Chemia kryminalistyczna i sądowa ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA MATERIAŁÓW KRYJĄCYCH Materiały kryjące Najbardziej popularnym materiałem kryjącym jest atrament. Atramenty są mieszaninami naturalnych bądź syntetycznych barwników, czasami pigmentów, rozpuszczonymi w wodzie lub alkoholu z dodatkiem składnika nadającego konsystencje (gliceryna, guma arabska) i środka konserwującego (np. fenol, formalina). Można wyróżnić kilka podstawowych typów atramentów: atrament chiński (indyjski), atramenty kampeszowe, żelazo-garbnikowe, nigrozynowe i barwnikowe. Atramenty chińskie lub indyjskie należą do najstarszych znanych atramentów. Są to zawiesiny sproszkowanego węgla (grafitu) w roztworze wody i gumy (lub innego spoiwa) lub w roztworze szelaku (rodzaj żywicy naturalnej) i boraksu z odczynnikiem dodającym wilgotność. Są to atramenty o najtrwalszym i najintensywniejszym zabarwieniu. Atramenty kampeszowe także zaliczyć można do historycznych materiałów kryjących, obecnie bardzo rzadko spotykanych w Polsce. Podstawę składu tego atramentu stanowi wyciąg z igieł modrzejca kampechianskiego (Haematoxylon campechianum) drzewa rosnącego dziko w Ameryce Środkowej - zawierających hematoksylinę i chromian potasu. Atramenty żelazo-garbnikowe zawierają kwas garbnikowy (taninę), kwas galusowy, siarczan żelaza i często zasadowe barwniki anilinowe. Są to atramenty wnikające w papier, czasami nawet składniki reagują z włóknami papieru, dzięki czemu atramenty te charakteryzują się dużą trwałością. Nigrozyna była jednym z pierwszych syntetycznych czarnych barwników stosowanym w produkcji atramentów. Ze względu na dużą rozpuszczalność nigrozyny w wodzie oraz efekt wietrzenia zapisów sporządzonych tego typu atramentami, są one teraz bardzo rzadko wykorzystywane. Obecnie powszechnie spotykane atramenty to atramenty barwnikowe, zawierające różne mieszaniny głównie syntetycznych barwników wanadowych, wolframowych, anilinowych i innych. W składzie polskich atramentów znajdują się najczęściej barwniki triarylometanowe np. fiolet krystaliczny, błękit Wiktoria R,
rodamina B, oraz tiazynowe, np. błękit metylenowy, a także zieleń malachitowa i kompleksy metali np. żelazowo-taninowy. Fiolet krystaliczny Rodamina B Pasty długopisowe stanowią zawiesiny barwnika(ów) w cieczy o dużej lepkości. Oprócz rozpuszczalnika ulatniającego się podczas pisania, zawierają żywice naturalne lub syntetyczne, polimery odpowiedzialne za konsystencję, a także kwaśne związki, np. kwasy tłuszczowe zmniejszające współczynnik tarcia podczas pisania. Do past długopisowych dodaje się również substancji zapobiegających wysychaniu pasty, nadających jej odpowiednią lepkość i zapobiegające korozji. Barwniki, które najczęściej stosowane są w produkcji past długopisowych to Solvent Blue 38, fiolet metylowy oraz kompleksy metaloorganiczne, odporne na działanie światła, np. ftalocyjanina miedzi (II). Ftalocyjanina miedzi (II) Często w analizie chemicznej poddaje się również tusze pochodzące z pieczątek. W ich skład wchodzą barwniki, guma arabska, gliceryna, klej rybi, szelak, środki konserwujące i inne dodatki. W związku ze zwiększająca się liczbą dokumentów powstających przy użyciu komputera badaniom poddawane są także takie dokumenty, w których materiałem kryjącym jest toner. Tonery zawierają żywice (składnik wiążący), barwniki lub pigmenty oraz różnego rodzaju domieszki zwiększające masę tonera, poprawiające lub nadające pożądane właściwości, np. amorficzna krzemionkę.
Badanie dokumentów Podczas ekspertyzy dokumentów w celu ustalenia ich autentyczności, poprzez badania fizykochemiczne identyfikuje się zarówno materiał kryjący (materiał, którym wykonano dokument) jak i podłoże dokumentu. Kryminalistyczny zakres badań dokumentów opiera się na analizie porównawczej. Badania można podzielić na: fizyczne, chemiczne i fizykochemiczne. Metody fizyczne to przede wszystkim optyka, która pozwala na określenie intensywności i odcienia barwy środka kryjącego, stopnia przenikania lub przebicia atramentu. Jak również przeprowadzenie analizy fluorescencyjnej. Metody fizykochemiczne to głownie spektroskopia w podczerwieni i Ramana. W ekspertyzie dokumentów dotyczących ustalenia ich autentyczności, badania fizykochemiczne są wykorzystywane między innymi do identyfikacji zarówno podłoża dokumentu jak i materiału kryjącego (żywic, barwników lub rozpuszczalników), którym dokument sporządzono. Porównuje się widma uzyskane dla próbek z widmami substancji wzorcowych w celu określenia ich składu i ewentualnych różnic, które mogłyby wskazywać na fałszerstwo. Wśród metod chemicznych największe znaczenie ma obecnie chromatografia cienkowarstwowa i wysokosprawna chromatografia cieczowa, a ostatnio także stosuje się w tym celu metodę elektroforezy kapilarnej. Techniki te wymagają wstępnego przygotowania badanej próbki, tj. najczęściej ekstrakcji badanego materiału kryjącego z podłoża (papieru). Porównanie zestawu barwników w dwóch atramentach czy pastach można przeprowadzić stosunkowo szybko metodą chromatografii cienkowarstwowej, biorąc pod uwagę liczbę, barwę i położenie plamek otrzymanych na płytce chromatograficznej. Metoda ta wymaga niewielkiej ilości materiału do badań. Chromatografia cienkowarstwowa Chromatografia cienkowarstwowa (ang. Thin Layer Chromatography - TLC) jest odmianą chromatografii cieczowej. W chromatografii cienkowarstwowej mieszanina substancji jest rozdzielana na poszczególne składniki ze względu na różnice w szybkości ich przemieszczania się na podłożu wykonanym z aktywnego adsorbentu stanowiącego fazę nieruchomą. Poszczególne składniki mieszaniny z różną siła wiążą się z polarnym adsorbentem, a następnie wymywane są z niego rozpuszczalnikiem stanowiącym fazę ruchomą. Im bardziej polarna jest badana substancja, tym silniej wiąże się z fazą stałą i tym trudniej jest wymywana przez eluent.
W chromatografii cienkowarstwowej faza stacjonarna jest naniesiona w postaci cienkiej warstwy o grubości od 0,1 do 0,25 mm na płytkę szklaną, metalową lub z tworzywa sztucznego. Naniesiona warstwa musi być mechanicznie trwała i odporna na ścieranie. W chromatografii cienkowarstwowej, podobnie jak w kolumnowej, do rozdzielania są wykorzystywane te same mechanizmy oddziaływań międzycząsteczkowych, a więc adsorpcja, wymiana jonowa, podział, czy warunki układu faz odwróconych. Jednakże ciągle dominującą rolę (w przeciwieństwie do chromatografii kolumnowej) odgrywa adsorpcja, a najczęściej stosowanymi adsorbentami są: żel krzemionkowy (stosowany w 90 % analiz), tlenek glinu, krzemian magnezu, poliamidy i celuloza. Natomiast fazę ruchomą stanowią rozpuszczalniki organiczne lub ich mieszaniny. Chromatografowanie przeprowadza się w komorach chromatograficznych. Przebieg analizy TLC: naniesienie próbki na fazę stacjonarną, rozwinięcie chromatogramu, wizualizacja chromatogramu, oznaczenie jakościowe i ilościowe składników. W chromatografii cienkowarstwowej przy właściwie dobranym układzie chromatograficznym, po naniesieniu na płytkę pokrytą warstwą adsorbentu niewielkiej ilości rozdzielanej mieszaniny, a następnie po rozwinięciu chromatogramu w odpowiedniej komorze i jego ewentualnej wizualizacji, otrzymamy szereg plamek odpowiadających poszczególnym, rozdzielonym związkom chemicznym (rys. 1). R f 1 B A R f 2 C A Rys. 1. Schematyczny chromatogram TLC.
Podstawową wielkością, jaką wyznacza się w chromatografii cienkowarstwowej jest współczynnik opóźnienia (ang. Retardation factor Rf ). Jak to pokazano na rys. 1, współczynnik opóźnienia definiowany jest jako stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej od linii startu do środka plamki (B), do drogi przebytej przez czoło fazy ruchomej (A). Pomiaru i obliczenia Rf dokonuje się dla każdej plamki. Wartości współczynnika opóźnienia, Rf, charakteryzują zachowanie się chromatografowanej substancji w danym układzie chromatograficznym. W zależności od układu chromatograficznego wartość Rf substancji może przyjmować wartości z przedziału 0 Rf 1. Substancja bardzo silnie adsorbująca się w danym układzie osiąga wartość Rf = 0 (zostaje na linii startu). Gdy jej adsorpcja jest natomiast minimalna wędruje z czołem fazy ruchomej i wówczas jej Rf = 1. Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest uzyskanie przez studenta umiejętności: - przeprowadzania ekstrakcji typowych materiałów kryjących z papieru; - prowadzenia analizy próbek metodą chromatografii cienkowarstwowej; - interpretacji uzyskanych wyników; - różnicowania materiałów kryjących w oparciu o wyniki uzyskane metodą TLC. 1. Analiza materiałów kryjących (Dokumenty A - D) Odczynniki i sprzęt laboratoryjny: probówki eppendorfa o pojemności 1,5 ml (eppendorfki) płytki chromatograficzne komora chromatograficzna pęseta octan etylu izopropanol chloroform woda destylowana nożyczki ołówek suszarka elektryczna 1 mol/dm 3 kwas azotowy (V) mikropipeta
Procedura 1: 1.1 Pobrać próbki od prowadzącego zajęcia. 1.2 Przed przystąpieniem do analizy należy dokonać wstępnych oględzin dokumentu w świetle zwykłym padającym prostopadle i skośnie. Oględziny mają na celu stwierdzenie, czy występują różnice pomiędzy poszczególnymi fragmentami tekstu. 1.3 Przygotować próbki a) Następnie z zakreślonych wcześniej miejsc wyciąć fragmenty linii pisma o prostolinijnym przebiegu i długości ok. 2 cm. Dokument przeciąć na dwie części zgodnie z instrukcją prowadzącego. b) Próbki umieścić w probówkach eppendorfa i do każdej dodać 0,5 ml chloroformu. c) Probówki eppendorfa podpisać np. A1, A2, B1, B2, itd. d) Każdą z probówek wytrząsać przynajmniej 3 minuty. 1.4 Przygotować płytkę chromatograficzną. a) Z arkusza wyciąć płytkę o wymiarach 4,0x7,5 cm (w trakcie wycinania nie dotykać warstwy adsorbentu (biała warstwa)). b) Zaznaczyć cienko ołówkiem linię startu na wysokości 0,5 cm od dołu płytki. c) Od linii startu odmierzyć 6,5-centymetrową drogę migracji (linia końca). d) Na linii startu delikatnie, równomiernie zaznaczyć punkty (ołówkiem!), na które będzie się nanosić roztwory. e) W arkuszu sprawozdania zanotować kolejność nanoszenia roztworów, np. plamka A1 ekstrakt z materiału kryjącego 1, plamka A2 ekstrakt z materiału kryjącego 2, itd. 1.5 Zgodnie z kolejnością zanotowaną w sprawozdaniu na płytkę chromatograficzną nanieść roztwory mikropipetą. W tym celu nanieść w wyznaczonym miejscu na płytce 1,5 μl pierwszego roztworu, płytkę wysuszyć suszarką. Procedurę powtórzyć dziesięciokrotnie (nanosimy w tym samym miejscu). W ten sam sposób nanieść na płytkę roztwór drugi.
1.6 Przygotować fazę ruchomą (pod wyciągiem!), w komorze umieścić 1,5 ml octanu etylu, 1,25 ml izopropanolu, 0,5 ml wody oraz 0,05 ml 1 mol/dm 3 kwasu azotowego(v). 1.7 Płytkę ostrożnie umieścić w komorze. Komorę przykryć wieczkiem. 1.8 Płytkę wyjąć z komory gdy czoło fazy ruchomej osiągnie linię końca (płytkę pozostawić do wyschnięcia pod wyciągiem). 1.9 Obserwacje zapisać w arkuszu sprawozdania. 2.0 Ponieważ wybarwienie plamek, może blednąć z czasem, plamki na płytce obrysować ołówkiem i/lub zrobić zdjęcie smartfonem. 2. Analiza autentyczności dokumentu (Dokumenty E i F) Odczynniki i sprzęt laboratoryjny: paragony pęseta etanol skażony acetonem szalki Petriego woda destylowana lupa Procedura 2: 2.1 Od prowadzącego zajęcia pobrać paragony (E, F). 2.2 Paragony dokładnie obejrzeć w świetle dziennym pod szkłem powiększającym. Dokumenty kserowane bardzo często charakteryzują się obecnością wielu czarnych mikrokropek, które powstają podczas wykonywania odbitki ksero. 2.3 Zanotować obserwacje. 2.4 Każdą z próbek przeciąć na dwie części (E1, E2, F1, F2). 2.5 Do jednej szalki Petriego wlać 15 ml wody destylowanej, do szalki drugiej 15 ml etanolu skażonego acetonem (pod wyciągiem!). 2.6 W szalce z wodą umieścić próbki E1 i F1, w szalce z etanolem E2 i F2 (pod wyciągiem!). 2.7 Zanotować obserwacje. Zakończenie ćwiczenia 1. Fazę ruchomą pozostałą w komorze chromatograficznej, etanol znajdujący się w szalkach Petriego oraz roztwory próbek pozostałe w probówkach eppendorfa wlać do pojemnika na odpady organiczne.
2. Płytkę chromatograficzną dołączyć do sprawozdania umieszczając ją w kopercie lub koszulce na dokumenty. Opracowanie wyników 1. Porównać obrazy chromatograficzne (liczba i barwa plamek oraz wartości Rf) otrzymane w przypadku dokumentów A D. 2. Wyszukać obrazy podobne i różne. 3. Wyciągnąć wnioski odnośnie do podobieństw (lub różnic) w składzie chemicznym badanych próbek i na tej podstawie wysunąć tezę o możliwości fałszerstwa dokumentów A D. 4. Wyciągnąć wnioski odnośnie podobieństw (lub różnic) pomiędzy dokumentami E i F (paragony) i na tej podstawie wysunąć tezę o możliwości ich fałszerstwa. Wymagania: - ogólna wiedza na temat metod stosowanych do badania dokumentów i materiałów kryjących w laboratorium kryminalistycznym, - podstawy teoretyczne chromatografii planarnej (przebieg analizy, rodzaje sorbentów i faz ruchomych, sposoby wizualizacji chromatogramów, zalety, wykorzystanie TLC w badaniu autentyczności dokumentów), - rodzaje materiałów kryjących, - cechy pisma ręcznego, - etapy badań technicznych dokumentów. Literatura: 1. Instrukcja do ćwiczenia. 2. Wilk D. (red.), Kryminalistyka. Przewodnik (rozdz. VII. 9. Metody badania dokumentów i pisma ręcznego), Wydawnictwo Dom Organizatora 2013. 3. Witkiewicz Z., Kałużna-Czaplińska J., Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, Wydawnictwo WNT, Warszawa 2017.