Agata Krakowska 1, Witold Reczyński 1, Joanna Kudyba 1 AGH w Krakowie Analiza ilościowa Mg, Zn i Cu metodą ASA w próbkach osocza krwi optymalizacja parametrów oznaczania Wprowadzenie Istotny element podczas prowadzonych badań analitycznych stanowi właściwy wybór metody analitycznej. Często wybór metody zdeterminowany jest problem jaki został postawiony przed analitykiem. Zazwyczaj oznacza on kompromis pomiędzy dobraniem metody o odpowiedniej dokładności, precyzji czasie pomiaru a także odpowiednio względnie niskich kosztach pomiaru. Ważnym aspektem jest również ilość materiału, którym dysponujemy do badań [1 3]. Ze względu na fakt, że do badań klinicznych analityk dysponuje próbkami o wielkości rzędu mikrolitrów czy mikrogramów, a stężenia analitów są na poziomie śladów, istotny element stanowi tutaj wybór metody pozwalającej przeprowadzić taką analizę [1 3]. Wśród metod stosowanych w tej dziedzinie chemii analitycznej wyróżniamy atomową spektrometrię absorpcyjną (ASA). Możliwość przeprowadzenia optymalizacji jak i odpowiedni dobór parametrów pracy w metodzie ASA pozwala na określenie, z wystarczającą dokładnością i precyzją, zawartości określonych pierwiastków w materiale biologicznym takim jak krew czy osocze ludzkie [4 12]. Materiał ten będący układem koloidalnym, posiada skomplikowaną matrycę (liczne elementy morfotyczne oraz białka) które utrudniają uzyskanie całkowicie homogenicznego roztworu a w konsekwencji sprawiają, iż jest to materiał trudny do analizy [12 15]. W badaniach krwi bardzo ważne jest dokładne określenie stężenia oznaczanego składnika. Dokładny wynik pomiaru pozwala na ocenę czy organizm funkcjonuje prawidłowo oraz często stanowi podstawę diagnozy. Atomowa spektrometria absorpcyjna jest metodą, która potrafi sprostać trudnością jakie niesie ze sobą badanie materiałów biologicznych. Dlatego w niniejszej pracy celem było opracowanie rzetelnej procedury analitycznej pozwalającej na analizę serii próbek osocza krwi ludzkiej o bardzo małej objętości (rzędu 100 150 μl), która uwzględniała niewielką objętość próbki, zakres liniowości zastosowanej metody oraz znaczną niejednorodność i zmienność materiału biologicznego. W pracy dobrano wielkość rozcieńczeń próbek, czas pomiaru, ilość powtórzeń oraz metodę pomiarową. W przypadku techniki ETAAS zoptymalizowano temperaturę atomizacji i rozkładu termicznego próbki. Ponadto po optymalizacji metody oznaczono zawartość Zn, Cu, Mg we właściwych próbkach osocza krwi ludzkiej. 1.1 Metodyka Metodyka badań i materiał analityczny Badania przeprowadzono za pomocą spektrofotometru absorpcji atomowej firmy Perkin Elmer model 3110 (prod. USA) rysunek 1. Rys. 1. Spektrofotometr absorpcji atomowej firmy Perkin Elmer model 3110. Źródło: materiały własne. 1 AGH Akademia Górniczo-Hutnicza im. S. Staszica, Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki, Kraków, Polska 9245
W prowadzonych badań wykorzystano dwie techniki pomiarowe: płomieniową (FAAS) do analizy ilościowej Mg i Zn oraz elektrotermiczną (ETAAS) do oznaczenia Cu. Parametry spektralne oznaczenia poszczególnych pierwiastków zestawiono w tabeli 1. Tabela 1. Parametry pracy spektrometru podczas analizy Mg, Zn techniką płomieniową raz Cu techniką elektrotermiczną metodą ASA. Parametry Mg (FAAS) Zn (FAAS) Cu (ETAAS) Typ płomienia (paliwo) Acetylen/Powietrze - Długość fali [nm] 285,2 213,9 324,8 Szerokość szczeliny [nm] 0,7 0,7 0,7 Źródło: materiały własne. 1.2 Materiał analityczny Do opracowywania właściwej i optymalnej metody pomiarowej wykorzystane zostały próbki krioprecypitatu pozyskane z Pracowni Serologii Transfuzjologicznej z Zakładu Diagnostyki Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. Natomiast właściwą analizę wykonano na materiale analitycznym, który stanowiły próbki osocza krwi ludzkiej badane w ramach współpracy z Katedrą Fizjologii, Wydziału Lekarskiego, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego. Procedura ilościowego oznaczania Mg i Zn (technika FAAS) dyskusja wyników 1.1 Preparatyka materiału Mg - optymalizacja procedury: próbki krioprecypitatu rozcieńczano 50-krotnie i dokładnie wymieszano. Natomiast materiał właściwy rozcieńczono 51-krotnie metodą addytywną poprzez dodanie do 1000 µl wody redestylowanej 20 µl próbki osocza. Zn próbki krioprecypitatu i materiału właściwego rozcieńczono 11-krotnie (mikrorozcieńczenie mała objętość analitu) w tym celu odmierzono 50 µl próbki osocza i dodano do 500 µl wody redestylowanej.. 1.2 Błąd czasu pomiaru Jednym z etapów opracowania procedury badawczej było określenie czasu właściwego pomiaru dla a) Mg oraz b) Zn. Zawartość Mg oznaczono w trzech różnych czasach: 1s, 2s oraz 3s. Na tej podstawie określono błąd, jaki występuje w zależności od długości pomiaru i wybrano optymalny czas, w którym zostały poddane analizie próbki właściwe. Optymalizację przeprowadzono na roztworze magnezu (stężenie około 0,4 µg ml) oraz próbkach krioprecypitatu. Uzyskane rezultaty prezentuje tabela 2. Tabela 2. Wpływ czasu pomiaru na otrzymane wyniki oznaczeń stężenia dla próbek roztworu magnezu 0,4 [µg ml] i próbek krioprecypitatu. Roztwór Mg [około 0,4 µg/ml] Próbki krioprecypitatu Numer pomiaru 1s 2s 3s 1s 2s 3s 1 0,370 0,373 0,367 0,276 0,270 0,272 2 0,370 0,371 0,369 0,279 0,281 0,281 3 0,374 0,373 0,372 0,282 0,284 0,286 4 0,377 0,375 0,368 0,282 0,286 0,287 5 0,371 0,371 0,370 0,286 0,289 0,288 6 0,371 0,375 0,365 0,287 0,292 0,288 7 0,370 0,373 0,366 0,288 0,293 0,290 9246
8 0,371 0,373 0,365 0,289 0,292 0,292 9 0,374 0,372 0,367 0,291 0,293 0,291 10 0,374 0,373 0,366 0,291 0,294 0,292 Średnia 0,372 0,372 0,367 0,285 0,287 0,286 RSD [%] 0,64 0,37 0,62 1,80 2,62 2,14 Uzyskane rezultaty analizy dla roztworu Mg różnią się znacząco od wyników otrzymanych dla próbek krioprecypitatu (skomplikowana matryca). Pomimo różnicy, RSD dla wszystkich czasów pomiaru utrzymuje się na akceptowalnym poziomie <3 %. Na tej podstawie można stwierdzić, iż optymalny czas pomiaru, któremu towarzyszy niewielkie zużycie materiału analitycznego w tym przypadku wynosi 3s. Stężenie Zn określono w dwóch różnych czasach wynoszących odpowiednio 1s oraz 2s. Pomiar błędu przeprowadzono na roztworze wzorcowym cynku 0,1 [µg ml] oraz próbkach krioprecypitatu. Wyniki prezentuje tabela 3. Tabela 3. Wpływ czasu pomiaru na otrzymane wyniki pomiaru stężenia dla próbek roztworu cynku 0,1 [µg ml] i próbek krioprecypitatu. Numer pomiaru Roztwór Zn [0,1 µg/ml] Próbki krioprecypitatu 1s 2s 1s 2s 1 0,108 0,113 0,128 0,131 2 0,113 0,111 0,138 0,129 3 0,109 0,114 0,136 0,129 4 0,105 0,112 0,131 0,130 5 0,107 0,109 0,127 0,132 6 0,110 0,114 0,132 0,130 7 0,108 0,112 0,136 0,128 8 0,111 0,115 0,131 0,129 9 0,109 0,116 0,131 0,127 10 0,107 0,118 0,137 0,128 Średnia 0,108 0,113 0,132 0,129 RSD [%] 2,23 2,23 2,78 1,31 Długość czasu analizy Zn wpływa w nieznacznym stopniu na analizę o czym świadczą niewielkie różnice błędów w uzyskanych wynikach. Przeprowadzona analiza umożliwiła dobrać optymalny czas pomiaru dla Zn 2s, dla którego zanotowano mniejszą wartość względnego odchylenia standardowego. 1.1 Wpływ błędu niehomogeniczności próbki W celu wyznaczenia wpływu niehomogeniczności próbki na wynik pomiaru magnezu przeprowadzono badania, na roztworze magnezu o stężeniu około 0,4 [µg/ml] oraz próbkach krioprecypitatu, na dwa sposoby. Pierwszy z nich polegał na dwukrotnym oznaczeniu pierwiastka w czasie 2 sekund natomiast drugi na 1-krotnym pomiarze magnezu w czasie 3 sekund. W obu przypadkach stosowano mikrorozcieńczenia metodą addytywną. Wyniki eksperymentu przedstawione zostały w tabeli 4. 9247
Tabela 4. Wyniki pomiarów dla metody 2x2s (dwukrotny pomiar w czasie 2 sekund) oraz 1x3s (jednokrotny pomiar w czasie 3 sekund) oznaczanie Mg. Roztwór Mg 0,4 [µg/ml] Pomiar 2x2s Błąd pomiaru Krioprecypitat Błąd pomiaru Wzorzec 0,4 [µg/ml] Pomiar 1x3s Numer pomiaru Krioprecypitat 1 0,344 0,6 0,292 2,7 0,313 0,288 2 0,336 1,1 0,318 0,3 0,315 0,316 3 0,328 1,3 0,306 3,2 0,314 0,286 4 0,332 0,1 0,309 3,8 0,318 0,284 5 0,306 3,3 0,298 1,5 0,322 0,311 6 0,317 0,9 0,311 0,9 0,316 0,298 7 0,323 0,8 0,300 1,2 0,313 0,292 8 0,324 0,5 0,326 1,4 0,304 0,312 9 0,313 1,0 0,324 0,9 0,289 0,290 10 0,304 0,1 0,323 0,8 0,314 0,290 Średnia 0,323-0,311-0,312 0,297 RSD [%] 4,00-3,82-2,95 4,01 W przypadku analizy magnezu mniejszy wpływ niehomogeniczności na pomiar (również mniejsze zużycie próbki i niższe błędy) obserwujemy dla metody w której wykonujemy pojedynczy pomiar w czasie 3s. Wpływ niehomogeniczności materiału na wynik oznaczeń ilościowych cynku sprawdzono na roztworze rzeczywistym cynku (około 0,1 [µg ml]) oraz próbkach krioprecypitatu. Pomiar został wykonany jednokrotnie w czasie 1 sekundy. Wyniki badań w tabeli 5. Tabela 5. Wyniki pomiarów dla metody 1x1s (jednokrotny pomiar w czasie 1 sekundy) oznaczanie Zn. Numer pomiaru Roztwór Zn 0,1[µg/ml] Pomiar 1x1s Krioprecypitat 1 0,1169 0,1284 2 0,1182 0,1265 3 0,1107 0,1316 4 0,1129 0,1348 5 0,1087 0,1231 6 0,1055 0,1255 7 0,1032 0,126 8 0,1156 0,1251 9 0,1081 0,1247 10 0,1045 0,1249 Średnia 0,110 0,127 RSD [%] 3,93 2,82 Analizując uzyskane wyniki można stwierdzić, iż wykonanie jednokrotnego pomiaru w czasie 1 sekundy w przypadku oznaczania cynku jest wystarczające. Niemniej pomiar w tak krótkim czasie umożliwia znaczną redukcję zużycia badanego materiału. 9248
1.1 Wyznaczenie granicy oznaczalności dla Mg i Zn W celu wyznaczenia granicy oznaczalności dla Mg sporządzono roztwory wzorcowe o dwóch stężeniach - 0,1 oraz 0,2 [µg ml]. Następnie wykonano pomiar w kolejności: próba ślepa - wzorzec 0,1 [µg ml] - próba ślepa- wzorzec 0,2 [µg ml]. Pomiar wykonano 10-krotnie. W taki sam sposób dokonano pomiaru dla cynku, wykorzystując roztwory wzorcowe o stężeniach 0,25 [µg ml] oraz 0,5 [µg ml]. Wyniki prezentuje tabela 6. Numer pomiaru 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tabela 6. Wyniki obliczeń granicy oznaczalności dla magnezu i cynku. - Mg Blank Wzorzec 0,1 [µg ml] Wzorzec 0,2 [µg ml] Blank 0,000 0,003 - Zn Wzorzec 0,25 [µg ml] 0,062 0,086 0,001 0,000 0,000 0,001 Wzorzec 0,5 [µg ml] 0,115 0,163 0,058 0,085 0,001 0,003 0,000 0,002 0,111 0,161 0,057 0,080 0,000 0,001 0,001 0,002 0,109 0,154 0,056 0,078 0,000 0,001 0,000 0,000 0,108 0,150 0,055 0,078 0,000 0,000 0,000 0,002 0,106 0,150 0,055 0,077 0,000 0,000 0,000 0,000 0,105 0,147 0,054 0,075 0,000 0,001 0,000 0,003 0,105 0,147 0,054 0,074 0,000 0,003 0,001 0,000 0,105 0,146 0,054 0,075 0,001 0,001 10 0,000 0,001 0,105 0,146 9249
0,055 0,074 0,000 0,002 0,104 0,147 W oparciu o uzyskane rezultaty analizy (tabela 6) i wzór1obliczono granicę wykrywalności dla Mg i Zn: [1] DL = [µg/ml] Gdzie: DL- granica oznaczalności [µg/ml] Cs- stężenie wzorca [µg/ml] SD- odchylenie standardowe [µg/ml] S - średnia Uzyskana granica oznaczalności dla Mg jest niższa i wynosi 0,017 [µg ml] natomiast dla Zn 0,046 [µg/ml]. Oznaczenie stężenia Mg i Zn we właściwym materiale badawczym (osoczu krwi ludzkiej) Zanalizowano próbki właściwe osocza krwi ludzkiej na zwartość Mg i Zn według opracowanych wyżej procedur. Kalibrację aparatury pomiarowej na wzorcach magnezu jak i sam pomiar wykonano jednokrotnie w czasie 3s. W przypadku cynku pomiar wykonywany był jednokrotnie w czasie 1s. Wyniki analizy prezentuje wykres 1 i 2. 30 25 20 15 10 5 0 362 364 366 382 386 403 427 428 430 433 Rys. 2. Wykres 1. Wyniki analizy magnezu dla osocza krwi ludzkiej. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 362 363 386 389 425 426 430 435 Rys. 3. Wykres 2. Wyniki analizy magnezu dla osocza krwi ludzkiej 9250
Procedura ilościowego oznaczania Cu (technika ETAAS) dyskusja wyników Zawartość miedzi w materiale badanym została zmierzona metodą ASA a dokładnie techniką elektrotermiczną (ETAAS). Procedura badawcza została zaproponowana w oparciu o pomiar miedzi wykonany na próbkach krioprecypitatu oraz roztworze wzorcowym miedzi. Próbki krioprecypitatu zostały rozcieńczane 6-krotnie, natomiast próbki materiału właściwego rozcieńczono 26-krotnie techniką addytywną. 3.1 Optymalizacja temperatury atomizacji W celu określenia optymalnej temperaturę atomizacji wybrano próbkę materiału (krioprecypitatu) o stosunkowo dużej objętości a następnie dokonano pomiaru wartości absorbancji zmieniając temperaturę w zakresie od 1500do 2400 o C. Rezultaty pomiaru zaprezentowano graficznie na wykresie 3. A [-] 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 Temperatura [ o C] Rys. 4. Wykres optymalizacji temperatury atomizacji dla pomiaru miedzi. 3.2 Optymalizacja temperatury rozkładu termicznego W przypadku wyznaczenia optymalnej temperatury rozkładu termicznego wykonano pomiar wartości absorbancji zmieniając temperaturę w zakresie od 800 do 1600 o C. Uzyskane wyniki przedstawia wykres 4. A [-] 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Temperatura [ o C]. Rys. 5. Wykres optymalizacji temperatur rozkładu termicznego dla miedzi. W oparciu o uzyskane wyniki wybrano optymalną temperaturę atomizacji, która wynosiła 2200 o C oraz temperaturę rozkładu termicznego 1100 o C. 3.3 Wyznaczenie granicy oznaczalności dla Cu Granice oznaczalności dla Cu wyznaczono analogicznie jak dla poprzednich pierwiastków. W tym celu przygotowano roztwory wzorcowe o stężeniach 0,05 [µg ml] oraz 0,1 [µg ml]. Wyniki zebrano w tabeli 7. 9251
Tabela 7. Wyniki obliczeń granicy oznaczalności dla miedzi. - Cu Numer pomiaru Blank Wzorzec 0,05[µg/ml] Wzorzec 0,1[µg/ml] 0,0008 0,0514 1 0,0003 0,1040 0,0002 0,0599 2 0,0000 0,1028 0,0002 0,0613 3 0,0000 0,1020 0,0002 0,0540 4 0,0004 0,1030 0,0005 0,0523 5 0,0007 0,1042 0,0005 0,0549 6 0,0005 0,1049 0,0060 0,0531 7 0,0007 0,1054 0,0006 0,0552 8 0,0005 0,1058 0,0009 0,0560 9 0,0007 0,1054 0,0007 0,0558 10 0,0008 0,1055 9252
Tak jak dla pozostałych pierwiastków wyznaczono granicę oznaczalności, która wynosi 0,007 [µg ml]. 3.4 Oznaczenie stężenia Cu we właściwym materiale badawczym (osoczu krwi ludzkiej) Przeprowadzono analizę próbek osocza krwi ludzkiej w celu określenia zawartości Cu według ustalonej zoptymalizowanej procedury badawczej. Każda próbka została oznaczona dwukrotnie. Wyniki otrzymanego doświadczenia zostały zaprezentowane graficznie rys. 5. Stężenie[µg/ml] 1,5 1 0,5 93 112 130 137 138 139 0 Rys. 6. Wyniki analizy miedzi dla osocza krwi ludzkiej. Podsumowanie W powyższej pracy badawczej udało się z sukcesem przeprowadzić optymalizację kluczowych parametrów procedury analitycznej, która jest niezbędna do uzyskania rzetelnego wyniku w przypadku analiz śladowych jakie mają miejsce w badaniach klinicznych. Przeprowadzone oznaczenia Mg, Zn, Cu wg. sporządzonych procedur analitycznych pozwoliły na bezproblemowe oznaczenia pierwiastków w osoczu krwi ludzkiej z pominięciem wcześniejszej mineralizacji (niewystarczająca ilość materiały wyjściowego)metodą ASA. Ponadto uzyskane rezultaty badań na materiale właściwym były satysfakcjonujące, charakteryzujące się wysoką precyzją i dokładnością co sprawia, że są sprawdzonym źródłem informacji o stanie zdrowia człowieka i mogą służyć w dalszej diagnostyce medycznej. W oparciu o przeprowadzoną optymalizację parametrów pomiarowych z powodzeniem można zaproponować następujące parametry pomiarowe procedury analitycznej dla metody ASA w celu Mg, Zn, Cu, (tabela 8), które pozwalają na przeprowadzenie precyzyjnego pomiaru na materiale biologicznym o złożonej matrycy. Tabela 8. Parametry opracowanych procedur dla analizy Mg, Zn i Cu metodą ASA. Parametr Technika FAAS Analizowany element Technika ETAAS Mg Zn Cu Długość fali 285,2 [nm] 213,9 [nm] 324,8 [nm] Zastosowane wzorce 0,1,02 0,3 0,4 0,5 [µl] 0,25,0,5 0,75 [µl] 0,01 0,02 0,05 [µl] Rozcieńczenie próbki 51-krotne 11-krotne 26-krotne Czas i krotność pomiaru 1x3s 1x1s 2x2s Objętość próbki - rozpuszczalnika Temperatura i czas atomizacji próbki 20-1000 [µl] 50-500 [µl] 20-500 [µl] - - 2200 o C, 40s Temperatura i czas rozkładu termicznego próbki - - 1100 o C, 7s Granica oznaczalności 0,017 [µg ml] 0,046 [µg ml] 0,007 [µg ml] 9253
Streszczenie Istotny element podczas prowadzonych badań analitycznych stanowi właściwy wybór metody analitycznej. Często wybór metody zdeterminowany jest problem jaki został postawiony przed analitykiem. Zazwyczaj oznacza on kompromis pomiędzy dobraniem metody o odpowiedniej dokładności, precyzji czasie pomiaru a także odpowiednio względnie niskich kosztach pomiaru. Ważnym aspektem jest również ilość materiału, którym dysponujemy do badań oraz skład matrycy. W pracy poddano analizie materiał biologiczny, który stanowiło osocze krwi ludzkiej. Ze względu na złożoną matrycę krwi i preparatów krwiopochodnych, materiał ten stanowi bogate, ale bardzo trudne do analizy źródło informacji o organizmie człowieka. W pracy opracowano rzetelną procedurę analityczną umożliwiającej analizę serii próbek osocza krwi, która uwzględniała niewielką objętość próbki (100 µl), zakres liniowości zastosowanej metody oraz znaczną niejednorodność i zmienność materiału biologicznego. Na podstawie uzyskanych wyników zaproponowano sposób analizy Mg i Zn techniką FAAS oraz Cu techniką ETAAS. W przypadku techniki ETAAS zoptymalizowano temperaturę atomizacji i rozkładu termicznego próbki. Ponadto po optymalizacji metody oznaczono zawartość Zn, Cu, Mg we właściwych próbkach osocza krwi ludzkiej co potwierdziło użyteczność opracowanej procedury analitycznej. Słowa kluczowe: Optymalizacja, mikropróbki, materiał biologiczny, analiza, AAS Literatura [1] Ziółko E. Podstawy Fizjologii Człowieka, Oficyna Wydawnicza PWN w Nysie, Nysa 2006. [2] Traczyk S.: Fizjologia człowieka z elementami fizjologii stosowanej i klinicznej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2004. [3] Żak I.: Chemia medyczna, Śląska Akademia Medyczna, Katowice 2001. [4] Polyakova E. V., Shuvaeva O. V.: Determination of Calcium, Magnesium, Iron, Copper, Zinc, and Phosphorus in Blood Serum by Atomic Emission Spectrometry, Journal of Analytical Chemistry, 60(10), 2005, 937 941. [5] Długaszek M.: Zastosowanie spektrometrii absorpcji atomowej w analizie pierwiastkowej próbek klinicznych (krwi), Prace Instytutu Elektroniki Wojskowej Akademii Technicznej, Warszawa 2014. [6] D.A. Skoog, D.M. West, J.F. Holler, S.R.Crouch: Fundamentals of Analytical Chemistry, (VII ed.), Saunders College Publishing, Philadelphia 1996. [7] H.W. Willard, L.L. Merritt, J.A. Dean, F.A. Settle: Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Belmont 1981. [8] M. Jarosz, E. Malinowska: Pracownia chemiczna, Analiza instrumentalna, WSiP, Warszawa 1999. [9] Szczepaniak W.: Metody instrumentalne w analizie chemicznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1997. [10] Baranowska I.: Wybrane działy analizy instrumentalnej, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice 2006. [11] Kubiak W., Gołaś J.: Instrumentalne metody analizy chemicznej, Wydawnictwo Naukowe AKAPIT, Kraków 2005. [12] Broekaert J. A. C.: Analytical Atomic Spectrometry with Flames and Plasmas, Wiley-Vch Werlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 2005. 9254
[13] Niechwiadowicz-Czapka T., Klimczyk A.: Leczenie krwią. Podręcznik dla studiów medycznych, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2011. [14] Sherameti I., Warma A., Soil Heavy Metals, Springer Verlag, Berlin Heidelberg 2010. [15] Mahalingam T. R., Vijayalakshmi S., Krishna Prabhu R.: Studies on Some Trace and Minor Elements in Blood, Biological Trace Element Research, 57, 1997. 9255