RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 177614 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 303495 (22) Data zgłoszenia: 18.05.1994 (51) IntCl6: C07K1/12 C12P 21/06 Sposób hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych oraz urządzenie do hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.11.1995 BUP 24/95 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.12.1999 WUP 12/99 ( 73) Uprawniony z patentu: Instytut Chemii Przemysłowej im. Prof.lgnacego Mościckiego, Warszawa, PL (72) Twórcy wynalazku: Bożenna Baranowska, Warszawa, PL Andrzej Lipkowski, Warszawa, PL Ewa Marczak, Piastów, PL Hanna Rybak, Warszawa, PL Irmina Makulec, Milanówek, PL (74) Pełnomocnik: Królikowska Anna, Instytut Chemii Przemysłowej im.prof. Ignacego Mościckiego PL 177614 B1 (54) 1. Sposób hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych takich jak włosy, wełna, pierze, sierść, szczecina, w temperaturze i przy ph zależnych od stosowanego enzymu oraz od rodzaju surowca ewentualnie obejmujący obróbkę wstępną surowca, znamienny tym, że złoże surowca keratynowego o wysokości nie przekraczającej 3 m zrasza się roztworem enzymu proteolitycznego utrzymując ciągłą cyrkulację tego roztworu z jednoczesnym doprowadzaniem składu roztworu zraszającego do pożądanego ph i odpowiedniej temperatury aż do uzyskania wymaganego stopnia hydrolizy, ewentualnie przed procesem hydrolizy enzymatycznej prowadzi się zraszanie złoża roztworem sensybilizującym. Rys.1
Sposób hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych oraz urządzenie do hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych takich jak włosy, wełna, pierze, sierść, szczecina, w temperaturze i przy ph zależnych od stosowanego enzymu oraz od rodzaju surowca ewentualnie obejmujący obróbkę wstępną surowca, znamienny tym, że złoże surowca keratynowego o wysokości nie przekraczającej 3 m zrasza się roztworem enzymu proteolitycznego utrzymując ciągłą cyrkulację tego roztworu z jednoczesnym doprowadzaniem składu roztworu zraszającego do pożądanego ph i odpowiedniej temperatury aż do uzyskania wymaganego stopnia hydrolizy, ewentualnie przed procesem hydrolizy enzymatycznej prowadzi się zraszanie złoża roztworem sensybilizującym. 2. Urządzenie do hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych, znamienne tym, że zawiera ogrzewany zbiornik cyrkulacyjny (1), w którym umieszczone jest złoże surowca keratynowego (2) i w którego górnej części znajduje się urządzenie zraszające (3), połączony grawitacyjnie z ogrzewanym mieszalnikiem (4) wyposażonego w miernik ph (5) i mieszadło (6), oraz pompę (7) przepompowującą ciecz z mieszalnika (4), do urządzenia zraszającego (3), a stosunek objętości mieszalnika (4) do objętości zbiornika cyrkulacyjnego (1) mieści się w granicach od 1 : 3 do 1 : 15. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych, oraz urządzenie do hydrolizy enzymatycznej surowców keratynowych. Hydrolizaty keratyn różnego pochodzenia (pierze, wełna, włosy, sierść, szczecina etc.) budzą duże zainteresowanie w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym jako źródło biologicznie czynnych peptydów i mieszanin aminokwasowych. Keratyny są substancjami wyjątkowo odpornymi na trawienie enzymatyczne i do niedawna hydrolizowane je tylko chemicznie. Jednakże wskutek ekstremalnych warunków reakcji spowodowanych działaniem silnych kwasów (głównie kwasu solnego) łub alkaliów, w podwyższonych temperaturach, do 110 C, powstają toksyczne produkty uboczne, bardzo ograniczające kosmetyczne i farmaceutyczne stosowanie hydralizatów. Aby uzyskać produkty wolne od szkodliwych zanieczyszczeń należało opanować metody hydrolizy enzymatycznej. Wiadomo, że stosowane zwykle enzymy proteolityczne (pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna, papaina) nie posiadają żadnej zauważalnej aktywności w działaniu na niedegradowaną naturalną keratynę. Nawet enzymy opisane jako ewentualnie keratolityczne jak na przykład enzymy ekstrahowane z różnych organizmów uważanych za keratolityczne (pronaza, M zym, PSF 2019) mają bardzo ograniczone działanie na główne surowce keratolityczne, a wydajność trawienia włosów przy ich użyciu nie przekracza 10%. W tej sytuacji znane metody hydrolizy enzymatycznej keratyny obejmują traktowanie wstępne przez utlenianie, redukcję lub działanie rozpuszczalnikami polarnymi albo roztworami substancji z grupy elektrolitów o stężeniu przekraczającym 8 moli na litr uważane za działanie uwrażliwiające keratynę na wpływ enzymów proteolitycznych. Reakcje hydrolizy enzymatycznej zwykle prowadzone są w ogrzewanych zbiornikach lub reaktorach, w których surowiec białkowy poddawany jest działaniu roztworu enzymu o dobranym ph i odpowiedniej temperaturze. Znany jest np. z francuskiego opisu patentowego FR 2 492 282 wieloetapowy sposób postępowania obejmujący :
177 614-3 - sensybilizację surowca (włosów lub pierza) prowadzoną w zbiorniku wyposażonym w ogrzewanie przeponowe i chłodnicę zwrotną poprzez traktowanie rozpuszczalnikiem polarnym lub elektrolitem w podwyższonej temperaturze - mycie, odfiltrowanie i suszenie surowca keratynowego - trawienie enzymatyczne w kadzi zawierającej roztwór enzymu o odpowiedniej temperaturze - odfiltrowanie hydrolizatu. Proces ten posiada szereg niedogodności, a mianowicie : - wymaga operowania bardzo dużymi ilościami rozcieńczonych roztworów, gdyż dla swobodnego zanurzenia włosów lub pierza należy użyć 10-15 krotną ilość wagową cieczy, tak przy sensybilizacji, jak i przy hydrolizie, co pociąga za sobą znaczne wydatki energetyczne na dalsze traktowanie uzyskanych hydrolizatów (odparowywanie lub liofilizacja), - obejmuje uciążliwy i pracochłonny etap filtrowania i suszenia sensybilizowanego surowca, - nie daje możliwości kontrolowania przebiegu hydrolizy i podjęcia decyzji co do momentu jej zakończenia w trakcie procesu, co pogarsza odtwarzalność własności uzyskiwanego produktu, jak również ekonomikę procesu. W toku naszych prac nieoczekiwanie okazało się, że zastosowanie sposobu według wynalazku pozwala uniknąć wymienionych powyżej niekorzystnych cech procesu. W sposobie hydrolizy enzymatycznej keratyn według wynalazku surowce keratynowe takie jak pierze, wełna, włosy, sierść, szczecina, poddawane są zarówno działaniu roztworów do obróbki wstępnej, uwrażliwiającej je na trawienie enzymatyczne, jak i samej hydrolizie z użyciem roztworów enzymów proteolitycznych w układzie zamkniętym, w którym wymusza się cyrkulację tych roztworów i ciągłe zraszanie złoża surowca keratynowego o wysokości nie przekraczającej 3 m. Fakt, że surowce keratynowe nie są zanurzone w działającym w danej chwili na nie medium, lecz tylko nim zraszane, pozwala na zminimalizowanie ilości cieczy używanych w obu częściach procesu tak, że przekraczają one najwyżej trzykrotnie ilość wagową surowca keratynowego. Ponadto w sposobie według wynalazku prowadzi się ciągłą kontrolę parametrów krążącego w aparaturze medium hydrolizującego, przez cały czas regulując jego temperaturę i odczyn. Warunki procesu ustala się doświadczalnie, indywidualnie dla każdego surowca i dla każdego zastosowanego enzymu. Ciągła kontrola parametrów medium hydrolizującego w trakcie procesu zapewnia optymalne warunki hydrolizy, a zanikanie zmian ph zraszającej keratynę cieczy jest zwiastunem spadku szybkości hydrolizy i pozwala ją przerwać w momencie, gdy staje się nieopłacalna. Przedmiotem wynalazku jest również urządzenie do hydrolizy surowców keratynowych. Urządzenie według wynalazku składa się z ogrzewanego zbiornika cyrkulacyjnego, w którym umieszczone jest złoże surowca keratynowego. W górnej części zbiornika znajduje się urządzenie zraszające. Zbiornik cyrkulacyjny połączony jest grawitacyjnie z ogrzewanym mieszalnikiem wyposażonym w miernik ph i mieszadło. Ciecz z mieszalnika jest przepompowywana do urządzenia zraszającego. Stosunek objętości mieszalnika do objętości zbiornika cyrkulacyjnego mieści się w granicach od 1:3 do 1:15. Urządzenie według wynalazku przedstawiono w przykładzie wykonania na rysunku 1. Zasadniczą część urządzenia do hydrolizy keratyn według wynalazku stanowi przepo nowo ogrzewany zbiornik cyrkulacyjny (1), w którym umieszczone jest złoże surowca keratynowego (2). W górnej części zbiornika znajduje się urządzenie zraszające (3), które może stanowić system rur perforowanych lub inżektorowe mieszadło wyrzutnikowe. Przykłady urządzeń zraszających przedstawiono na rys. 2. Zbierająca się na dnie zbiornika (1) ciecz spływa do niewielkiego ogrzewanego mieszalnika (4), wyposażonego w mieszadło (6), miernik ph (5) oraz dopływ roztworu regulującego odczyn środowiska reakcji. Urządzenie obejmuje ponadto pompę (7) wraz z przewodami doprowadzającymi ciecz z mieszalnika (4) do systemu zraszającego (3). Wskutek zastosowania sposobu według wynalazku objętość mieszalnika (4) może być znacznie mniejsza od objętości zbiornika cyrkulacyjnego (1), a stosunek objętości mieszalnika (4) do zbiornika (1) może mieścić się w granicach od 1:3 do 1:15. W procesie według wynalazku umieszczone w zbiorniku (1) złoże surowca keratynowego (wełny, szczeciny, pierza etc.) traktuje się początkowo środkiem uwrażliwiającym na działanie enzymu, zraszając je tym środkiem przez okres czasu zależny od rodzaju użytego
4 177 614 surowca keratynowego, w temperaturze nie niższej niż 15 C i nie wyższej niż 110 C. Po usunięciu z układu środka sensybilizującego i przepłukaniu złoża i aparatury wodą, do obiegu wprowadza się roztwór enzymu, którego parametry doprowadza się do pożądanych wartości w mieszalniku (4). Następnie powoduje się cyrkulację tego roztworu przez złoże surowca, przez cały czas obserwując wywoływane postępem hydrolizy zmiany ph cieczy spływającej ze zbiornika (1) do mieszalnika (4) i regulując odczyn hydrolizatu. Zanikanie zmian ph cieczy w mieszalniku (4) jest zwiastunem spadku szybkości hydrolizy i pozwala przerwać ją w momencie, gdy staje się nieopłacalna. Reasumując, zastosowanie sposobu hydrolizy enzymatycznej według wynalazku oraz urządzenia do hydrolizy według wynalazku pozwala na : - zminimalizowanie ilości cieczy używanych zarówno przy sensybilizacji jak i przy hydrolizie, tak, że przekraczają one najwyżej trzykrotnie ilość wagową surowca keratynowego, co pociąga za sobą znaczne ograniczenie wydatków energetycznych na ich dalszy przerób, - pozwala na pominięcie etapu filtrowania, suszenia i przemieszczania sensybilizowanego surowca, - umożliwia łatwą kontrolę przebiegu i ustalenie końca hydrolizy. Przykład I. Przeprowadzono enzymatyczną hydrolizę świńskiej szczeciny odpadowej w zestawie aparaturowym złożonym z termostatowanej kolumny pojemności około 1000 ml i średnicy wewnętrznej 5 cm, połączonej z reaktorem pojemności 500 ml wyposażonym w mieszadło magnetyczne i ph-metr, ogrzewanym elektrycznie. Cyrkulację cieczy między reaktorem a wierzchołkiem kolumny zapewniała pompa perystaltyczna. Reaktor połączony był ze zbiornikiem ln ługu sodowego, który stanowił medium regulujące odczyn środowiska w trakcie hydrolizy. W kolumnie umieszczono 300 g szczeciny surowej, którą traktowano wstępnie przez okres 1,5 godziny 80% kwasem mrówkowym o temperaturze 95 C. Do sensybilizacji użyto 300 g kwasu mrówkowego. Kwas mrówkowy usunięto następnie z układu, a złoże szczeciny i aparaturę przemyto wodą. W reaktorze rozpuszczono 2 g handlowej Pankreatyny w 700 ml wody destylowanej, a ph tego roztworu doprowadzono do wartości 9,2 przy użyciu ln NaOHaą. Złoże szczeciny zraszano roztworem enzymu przez 28 godzin utrzymując ph roztworu w granicach 8,8-9,2 stosując okresowe dodawanie ln NaOH. Temperatura w układzie podczas hydrolizy wynosiła 45 C. W wyniku tego postępowania 58% szczeciny przeprowadzono do roztworu, a przeciętna ilość wiązań amidowych w cząsteczce uzyskanych peptydów oznaczona metodami tradycyjnymi wynosiła 4,5. Przykład II. Zastosowano zestaw aparaturowy taki sam jak w przykładzie I. W kolumnie umieszczono 280 g pierza kurzego odpadowego, mytego i suszonego, które zraszano wstępnie przez 20 godzin metanolem o temperaturze 70 C. Do sensybilizacji użyto 300 ml metanolu. Metanol usunięto następnie z układu, a złoże pierza i aparaturę przemyto wodą. W reaktorze umieszczono roztwór 1 g proteazy bakteryjnej ze Streptomyces griseus - Pronase E, otrzymanej z firmy Sigma Chem. Corp. w 700 ml wody, doprowadzony do ph 9,0 przy użyciu 1 n ługu sodowego. Złoże pierza zraszano tym roztworem przez 22 godziny w temperaturze 48,5 C utrzymując ph roztworu w granicach 9,0-9,2 przez okresowe dodawanie 1 n NaOH. W wyniku tego postępowania 48,5% substancji białkowych przeprowadzono do roztworu, przy czym w hydrolizacie odzyskano około 35% cystyny wprowadzonej do układu z pierzem. Przykład III.W reaktorze prostopadłościennym pojemności 20 1, ze spustem w dnie, wyposażonym w ogrzewanie przeponowe, umieszczono na sicie 1,4 kg mytych i suszonych włosów ludzkich otrzymanych ze zbiórki w zakładach fryzjerskich. Surowiec ten zraszano wstępnie przez 24 godziny wodą o temperaturze 95 C, wykorzystując do tego celu umieszczony nad złożem system rur perforowanych zasilany wodą krążącą w obiegu obejmującym pompę oraz ogrzewany elektrycznie zbiornik pomocniczy pojemności 4 1. W zbiorniku tym dogrzewano wodę do wyżej wymienionej temperatury. Następnie zawartość reaktora schłodzono do temperatury 45 C, po czym traktowano w identyczny sposób wodnym roztworem Pepsyny doprowadzonym do ph 2,0 przy użyciu kwasu solnego. Temperaturę i ph roztworu enzymu kontrolowano w zbiorniku pomocniczym. Reakcję prowadzono przez 40 godzin, co pozwoliło na przeprowadzenie do roztworu 28% wprowadzonego z surowcem białka.
177 614 Rys. 2
177 614 Rys.1 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 2,00 zł.