem fosodiestrowym (odpowiada za silniejsze skręcenie cząsteczki DNA) Topoizomerazy klasy A- łączą się z resztą fosforanową 5 DNA Topoizomerazy klasy B resztą 3 DNA 3
DNA Topoizomeraza I pozyskiwana z trzustki cielęcej pojedynczy polipeptyd o masie 105kDa może tworzyć cząsteczki koliste OC z superheliksu CCC wymaga obecności jonów Mg2+ DNA Topoizomeraza II izolowana z bakterii Micrococcus luteus białko złożone z dwóch identycznych podjednostek o masie 400kDa daje efekt odwrotny do Topoizomerazy I- może skręcać plazmidy OC do formy CCC lub odwracać skręty w formie CCC na ujemne lub negatywne praktyczne zastosowanie w terapii nowotworowej!!!! Topoizomeraza I w kompleksie z DNA (PDB: 1A36). Domeny zostały oznaczone kolorami: rdzeniowe poddomeny I, II i III odpowiednio różowym, fioletowym i czerwonym, linker - zielonym, domena C-końcowa - błękitnym. A) widok wzłuż helisy DNA. B) Układ odwrócony o 90o względem A. http://bioinfo.imdik.pan.pl Topoizomeraza II w kompleksie z DNA zmienia skręt helisy 4
METYLAZY Transferazy katalizujące metylację DNA (kowalencyjne przyłączenie grupy metylowej CH 3 ) dam Metylaza przenosi z S-adenozylometioniny (SAM) resztę metylową do Adeniny w pozycji N-6 w sekwencji 5 -GATC-3 dcm Metylaza dodaje grupę metylową (metyluje) do wewnętrznej cytozyny w sekwencji 5 -CC(A/T)GG-3 METYLAZY ENZYMY RESTRYKCYJNE WRAŻLIWE NA METYLACJĘ Enzymy nie rozpoznające zasady po przyłączeniu grupy metylowej CH 3 np. Eco RI (niewrażliwy na metylację dam i dcm ale wrażliwy na metylację CpG) Enzymy ignorujące grupę metylową w każdym rodzaju metaylacjki CH 3 np. MspI 5
Combined bisulfite restriction analysis- COBRA Dodatek dwusiarczanu sodu NaHSO 3 powoduje dwustopniowy proces przekształcający cytozynę w uracyl- TYLKO gdy zasada nie jest wcześniej połączona z grupa metylową Ciąg zasad replikowany jest w reakcji PCR z użyciem datp, dgtp, dctp i dttp, w ten sposób uracyl zamieniany jest na tyminę Nowa sekwencja (zamienione zasady na skutek braku metylacji), poddana jest trawieniu wybranym enzymem restrykcyjnym Stopień metylacji będzie oznaczany wprost (lub odwrotnie proporcjonalnie) do ilości uzyskanych fragmentów restrykcyjnych Combined bisulfite restriction analysis- COBRA 2532 2534 Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12 6