Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ================================================================= Ćwiczenie 6 Oznaczanie aktywności bakteryjnej β-galaktozydazy Prowadzący: mgr Aleksandra Konieczna i mgr Elwira Smolińska β-galaktozydaza jest enzymem biorącym udział w katabolizmie laktozy. Białko to jest kodowane przez gen lacz znajdujący się w operonie laktozowym. Aktywność tego enzymu można badać, stosując sztuczny substrat, O-nitrofenylo- β-galaktozyd (ONPG). β-galaktozydaza katalizuje rozkład ONPG, a jednym z produktów reakcji jest nitrofenol mający żółte zabarwienie. Intensywność tego zabarwienia mierzy się spekrtrofotometrycznie. Gen lacz jest jednym z najczęściej stosowanych genów reporterowych służących do określania wydajności ekspresji innych genów lub badania aktywności różnych promotorów. W tym celu konstruuje się fuzje genowe lub operonowe (transkrypcyjne), w których gen lacz jest przyłączony do innego genu przy zachowaniu zgodności ramki odczytu lub też znajduje się pod kontrolą badanego promotora. Aktywność β-galaktozydazy w komórce jest wprost proporcjonalna do ilości tego enzymu, a ilość ta jest wprost proporcjonalna do ilości i aktywności translacyjnej odpowiednich transkryptów RNA. Mierząc aktywność β-galaktozydazy w szczepach bakteryjnych zawierających odpowiednie fuzje można wnioskować o wydajności ekspresji badanego genu lub aktywności badanego promotora. Doświadczenia te należy oczywiście wykonywać w szczepach zawierających mutację w genie lacz, tak by jedynie aktywne cząsteczki β-galaktozydazy mogły powstać tylko w oparciu o odpowiednią fuzję genową lub operonową. Fuzje te mogą być ulokowane na chromosomie bakteryjnym (fuzje jednokopijne) lub na plazmidzie (fuzje wielokopijne). Aktywność β-galaktozydazy mierzy się po lizie komórek i oznacza w tzw. jednostkach Millera. Materiały: - szczepy E. coli: 5lacZ - /prs415 5lacZ - /prsaxe 5lacZ - /prsaxemut-10 - pożywka LB - roztwór antybiotyku: ampicyliny - chloroform - bufor Z (bufor fosforanowy z KCl, MgSO 4, SDS i β-merkaptoetanolem) - substrat reakcji - roztwór ONPG (roztwór 0.4% O-nitrofenylo- β-galaktozydu w buforze fosforanowym) - roztwór stopujący - 1M Na 2 CO 3 Wykonanie: 1. Odmłodzić hodowle nocne w 10 ml LB z antybiotykiem (1:50) i następnie inkubować z wytrząsaniem przez 1 godzinę (przygotowane przez prowadzącego), zmierzyć OD 600 2. Do trzech probówek zawierających 100 μl chloroformu i 1,5 ml buforu Z dodać po 100 μl z pobranej próbki hodowli 3. Zawartość każdej z tych probówek wymieszać przez worteksowanie przez 15 sekund 4. Inkubować na stole przez 10 minut 5. Do każdej próbki dodać 400 μl roztworu ONPG i włączyć stoper 6. Inkubować na stole do momentu pojawienia się żółtej barwy roztworu 1
7. Dodać 1 ml 1M Na 2 CO 3 i wyłączyć stoper. Zanotować dokładny czas, jaki upłynął od momentu dodania ONPG 8. Po skończeniu eksperymentu zmierzyć wartość OD 420 wszystkich prób 9. Obliczyć aktywność β-galaktozydazy wg wzoru: aktywność β-gal = V T x (OD 420 /OD 600 x Δt x Vs) x 1000 gdzie: V T = objętość próbki (w ml) Δt = czas (w min.) od momentu dodania ONPG do momentu dodania Na 2 CO 3 V S = objętość hodowli bakteryjnej w próbce = 0,1ml Mapa plazmidu prs415 Plazmid posiada origin replikacji pmb1 i oporność na ampicylinę (amp). 2
Część teoretyczna ćwiczenia Zastosowanie elementów operonu laktozowego Escherichia coli w klonowaniu genów 1. Kontrola ekspresji genów na przykładzie operonu lac Escherichia coli Preferencyjnym źrodłem węgla dla bakterii jest glukoza i w jej obecności zahamowana jest ekspresja wielu genów kodujących białka biorące udział w katabolizmie innych cukrów np. laktozy, arabinozy lub maltozy. Operon to zgromadzenie powiązanych ze sobą funkcyjnie genów bakteryjnych (np. genów jednego szlaku metabolicznego) w jednym miejscu genomu. Ekspresja tych genów jest regulowana (indukowana lub hamowana) przez wspólne elementy kontroli (sekwencje operatorowe, promotory, regulatory, efektory itp.) Najlepiej poznanym przykładem operonu indukowanego jest operon kodujący enzymy niezbędne do hydrolizy laktozy u Escherichia coli. W skład operonu laktozowego E. coli wchodzą trzy geny strukturalne: lacz (β- galaktozydaza), lacy (permeaza β-galaktozydazy) i laca (transacetylaza β-galaktozydowa), których ekspresja jest możliwa ze wspólnego promotora umiejscowionego przed genem lacz. Ekspresja operonu laktozowego regulowana jest na poziomie transkrypcji poprzez białko represorowe (produkt genu laci), które rozpoznaje sekwencję operatorową. Gen kodujący białko represorowe eksprymowany jest konstytutywnie. Ekspresja genów strukturalnych wchodzących w skład operonu laktozowego jest indukowana poprzez pojawienie się substratu: laktozy. Naturalnym induktorem operonu lac u E.coli jest laktoza, a dokładniej allolaktoza, która powstaje w wyniku aktywności β-galaktozydazy lub spontanicznej izomeryzacji laktozy. Zatem β-galaktozydaza indukuje i utrzymuje ekspresję operonu lac (w tym własnego genu lacz), jest to tzw. sprzężenie zwrotne dodatnie. Laktoza i allolaktoza ulegają enzymatycznemu rozłożeniu (katalizowanemu przez β- galaktozydazę), na dwa cukry składowe: glukozę i galaktozę. Ryc. Hydroliza laktozy przez β-galaktozydazę 3
Mutacje konstytutywne, elementy działające in cis i in trans. Francois Jacob opracował system tzw. częściowych diploidów w celu zidentyfikowania elementów genetycznych mających wpływ/kontrolujących ekspresję genów strukturalnych w operonie laktozowym. W tym celu, do komórek E. coli wprowadził na plazmidzie F drugą kopię operonu laktozowego (laci ze swoim promotorem oraz geny laczya z promotorem i sekwencjami operatorowymi). Jacob odkrył, że istnieją dwie klasy mutantów konstytutywnych (tzn. takich których występowanie pozwala na konstytutywna ekspresję genów strukturalnych operonu laktozowego). Pierwsza klasa to mutacje dotyczące sekwencji operatorowej (mutacja o c ). Te mutanty są cisdominujące ponieważ kontrolują tylko operon usytuowany na tej samej molekule DNA (nie mają wpływu na operon umieszczony na plazmidzie) i ponieważ wprowadzenie dzikiej kopii operatora nie zmienia fenotypu bakterii: w tym przypadku zawsze ma miejsce ekspresja aktywnej formy β- galaktozydazy. Druga klasa mutacji konstytutywnych to mutacje w genie kodującym białko represorowe (i - ). W tym przypadku, monomery represora nie mogą utworzyć aktywnego tetrameru i nie mogą połączyć się z dzikim operatorem. Takie mutacje są trans-recesywne ponieważ monomer represora nie połączy się z operatorem ani na plazmidzie ani na chromosomie a mutacja ta może być zniesiona poprzez wprowadzenie do komórki dzikiej kopii genu laci (Tabela. 1). Tabela 1. Wpływ mutacji w operonie lac na fenotyp E. coli2 Trzy poziomy ekspresji genów operonu laktozowego: Gdy w środowisku obecna jest glukoza a brak jest laktozy, białko represorowe łączy się z operatorem i blokuje w ten sposób polimerazę RNA, zasłaniając część sekwencji promotorowej. Nie dochodzi wtedy do transkrypcji genów strukturalnych. W przypadku braku glukozy i obecności laktozy, jej niewielka część dyfunduje do wnętrza komórki i łączy się białkiem represorowym zmieniając jego konformację. Białko represorowe nie może wtedy przyłączyć się do sekwencji operatorowej i możliwa jest ekspresja genów strukturalnych. Permeaza odpowiedzialna jest za transport laktozy do wnętrza komórki, β-galaktozydaza (EC 3.2.1.32) odpowiedzialna jest za hydrolizę wiązań O-glikozydowych w β-d-galaktozydach. Produkt genu laca odpowiedzialny jest za acetylację galaktozydów posiadających grupetiolową lecz nie odgrywa żadnej roli w katabolizmie laktozy. Co się dzieje gdy komórka ma do wyboru dwa źródła węgla? Dla bakterii korzystniejsze jest rozłożenie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w metabolizmie (glikoliza), a laktoza musi zostać najpierw rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych. Bakteria zdolna do zużycia glukozy pomimo obecności laktozy w pożywce będzie rosła szybciej niż inne bakterie tym samym zdobywając pewną nad nimi przewagę. Ekspresja operonu laktozowego jest hamowana poprzez obecność glukozy: jest to tak zwana represja kataboliczna. Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że konieczna jest aktywacja 4
transkrypcji w promotorach operonów, których sekwencje promotorowe odbiegają od sekwencji kanonicznej a tak się dzieje w wielu operonach uczestniczących w metabolizmie cukrów. Polimeraza RNA łączy się z promotorem w operonie laktozowym dużo lepiej w obecności specyficznego białka CAP (catabolite gene activator protein lub CRP cyclic AMP receptor protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA położonym w pobliżu sekwencji promotorowej tzw. CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąże się z CBS jeśli do niego przyłączą się cząsteczki cyklicznego AMP (efekt allosteryczny). Transport glukozy (w postaci glukozofosforanu) do komórki bakteryjnej wiąże się ze spadkiem stężenia aktywnej (fosforylowanej) formy cyklazy adenylowej odpowiedzialnej za syntezę camp z ATP. Jeżeli w pożywce znajduje się glukoza, poziom camp obniża się, a konformacja białka CAP uniemożliwia wiązanie sekwencji CBS, polimeraza RNA słabo wiąże się z promotorem i synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona. W efekcie, jeśli w podłożu obecna jest glukoza i laktoza, metabolizowana będzie w pierwszym rzędzie glukoza aż do wyczerpania się tego źródła węgla. Następnie zostaje uruchomiony operon laktozowy, dzięki kompleksowi camp-cap (oraz laktozie, która zmienia konformację represora LacI). Kompleksy camp-crp regulują (aktywują lub reprymują) w ten sposób wiele szlaków metabolicznych oraz innych operonów np. odpowiedzialnych za syntezę rzęsek, produkcję antybiotyków, wirulencję itp. (regulony). 2. Operon laktozowy w biologii molekularnej Gen lacz wykorzystywany jest jako gen reporterowy, ponieważ aktywność β-galaktozydazy można łatwo wykryć używając substratów chemicznych, hydrolizowanych w barwne produkty reakcji. Struktura enzymu pozwoliła do wykorzystania go w wielu technikach biologii molekularnej, np. w klonowaniu genów, badaniu interakcji białko/białko, badaniu ekspresji, badaniach zmienności fazowej bakterii itp. Substraty: Istnieją chromogenne analogi strukturalne laktozy hydrolizowane przez β-galaktozydazę. Najczęściej stosowane są ONPG (o-nitrofenyl-β-d-galaktopiranozyd) w hodowlach płynnych oraz X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopiranozyd) w hodowlach stałych. Żaden z tych związków nie indukuje jednak operonu laktozowego, do indukcji dodaje się IPTG (izopropylo-β-dtiogalaktopiranozyd). Jest to mała molekuła, która dyfunduje do wnętrza komórki i nie jest metabolizowana przez komórki bakteryjne. Ryc. Wzory strukturalne substratów i induktora operonu lac α-komplemetacja Aktywna β-galaktozydaza z E. coli działa jako oligomer zbudowany z 4 identycznych łańcuchów polipeptydowych, każdy o długości 1023 aminokwasów. Każdy polipeptyd może być podzielony na 2 nieaktywne fragmenty: α (N-koniec) i ω (C-koniec polipeptydu). Wykazano, że ekspresja końców karboksylowych (ω) pozwala na uzyskanie nieaktywnych dimerow. Aktywny enzym, w formie tetrameru, może być otrzymany, jeżeli w komórce jednocześnie z fragmentem ω będzie eksprymowany peptyd α kodowany przez gen lacz. 5
Ryc. Mechanizm α-komplemetacji: a) dzika β-galaktozydaza z E. coli b) dimer oraz tetramer uformowany przez peptydy α oraz ω. Selekcja na białe-niebieskie (ang. blue-white screening) Aby przeprowadzić selekcję na białe-niebieskie transformowanych kolonii E. coli należy posiadać specjalne komórki E. coli. Nie mogą one wyrażać genu lacz, zazwyczaj są to komórki z mutacją Δ(lac)X74 (delecja całego operonu laktozowego wraz z otaczającym go DNA) Muszą wyrażać fragment ω: zazwyczaj są to komórki z mutacją laczδm15 (gen lacz z delecją nukleotydów kodujących aminokwasy 11 do 41) Ponadto wektor musi posiadać gen lacz, kodujący fragment α, zazwyczaj są to 92 kodony z 5 końca genu lacz. W wektorach puc18/19 sześć kodonów zastąpiono w zgodnej ramce odczytu unikatowymi miejscami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne (MCS: multicloning site). Ryc. α-komplemetacja pomiędzy fragmentami β-galaktozydazy kodowanymi przez komórki E. coli laczδm15 oraz gen lacz, obecny na wektorze 6
Wklonowanie obcego fragmentu DNA w MCS przerywa gen lacz i nie dochodzi do α- komplementacji w komórkach E. coli (laczδm15). Na szalkach Petriego z X-Gal niebieskie kolonie E. coli zawierają pusty wektor (dochodzi do α-komplementacji), a kolonie białe wektor z klonowanym obcym fragmentem DNA. Ryc. Mapa plazmidu pbluescript IIKS+/-: sekwencja CAP, promotor Plac, operator rozpoznawany przez represor LacI i koniec 5` genu lacz kodujący α fragment β- galaktozydazy z wklonowaną sekwencją MCS. Inne elementy operonu laktozowego używane w biologii molekularnej: Promotor P lac i jego pochodne np. promotor P lacuv5, w którym trzy mutacje punktowe zmniejszają jego czułość w stosunku do stężenia camp. Promotor taki trudniej unika derepresji w przypadku wyczerpania się glukozy w pożywce (co może mieć znaczenie w przypadku gęstej hodowli): o takim promotorze mówi się, że mniej przecieka. Represor LacI lub jego pochodna kodowana przez gen laci q. Mutacja dotyczy promotora genu laci (w pozycji -35 z GCGCAA na GTGCAA: promotor jest lepiej rozpoznawany przez RNA polimerazę bakteryjną). Mutacja laci q1, dzięki delecji 15 pz w regionie promotora, pozwala na otrzymanie optymalnego promotora powyżej genu laci. Dzięki mutacjom możliwa jest wydajniejsza ekspresja represora operonu laktozowego. Zastosowanie represora pozwala natomiast na ściślejsza kontrola ekspresji genów sklonowanych na plazmidzie, który posiada sekwencję operatorową rozpoznawaną przez LacI Systemy dwuhybrydowe: Jest to jedna z najpowszechniej stosowanych metod identyfikacji oddziaływań między białkami. Są bardzo rożne systemy dwuhybrydowe: te przedstawione poniżej wykorzystują elementy operonu laktozowego: 7
Ryc. Bakteryjny system dwuhybrydowy: badane białka są w fuzji z fragmentami α i ω β- galaktozydazy: jeżeli białka A i B oddziałują ze sobą, α- komplementacja ma miejsce i β- galaktozydaza jest aktywna Ryc. Bakteryjny system dwuhybrydowy: badane białka są w fuzji z fragmentami T25 i T18 cyklazy adenylowej odpowiedzialnej za syntezę camp: jeżeli białka X i Y oddziałują ze sobą, aktywny kompleks camp-crp aktywuje transkrypcję β-galaktozydazy GENY MARKEROWE I REPORTEROWE Celem inżynierii genetycznej jest zmiana materiału genetycznego określonych komórek prowadząca do nabycia przez nie nowych wcześniej nieposiadanych cech. Podczas eksperymentu transformacji/transfekcji bierze udział olbrzymia liczba komórek, niestety tylko ułamek procenta z nich ulegnie modyfikacji na skutek pobrania DNA. Aby szybko i łatwo określić które komórki pobrały DNA, bez konieczności sprawdzania każdej z nich stosuje się tzw. geny markerowe. Są one dołączane do wybranych fragmentów DNA a następnie tak zbudowany konstrukt umieszczany jest w komórce docelowej. Produkty tych genów mogą być w sposób szybki i łatwy wykryte, co pozwala na bezproblemową identyfikację transformantów. Geny reporterowe mogą spełniać podobną funkcję, lecz mają one jeszcze jedno niezwykle ważne zadanie: pozwalają na pomiar aktywności takich elementów genetycznych jak np. sekwencje promotorowe. Definicja genu markerowego i reporterowego Często zdarza się, iż pojęcia gen markerowy i gen reporterowy są używane naprzemiennie. Jednak istnieje między nimi różnica wynikająca z ich zastosowania. Geny określamy markerowymi, gdy mają posłużyć do rozróżnienia między komórkami transformowanymi, a nie transformowanymi ( np. gen kodujący β-galaktozydazę blue-white screening ). Natomiast geny określamy reporterowymi, gdy ich aktywność służy badaniu innego genu np. badanie aktywności promotora przez poziom ekspresji genu kodującego beta galaktozydazę, ale mogą być też użyte do rozróżniania kolonii. 8
Geny markerowe 1 Markery selekcyjne Marker selekcyjny będzie chronił komórkę przed działaniem szkodliwego czynnika, który normalnie zabiłby lub zablokował jej wzrost. Stąd też po zastosowaniu substancji selekcyjnej na hodowlę, wzrost podejmą tylko te komórki, które posiadają gen markerowy, a tym samym pożądany fragment DNA. Najczęściej stosowanymi związkami selekcyjnymi są antybiotyki (zwłaszcza w przypadku bakterii i roślin). Tego typu zabiegi są również stosowane do oceny czy organizmy potomne nie utraciły interesującego badacza genu. Aby się o tym przekonać wystarczy spryskać je roztworem antybiotyku. Przeżyją tylko te z zachowanym genem. 2 Markery różnicujące Marker różnicujący będzie powodował zmianę w wyglądzie komórek transformowanych np. zmiana zabarwienia kolonii, emisja światła. Przykłady : β-galaktozydaza Enzym ten jest hydrolazą, katalizuje hydrolizę β-galaktozydów w monosacharydy. Pochodzi z bakterii Escherichia coli, kodowany przez gen lacz. Jest najczęściej stosowanym markerem różnicującym w genetyce molekularnej. W wektorze używanym do transformacji znajduje się N- końcowy fragment genu lacz. Natomiast w organizmie biorcy fragment C-końcowy. W wyniku współdziałania obu elementów powstaje w pełni aktywny enzym. W eksperymencie transformacji interesujący badacza fragment DNA jest umieszczany w obrębie sekwencji N-końcowej genu lacz, co automatycznie powoduje jego uszkodzenie. Aby wykryć w komórkach obecność enzymu umieszcza się je na pożywce zawierającej X-gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-galaktozyd), w przypadku obecności beta galaktozydazy będzie można zaobserwować pojawienie się niebieskiego produktu ( 4-chloro-3-bromo-indygo) powstałego w wyniku cięcia X-gal, oznaczać to będzie, iż biorca przyjął plazmid, ale pusty (bez wstawki). Jeśli natomiast niebieski produkt nie powstanie to można wnioskować, iż eksperyment zakończył się sukcesem ( bakteria pobrała plazmid ze wstawką). Omawiany test nosi nazwę α-komplementacji. Rysunek. Test α-komplementacji: Białko zielonej fluorescencji (GFP) Białko po raz pierwszy wyizolowane z meduzy Aequorea victoria, kodowane przez gen gfp. Własności bioluminescencyjne związane są z występowaniem we wnętrzu białka chromoforu zbudowanego z sześciu reszt aminokwasowych : N - Phe64 - Ser - Tyr - Gly - Val - Gln69 - C z czego kluczową rolę odgrywają ulegające autokatalitycznej cyklizacji reszty Ser65-Tyr66-Gly67. In vivo fluorescencja zachodzi na drodze dostarczenia energii przez fotoproteinę aktywowaną jonami wapnia, ale w warunkach laboratoryjnych w celu indukcji świecenia stosuje się światło UV. Obecnie w handlu dostępne są gotowe plazmidy z genem gfp jako markerem wystarczy, więc w takim wektorze umieścić żądaną wstawkę i dokonać transformacji bakterii. W celu identyfikacji 9
transformantów stosuje się światło UV, kolonie zmodyfikowane będą świecić na jasnozielony kolor. Na drodze mutagenezy punktowej uzyskano wiele odmian barwnych białka. Omawiany gen może być także markerem w organizmach roślin i zwierząt. Rysunek. Różnorodność barw mutantów GFP Geny reporterowe W przeciwieństwie do markerów selekcyjnych, geny reporterowe nie powodują odporności komórek transformowanych przeciwko szkodliwym związkom chemicznym niszczącym komórki nieodporne. Mogą jednak działać na podobnej zasadzie co markery różnicujące, częstymi są także przypadki w których pewne geny ( np. gfp, lacz) można by zaliczyć do obu grup. Gen reporterowy jest łączony z sekwencją, która ma być badana np. potencjalne miejsca promotorowe, otwarte ramki odczytu. Koduje on białko, które może być wykryte bezpośrednio ( np.emisja światła), lub jego aktywność jest rozpoznawana w wyniku reakcji enzymatycznej prowadzącej do powstania łatwo wykrywalnego produktu ( np. zmiana koloru). Należy pamiętać o tym, że dany gen może zostać zastosowany w badaniach, jedynie gdy określona komórka/kolonia nie posiada genów kodujących białko homologiczne do tego użytego jako reporter. W wyniku wzrostu aktywności badanej sekwencji ( np. uaktywnienie promotora) następuje ekspresja genu reporterowego kodującego odpowiednie białko, a aktywność białka mierzy się za pomocą technik: 1. Autoradiograficznych 2. Spektrofotometrycznych 3. Chemi- i bioluminescencyjnych Im wyższa aktywność - tym większa produkcja białka a w związku tym silniejszy sygnał. Cechy dobrego genu reporterowego: 1. Produkt powinien być łatwo wykrywalny 2. Powinna istnieć metoda ilościowego oznaczenia aktywności białka kodowanego przez ten gen 3. Aktywność powinna być wykrywana in situ w czasie rzeczywistym 4. Próby wykrywania aktywności nie powinny być związane ze zniszczeniem próbki 10
Przykłady genów reporterowych: GFP Białko to może zostać użyte jako reporter, w celu badania aktywności określonych promotorów. Ze względu na bogatą paletę barw, stabilność i znikomą toksyczność jest najczęściej stosowanym genem reporterowym. β-galaktozydaza Lucyferaza Gen kodujący lucyferazę jest odpowiedzialny za bioluminescencję organizmów takich jak np: bakterii gatunku Vibrio harveyi (geny luxa i luxb), robaczka świętojańskiego Photinus pyralis ( gen Pp Luc) czy jamochłona morskiego Renilla reniformis (gen Rr Luc). Lucyferaza bakteryjna katalizuje przekształcenie FMNH 2, 0 2 i RCHO ( długołańcuchowy aldehyd; minimum 8 atomów węgla) w produkty którymi są FMN, RCOOH, H 2 O i światło o długości fali 478-505nm. Lucyferaza robaczka świętojańskiego katalizuje przekształcenie ATP, lucyferyny i O 2 w produkty: AMP, PP i, CO 2, H 2 O oksylucyferynę i światło o długości fali 562nm. Wydajność lucyferazy świetlików jest znacznie wyższa niż bakteryjna, ponadto występuje w formie monomeru co jest dodatkowym atutem skłaniającym genetyka do wyboru właśnie genu Pp Luc. Β-glukuronidaza ( GUS ) Acetylotransferaza chloramfenikolu (CAT) Acetylotransferaza chloramfenikolu kodowana jest przez gen cat jest jednym z najszerzej i najczęściej stosowanym genem reporterowym we wszelkich komórkach eukariotycznych. Enzym prokariotyczny, który katalizuje przeniesienie grup acetylowych z Acetylo-CoA na chloramfenikol w ten sposób go inaktywując. Pomiar aktywności może być przeprowadzony jako ilość inaktywowanego chloramfenikolu w odpowiednim przedziale czasowym. Zaletami tego reportera są : wysoka stabilność enzymu, wysoka czułość metody oraz co być może najważniejsze brak konkurencji ze strony enzymów endogennych. Neomycyny fosfotransferaza II (NPT II) Aktywność kodowanego enzymu w tkankach może być oznaczona metodą enzymatyczną, w której kanamycyna i ATP (ze znakowanym radioaktywnie fosforem) są używane jako substraty. Fosforylowane aminoglikozydy są wykrywane przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej. Wykorzystanie markera do wykrywania transformantów niosących zrekombinowany plazmid: Cięcie enzymem restrykcyjnym musi być wykonane w obrębie markera. Jeśli do wektora zostanie włączona wstawka, spowoduje to zniszczenie genu markerowego. W przypadku użycia jako markera genu oporności na antybiotyk bakterie posiadające zrekombinowany plazmid będą wrażliwe na antybiotyk, tak więc dla uzyskania zrekombinowanych klonów wymagane jest zastosowanie techniki replik (selekcja negatywna). Przesiewania bakterii można uniknąć stosując inny rodzaj markera β-galaktozydazę. Na wektorze znajduje się N-końcowy fragment genu lacz kodującego ten enzym (nazywany fragmentem Z lub α) wraz z sekwencją promotorową, a w genomie szczepu biorcy znajduje się część C-końcowa wraz z sekwencjami niezbędnymi dla jej ekspresji. Po wprowadzeniu plazmidu do komórki biorcy produkty białkowe obydwu fragmentów genu lacz łączą się tworząc funkcjonalny enzym. Jest to tak zwana α-komplementacja. Jeśli w obrębie fragmentu Z wstawiony zostanie odcinek DNA, w komórce nie będzie powstawał aktywny enzym. Obecność β -galaktozydazy wykrywa się w komórkach E. coli poprzez dodanie do podłoża X-gal, który po przecięciu β -galaktozydazą przyjmuje niebieskie zabarwienie. Tak więc, po 11
wysianiu stransformowanych bakterii na podłoże z X-gal niebieskie zabarwienie przyjmą kolonie powstałe z komórek zawierających pusty wektor, a kolonie niezabarwione będą posiadały plazmidy ze wstawkami. Schemat budowy wektora plazmidowego i działania markerów selekcyjnych Zagadnienia: 1. Teoria operonu na przykładzie operonu laktozowego, regulacja aktywności tego operonu 2. Fuzje genowe i operonowe: sposoby konstrukcji i zastosowanie w badaniu ekspresji genów 3. Geny reporterowe, przykłady, charakterystyka, wykorzystanie 4. Gen lacz: charakterystyka produktu tego genu, oznaczanie aktywności β-galaktozydazy; podłoża, na których można testować aktywność β-galaktozydazy Literatura: 1. Gajewski W. Genetyka ogólna i molekularna 2. Węgleński P. Genetyka molekularna 3. Kotełko K., Sedlaczek L., Lachowicz T.M. Biologia bakterii 4. Kunicki-Goldfinger W.J.H. Życie bakterii 5. Kur J. Podstawy inżynierii genetycznej: teoria, ćwiczenia, testy 6. Skrypt do ćwiczeń z biologii molekularnej, Zakład Wirusologii, Warszawa 12